PLoS ONE: Papildomas Stemplės Pepsino iš skrandžio Refluxate reklamuojamo tonzilių hipertrofija

Anotacija

Fonas

Gastroezofaginio refliukso yra susijęs su daugeliu patologinių sąlygų viršutiniame aerodigestive trakte. Skrandžio pepsino per refliukso prisideda prie imunologinių reakcijų tonzilės. Šiame tyrime siekėme rasti tarp pepsino ir tonzilių hipertrofijos santykius.

Metodai ir rasti

tyrinėjo sąvoką ar tonzilių hipertrofija dėl pepsino tarpininkaujant skrandžio refliukso į tonzilių hipertrofija. Penkiasdešimt keturių vaikų su tonzilių hipertrofija ir 30 suaugusieji tonzilitas buvo įdarbinti prieš chirurginį gydymą. Kraujo ir tonzilių audinių iš kiekvieno paciento buvo paruošta pokyčių analizę limfocitų ir makrofagų skaičių, kartu su histologinio ir biocheminės analizės. Pepsino buvo išreikšta įvairių lygių migdolas audinių iš kiekvienos tonzilių hipertrofija. Pepsino teigiamas ląstelės buvo rastas kriptų epitelio, aplinkinių limfoidinio folikulus su besivystančiomis fibrozė, taip pat aplinkinių limfoidinio folikulus, kad susidūrė su kripta. Ir taip pat, pepsino dažymo buvo gerai koreliuoja su pažeistu tonzilių suragėjusių epitelio ir TGF-β1 ir iAOS raiškos tonzilių skyriuje. Be to, pepsino ir TGF-β1-teigiami ląstelės buvo bendrai lokalizuota su CD68 teigiamų ląstelių kriptoje ir aplinkinių gemalinių centruose. Lyginant su makrofagų reagavimą į pepsino, periferinio kraujo vieno branduolio ląstelių (PBMNCs) buvo pastebimai didesnis ir aktyvintos pepsino buvimo vaikų grupėje. Be to, CD11c ir CD163 teigiamas ląstelės buvo žymiai padidėjo aktyvuota pepsino. Tačiau tai nebuvo matyti už PBMNCs kultūros iš suaugusiųjų grupės.

Išvados

limfocitai ir monocitai yra labai proliferacijos būklę tonzilių hipertrofija ir susijęs su padidėjusia išraiška Pro -inflammatory veiksniai kaip poveikio skrandžio refliukso pepsino rezultatas

nurodomoji dalis:. Kim JH, Jeong SS Kim KM Lee YJ, Jungas MH, parkas JJ, et al., (2016) Papildomas Stemplės Pepsino iš skrandžio Refluxate Paaukštintas tonzilių hipertrofija. PLoS ONE 11 (4): e0152336. Doi: 10,1371 /journal.pone.0152336

redaktorius: Gernot Zissel, Universitätsklinikum Freiburgas, Vokietija

Įstojo: spalio 5, 2015; Priėmė: Kovo 11, 2016 m Paskelbta: Balandžio 8, 2016

Visos teisės saugomos: © 2016 Kim et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų prieinamumas:. Visa reikalinga duomenys neviršija popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

finansavimas:. Šis tyrimas parėmė pagrindinių mokslo tyrimų programa, per Nacionalinę mokslinių tyrimų fondo Korėjos (NRF), finansuojamas mokslo ministerija, IRT, ir ateitis planavimas (2013R1A1A1012542). Šis tyrimas buvo toliau remia pirmaujančių užsienio tyrimų instituto Recruitment programa, per Nacionalinę mokslinių tyrimų fondo Korėjos (NRF), finansuojamą Švietimo, mokslo ir technologijų (Mest) ministerijos (2012K1A4A3053142)). Šis darbas buvo remiamas biomedcal tyrimų institutas fondo (GNUHBIF-2014-0009) iš Gyeongsang nacionalinio universiteto ligoninėje. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

tonzilių hipertrofija šiuo metu yra dažniausia priežastis, dėl tirtieji. Plėtra tonzilių atsiranda dėl absoliutaus padidėjimo viso limfocitų audinio ir todėl į audinių kiekio padidėjimas. [1, 2] Tikslus mechanizmas, kuriuo limfocitų skatinimas ir platinimu atsiranda dar turi būti nustatyta. Ji buvo daryti išvadą, kad jo antigeninis stimuliacija iš audinių limfocitų veda prie limfocitinės skaičius ir aktyvumo padidėjimu. Ankstesni bandymai nustatyti patofiziologinių mechanizmus sutelktas į mikrobiologinius ir imunologinių pokyčių išsiplėtusios tonziles. Daugelis tyrimų, pranešė galimą vaidmenį bakterinių organizmų į tonzilių hipertrofija patogenezėje. [3-5] Tačiau in absoliutus limfocitų kiekis per tonzilių padidėjimas be klinikinės infekcijos anksčiau buvo parodyta [2], ir atsakingas specifiniai antigenai šiuos pokyčius nebuvo nustatyta.

Neseniai atlikti tyrimai pažvelgė tarp extraesophageal refliukso liga ir viršutinių kvėpavimo takų sutrikimų santykius. Lėtinis sinusitas [6], vidurinės ausies uždegimas su eksudacija [7-9] ir gerklų ligų visi buvo tiriamas su galimais etiologinis nuorodos į extraesophageal refliukso. [10, 11] Refluxate yra skrandžio fermentų (pepsino ir HCl), taip pat duodeno-kasos fermentai (tulžies rūgščių ir tripsino). Pepsino vaidmuo skrandžio sulčių kaip dalis refluxate ir sąveikos su Otolaryngology sistemomis ir ENT organų (ausų, nosies ir gerklės) buvo plačiai tiriamas. [1, 10, 11]

Pepsino yra fermentas konvertuojamos nuo pepsinogen, kuris yra gaminamas pagrindinių ląstelių skrandžio, ir vaidina svarbų vaidmenį virškinimui. Paprastai, pepsino yra nustatyta tik skrandžio turinio. Tačiau, jei extraesophageal refliukso įvyksta, skrandžio turinys iš virinant su grįžtamu šaldytuvu gali pasiekti laryngopharynx, ir pepsino kaip dalis skrandžio refliukso gali būti aptikta laringofaringinės srityse. Tai [12] yra būtent taip, kaip Johnston ir kt., Pranešė, kad pepsinas buvo aptikta viršutinių kvėpavimo takų gleivinės ir sukelia uždegimą skatinančių citokinų ciklą, todėl uždegiminės žalos gerklų gleivinę. Šie duomenys pasiūlė vaidmenį virinamas pepsino į imuninės gynybos mechanizmo gleivinės ar epitelio pamušalus ir skatinimo uždegimo sukėlėjų gedimo. [12-15]

Taip pat už tonzilės, mes iškėlė hipotezę, kad skrandžio pepsino per refliukso turi atlikti pagrindinį vaidmenį jo imunologinės reakcijos tonzilės ir pepsino poveikis sukelia migdolas hipertrofiją. Šiame tyrime siekėme rasti tarp skrandžio pepsino ir tonzilių hipertrofijos santykius.

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimas

Šis tyrimas patvirtino Gyeongsang nacionalinio universiteto ligoninės institucinis apžvalga valdyba (# GNUHIRB-2014-02-006). Parašė Informuotas sutikimas buvo gautas iš visų pacientų (arba tėvų) prieš jų įtraukimo į tyrimą.

Studijų dalykai

Šis tyrimas buvo atliktas 84 pacientams, sergantiems klinikinės diagnozės tonzilių hipertrofija. Jie apsilankyti mūsų ligoninę dėl tonzilės pašalinti, nes jie kenčia nuo lėtinio uždegimo metu tonzilės ar knarkimas /miego apnėja dėl to, tonzilių plėtros. Visi pacientai patyrė fizinę apžiūrą patvirtinti tonzilių hipertrofija ar lėtiniu tonzilitu diagnozę. Vidutinis dydis tonzilės buvo tonzilių hipertrofija grupės 2,5 laipsnio ir 1,0 laipsnio lėtinis tonzilitas grupei. (1 lentelė). Gavome tonzilių audinių iš 54 vaikų iki jų chirurginis gydymas (41 berniukų ir 13 mergaitės; amžiaus 4-16 metų, vidutinis amžius 8 metai) ir 30 suaugusiųjų (17 vyrų ir 13 moterų; amžiaus ribos 17 ir daugiau, tai Amžius 29 metų). Pacientams, sergantiems sisteminėmis ligomis ir kitų klinikinių problemų nebuvo įtraukti į šį tyrimą. Visa tonzilių buvo atliekama taikant bendrąją anesteziją naudojant išpjaustymo būdą ir prastesnės dalis tonzilės buvo pasirinktas audinių mėginius. Nėra neturėjo komplikacija

Baltymai paruošimas ir Imunoblotingas

Audinių ištraukos tonziles buvo ruošiamas taip:. Tonzilės buvo pašalinta ir homogenizuotas į lizės buferiniame tirpale sudaro PBS (pH 7,4), 1 % Triton X-100, 1 mM EDTA, kurių sudėtyje yra 10 m leupeptiną ir 200 pM fenilmetilsulfonilfluoridą fluorido. Lizatai disperguotos ultragarso pagalba kelis kartus nuo 3 iki 5 min kiekvienas ir centrifuguojamas 12000 apsisukimų per minutę 20 min, esant 4 ° C temperatūroje. Supernatantq buvo surinkti ir baltymo koncentracija kiekvieno lizato buvo nustatomi, naudojant bicinchoninic rūgštis (BCA) baltymų reagentq rinkini (Pierce, Rokfordas IL, USA) pagal gamintojo protokolą. Jaučio serumo albuminas buvo naudojamas kaip standartą. Lygios kiekiai baltymų (50 mikrogramų) buvo pakrauti į 10% natrio laurilsulfatas (TVS) poliakrilamido gelyje. Po to, kai elektroforezės, baltymas gelio buvo perkelti ant nitroceliuliozės membranos (Schleicher & Schuell, Dassel, Vokietija). Membranos buvo užblokuotas su 5% ne-riebus pienas Tris-buferio druskų tirpalu, turinčiu 0,1% Tween-20. Dėmės buvo zonduotos su pirminių antikūnų prieš polikloniniu anti-pepsino A (SC-99081, Santa Cruz biotechnologijos CA, USA), esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Kaip pakrovimo kontrolę, dėmės buvo pakartotinai tyrinėjo su anti-β-aktino antikūnų (Sigma, St Louis MO, JAV). Pagrindinis antikūnų buvo ryškinamos naudojant antrinių antikūnų (krienų peroksidazės konjuguoto ožkos anti-triušio IgG, 1: 10.000; Pierce) su ECL komplektas (Amersham Pharmacia Biotech, Piskatavėjus NJ, JAV)

imunohistocheminis
.

imunodažymu buvo atliktas 5 mm storio vainikiniame skyriuose paraformaldehidus fiksuotas ir parafino įterptųjų skyriuose naudojant avidino-biotinilinta-krienų peroksidazės komplekso rinkiniai (ABC; Vector Laboratories, Burlingame CA, JAV). Po deparaffinization į ksileno, skyriai buvo rehidrataciją etanolio. Išplovus PBS, sekcijos buvo blokuotos 1% normalus ožkos serumą ir tada gydomi anti-pepsino A (SC-99.081, Santa Cruz), iAOS, TGF-β1 ir CD68 antikūnai perkamos iš Santa Cruz Biotechnology yra 4 ° C temperatūroje per naktį drėgmėje, kameroje. Po plovimo PBS, jie buvo inkubuojami 90 min kambario temperatūroje su antriniu antikūnu (Santa Cruz biotechnologijos, biotinas-konjuguoto anti-triušio imunoglobulino G, 1: 200). Pagaliau, dalys buvo inkubuotos su ABC 60 min kambario temperatūroje, nuplauti PBS, ir po to jos pritaikomos su 0,027% 3,3'-diaminobenzidinas tetrahidrochlorido (Sigma), su 0,003% vandenilio peroksido. Skyriai buvo counterstained hematoksilinu (Sigma).

Dvivietis imunofluorescenciniam

Jei apibūdinti pepsino A teigiamų ląstelių, dukart imunofluorescencinio buvo atliktas tonzilių audinių. Deparaffinization ir antigeno paieška buvo atlikta. Nespecifinis antikūnas rišasi buvo užblokuotas PBS su 0,1% normalaus asilas serumas (Vector Laboratories) ir 0,3% Triton X-100 ( "Sigma) 45 min. tada dalys buvo inkubuotos su anti-pepsino Antikūnas (1: 100; SC-99081, Santa Cruz), praskiestas PBS su 0,1% galvijų serumo albumino (sigma), esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Praplovus, asilas Cy3-konjuguoto anti-triušio IgG antrinis antikūnas (1: 100; EMD Millipore ", Billerica MA, JAV) buvo taikoma 1 valandą kambario temperatūroje. Dvigubo ženklinimo, po blokavimo PBS, kurių sudėtyje yra 10% normalaus ožkų serumo ir 0,3% Triton X-100, dalys buvo inkubuotos su anti-CD68 (1: 100; Santa Cruz), esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Alexa488-konjuguoto anti-pelės IgG antrinis antikūnas (1: 100; Invitrogen, Karlsbadas CA, USA) buvo taikomas 1 valandą kambario temperatūroje. Skyriai buvo montuojamos, kurių sudėtyje yra anti-išblukimo 4 sprendimas ", 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (Vector Laboratories) ir stebima fluorescencija mikroskopu (" Carl Zeiss mikroskopija GmbH, Jena, Vokietija). Apibūdinti CD68 teigiamas ląsteles, dukart imunofluorescencinio buvo atliktas, kaip aprašyta aukščiau. Dvigubo ženklinimo, anti-TGF-β1 (1: 100; "Santa Cruz) ir anti-iAOS (1: 100; Santa Krusas) buvo taikomos ir tada asilas Cy3-konjuguoto anti-triušio IgG vidurinė antikūnas (1: 100; EMD Millipore ) ant CD68 tamsintas skyriuose.

atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininė reakcija (PGR)

viso RNR buvo išskirta iš migdolas audinių, naudojant TRIzol metodą pagal protokolą yra rekomendavęs gamintojas ( GIBCO, Grand Island, NY). Lygiomis dalimis (5 UG) visų DNR be RNR iš kiekvieno mėginio buvo perskaičiuotos kDNR naudojant 200 U viršuje II RT (GIBCO, Grand Island, NY) per 20 iL reakcijos tūrio. Atvirkštinės transkripcijos buvo atlikta 22 ° C temperatūroje 10 min, esant 42 ° C temperatūroje 45 min, ir, esant 95 ° C temperatūroje 5 min. Reakcijos produktus (2,0 pl) buvo atliktas PGR amplifikacijos (Promega, Madison, WI, JAV) per 50 iL reakcijos tūrio. Kiekvienas pradmenų sekas buvo taip: IL-1β (189 bp), 5'-TCATTGCTCAAGTGTCTGAAGC-3 '(pojūtis) ir 5'-TGGTCGGAGATTCGTAGC-3' (Priešprasminis); IL-6 (628 bp), 5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3 '(pojūtis) ir 5'-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3' (Priešprasminis); TNF-β (443 bp), 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 '(pojūtis) ir 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3' (Priešprasminis). PGR buvo atliekama naudojant BIORAD termocikleriu pagal gamintojo pateiktų instrukcijų. Lygios apimtys amplifikacijos produktai buvo analizuojami 1,5% agarozės gelyje su 0,5 mg /ml etidžio bromido dažymo.

tėkmės citometrijos analizė ir in vitro
auginimas

Visi kraujo mėginiai buvo tvarkomi per 2 valandas po to, kai kraujas. Periferinio kraujo vienbranduolių ląstelių (PBMNCs) buvo išskirtas tankis gradiento centrifuguojant per Ficoll gradiento (Sigma, St. Louis MO, JAV) 25 min 2300 apsisukimų per minutę ir tris kartus buvo plaunamos PBS. PBMNCs AT 1 × 10 ^{5 ląstelės buvo analizuojami tėkmės citometrijos. Nesvarbu, pepsino dalyvauja monocitų į makrofagų diferenciacijos, likusios ląstelės buvo padengtas Kultūros patiekalų buvimas /ar nebuvimą aktyvintos pepsino (Thermo Scientific, Rokfordas IL, JAV), kuriuose yra monocitų kultūros sąlygas. Norėdami nustatyti makrofagų gyventojų lygį, po 8 ir 15 dienomis, ląstelės buvo nukirsta ir tiriami tėkmės citometrijos naudojant antikūnus dėl CD11c ir CD163. Visi ląstelių kultūros buvo palaikoma 37 ° C temperatūroje su 5% CO _{2 drėgmėje, atmosferą.}}

Ląstelių gyvybingumas

RAW264.7 ląstelės, pelės makrofagų-kaip ląstelių linija, buvo auginamos ištirti pepsino poveikį makrofagų dauginimąsi. Ląstelės buvo gydomi įvairių koncentracijos pepsino (0,01-5 g /ml) ir ląstelių gyvybingumas buvo tiriama pagal CCK-8 rinkinio (Cell skaičiavimas Kit-8, Dojindo Molekulinė Tech. Inc, Rokvilis, MD, JAV). Mobilusis gyvybingumas kiekvienai koncentracijai buvo atstovavo kartų kaita. Sulenktas pokyčiai yra apskaičiuojami kaip galutinio vertės kiekvienų pepsino, buvimą į nesant pepsino vertės santykiui (nustatyti kaip "1"). Vertybės yra atstovaujama kaip vidurkis ± SEM. * P
< 0,05 vs atitinkamos nesant pepsino (0 mikrogramai /ml).

in vitro
migracijos tyrimas

standartas monosluoksniui įbrėžimams žaizda modelis buvo naudojamas apibūdinti reakciją makrofagai, kad pepsinas. RAW264.7 ląstelės buvo pasėjamos į 6-duobučių audinių kultūros plokščių, išaugintų iki susiliejimo, ir monosluoksnius buvo žaizdos braižymo išilgai audinių kultūros plastiko su skutimosi peiliuku paviršiaus. Ašmenys buvo nuspaustas į indo vidurį, tokiu būdu mažinant ląstelių sluoksnį ir kartu ženklinimas "žaizdų ribą" ant pagrindinės plastiko. Tada ašmenys švelniai slydo viena kryptimi pašalinti pusę susiliejantis ląstelių sluoksniu. "Žaizdos monosluoksnio" du kartus buvo plaunamas su fosfatas-buferiniame valgomosios druskos tirpale pH 7,4 (PBS), iš naujo-fed su 1 mM mitomicino, kurių sudėtyje yra serumo netenka terpėje, ir inkubuojami esant standartinėms kultūros sąlygų 24 val.

Statistiniai analizė

Visi duomenys yra pateikiami kaip vidurkis ± SEM Palyginimai tarp grupių buvo analizuojami du-tailed , T
testą. Tikimybių vertės ( P
) < 0,05 buvo laikomas reikšmingu.

Rezultatai

Pepsino buvo išreikštas tonzilių

immunoblot duomenys parodė, kad pepsinas baltymas buvo išreikštas vienu juostoje ekstraktų tiek pacientų tonzilės su tonzilių hipertrofija. Pepsino buvo labai išreikštas keliais juostų į teigiamos kontrolės skrandžio audinių ekstraktų. Praktiškai nėra pepsino dažymo buvo pastebėtas kitų audinių, įskaitant naviko, limfmazgiuose (LN), skydliaukės (Tavo), seilių liauka (paausinėje g.), Seilių liauka (GS) (pav 1A). Visi migdolas audinių eksponuojama teigiamas signalas pepsino (pav 1B). Tačiau, aptikimo lygiai pepsinu tonzilių šiek tiek skyrėsi kiekvieno paciento (pav 1B). Imunohistocheminį dažymo buvo atliktas siekiant nustatyti pepsino-teigiamas ląsteles tonzilių audinio. Pepsino teigiamas ląstelės selektyviai rasti žemiau paviršiaus epitelio, daugiausia įsikūrę kriptos (pav 1C-a ir b), aplinkinių daugiau neigiamų Germinal centrus (pav 1C-C ir D), o taip pat aplinkinių limfoidinio folikulus su pernelyg kuriant fibrozę (pav 1C-e ir f). Skrandžio, naudojamo kaip teigiama kontrolė parodė, tipišką modelį pepsino dažymo, daugiausia Liaukiniame ląstelių (pav 2D-a), bet ne limfinio mazgo (pav 1D-b) ir skydliaukės (pav 1D-c).

Apie pepsino teigiamas ląstelės buvo aptikta sugadinta tonzilių suragėjusių epitelio

Norėdami patvirtinti ryšį su tonzilių suragėjusių epitelio pažeidimų ir refliuksas, bandėme rasti pepsino teigiamas ląsteles nukentėjusiajai ar nepažeistos tonzilių epitelio architektūra. Sugadintas suragėjusių epitelio, nereguliarus arba skaldytos, buvo rasta migdolas audinių, tonzilių hipertrofija (Pav 2A ir 2D, žemiau). Pepsino-teigiamomis ląstelėmis, buvo aptikta pažeistus vietų (dešinėje įterpti Fig 2A, 2d, 2E ir 2F) palyginti su sveikų epitelio (kairėje intarpo pav 2A ir 2B). Visų pirma, signalai buvo stipriai rasti aplink plyšiuose ir pažeistų tonzilių suragėjusių epitelio (punktyrinės linijos pav 2C bei 2e).

TGF-β1 ir iAOS teigiami ląstelės buvo aptikta sergančių pacientų tonzilės su tonzilių hipertrofija

imunohistocheminis dažymas TGF-β1 ir iAOS buvo atliktas siekiant ištirti ryšį tarp pepsino dažymo ir uždegimas santykius. Abu TGF-β1 ir iAOS teigiami signalai taip pat buvo aptikta regionuose, panašių į pepsino dažymo, pavyzdžiui, kriptų epitelio (pav 3A ir 3B), aplinkinių germinaciniame centrus (pav 3c ir 3d), ir aplinkinių limfoidinio folikulus su pernelyg plėtoti fibrozė (pav 3e ir 3f).

pepsinas ir TGF-β1 buvo aptikta CD68 teigiamų ląstelių tonzilių hipertrofija audinio

Kaip aprašyta Įvadas, mes iškėlė hipotezę, kad pepsino dažymo į tonzilių kilęs iš skrandžio ir gali būti susijęs su tonzilių uždegimas. Dvivietis imunofluorescenciniam už CD68 buvo atliktas apibūdinti pepsino teigiamas ląsteles. CD68 yra 110-Kd transmembraninis glikoproteinas ir atstovas žymeklis žmogaus monocitų ir audinių makrofagai, dalyvaujančių uždegimo. CD68 teigiamų ląstelių buvo aiškiai pastebima tonzilės su tonzilių hipertrofija (4 pav). Pažymėtina, CD68 teigiamų ląstelių stipriai colocalized su pepsino ir TGF-β1-teigiamų ląstelių tiek kriptoje (pav 4A) ir aplinkinių genetinės centrai (pav 4b). Skirtingai colocalization pepsino ir CD68, pepsino nebendradarbiavo lokalizuoti su B limfocitų (CD20 teigiamų) folikuliniame centrų ir T-limfocitų (CD45) į interfollicular regionuose (pav 4c). Šie duomenys, kurie taip pat, kad parodyta Fig 3 pasiūlė, kad pepsinas dažymo gali būti susijęs su uždegimo reakcijas gydant pacientus su tonzilių hipertrofija tonzilės. Ir taip pat, atskleisti didžiąją mechanizmą tonzilių žalos uždegimo mediatorių tarpininkaujant baltųjų kraujo kūnelių, įskaitant PBMNCs ir makrofagų, lygių tonzilių IL-6, IL-1β ir TNF-α iRNR išnagrinėjo RT-PCR (pav 4d). Įdomu tai, kad visi jie buvo išreikšta migdolas audinių, tonzilių hipertrofija. Šie duomenys rodo, kad didžioji mechanizmas tonzilių hipertrofija gali būti sukeltas uždegimo mediatorių.

Pepsino vairavo pacientų išskirtų monocitų diferencijuoti į makrofagai

Norėdami patvirtinti pepsino dažymo ir makrofagų santykį, mes auginamos periferinio kraujo mononuklearų ląsteles (PBMNCs) nuo tonzilių hipertrofinė pacientams makrofagų mitybine terpe (į buvimą ar nebuvimą aktyvintos pepsino) 15 dienų. Be to, mes nustatomas lygius monocitų populiacijos, ir analizuojami makrofagų fenotipą, taikant tėkmės citometrijos metodą. Žmogaus makrofagai, pagamintas būdu pagal monocitų audiniuose diferenciaciją. Jie vaidina svarbų vaidmenį ne konkretaus gynybos (įgimtas imunitetas), o taip pat padėti inicijuoti konkrečius gynybos mechanizmus (prisitaikanti atsparumas) įdarbinant kitus imunines ląsteles, pavyzdžiui, limfocitų. Jie gali būti identifikuojamas naudojant tėkmės citometrijos jų konkretizacija baltymų kaip CD žymenų, įskaitant CD11c ir CD163. Monocitų išvesti iš srauto pusėje ir pirmyn sklaida (pav 5a) gyventojai buvo gerokai padidėjo dalyvaujant aktyvintos pepsino (aPepsin), palyginti su jokiu padidėjimas 8 dieną, o ne gerokai padidinti nuo dienos 15 (pav 5b). Be to, mes ištirti monocitų į makrofagų diferenciacijos naudojant CD11c ir CD163 antikūnus. Į CD11c ir CD163 teigiami ląstelės buvo žymiai padidėjo aPepsin 8 dieną po auginimui. Ne reikšmė buvo nustatyta, kitomis sąlygomis, (pav 5c). Tačiau monocitų gyventojų nebuvo reikšmingas, taip pat lygiai CD11c ir CD163 suaugusiųjų grupėje ir 8 ir 15 dieną rodo Šie duomenys, kad pepsinas yra potencialiai dalyvauja makrofagų diferenciacijos ir vaikai, kuriems padidėjęs skrandžio refliukso gali būti daugiau veikiami poveikio A pepsino aplinka nei suaugusiems.

pepsino sukeltas makrofagų gyvybingumas ir migracijos

taip pat tiriama, ar pepsino dalyvavo makrofagų funkcija. RAW264.7 ląstelės buvo kultivuojamos buvimo ar nebuvimo aktyvintos pepsino 24 valandas. Ten buvo reikšmingas priklauso nuo dozės padidėjimas RAW264.7 ląstelių gyvybingumo pagal pepsino (pav 6A). Migracija RAW264.7 ląstelių, taip pat buvo sukelta pepsino tiek įbrėžimams žaizdos ir transwell migracijos sistemos tyrimai (pav 6b ir 6c).

Diskusijos

Šis tyrimas pirmą kartą parodė, kad pepsinas buvo aptikta hipertrofinė tonzilių ir pepsino-teigiamomis ląstelėmis, buvo lokalizuotas kriptų epitelio aplink embrionų centras, ir į limfoidinio folikulus su pernelyg besivystančių fibrozinio išvaizdą. Pažymėtina, kad pepsinas dažymo koreliavo su išraiškos uždegimo susijusių veiksnių, ir pepsino ir CD68 colocalized ir aktyvuota pepsino lėmė diferenciacijos monocitų į makrofagus. [16] Šie duomenys rodo, kad potencialiai naujų patofiziologinių mechanizmus, sukeliančius tonzilių hipertrofija.

Intensyvus uždegimas yra žinomas rizikos veiksnys tonzilių hipertrofija. [17] TGF-β1 ir iAOS yra žinomi uždegimo mediatorių. [18-20] Be hipertrofinė tonzilės, T ir B ląstelių skaičius padidėjo parodė teigiamą koreliaciją su bakterijų skaičius ir tonzilių dydis. [21, 22] epidemiologiniais tyrimais, rūkymas, alergijos ir pasikartojančiomis kvėpavimo takų infekcijos gali siejame su laikinu ar nuolatiniu hipertrofija limfoidinio audinio. [22, 23] imunologiniai parametrai, genetinis polinkis ir vietos limfocitų disfunkcija atsiranda žaisti vaidmuo pasikartojantis tonzilitas ir tonzilių hipertrofijos etiologijos. [22, 24] Kai kurie tyrimai parodė, kad tonzilių hipertrofija buvo susijęs su padidėjusia limfoidinio dydžio folikulų, bet ne folikulų [25] skaičių, o taip pat buvo susijęs su padidėjusio tonzilių svorio, padidėjo folikulus diametras, plotas ir skaičius [26].

Pasikartojančios dirgiklius patogeninių agentų, uždegiminio proceso metu, sukelti aktyvavimo monocitų ir makrofagų. [27] išskiriami makrofagų citokinai stimuliuoja imunines ląsteles, ir taip pat gali sukelti proliferacija endotelio ląstelių ir fibroblastų. [28] su laiku, imunologinis aktyvus audinys pakeičiamas fibrozinio audinio. [28] šiame tyrime mes prielaidą, kad antigenas buvo pepsino ir mes pateikti dvi hipotezes paaiškinti tonzilių hipertrofija stebėjimas su skrandžio refliukso (7 pav). Vienas mechanizmas gali būti tiesioginis stimuliavimas, kurią pepsino iš refluxate limfocitų, kurios atpažįstamos kaip ANTIGENINIŲ. Kitas galimas mechanizmas apima pepsino sukelta žala į tonzilių kriptų epitelio, dėl kurio susidaro cryptitis nuo bakterijų, gyvenantiems su vykstančiais antigeno stimuliacija specializuoto kriptų epitelio. Tai privestų prie limfocitų skaičiaus padidėjimas ir gali vaidinti svarbų vaidmenį tonzilių hipertrofija.

Iš pradžių pepsino ateina į kontaktą su epitelio ir pristatė intraepitelinei limfocitų, poepitelinį limfocitai, interfollicular ir intrafollicular limfocitai , šia tvarka. Limfocitai tada daugintis reaguojant į pepsino veikia kaip antigeno, todėl, kad tonzilių folikulai padidinti ir tonzilių audinių atlikti hipertrofiją. Arba tonzilių audinių makrofagai pripažinti refliukso sukelta pepsinas jų ląstelių paviršiuje, kaip svetimkūnio ir yra aktyvuota. Makrofagų aktyvinimas sukelia sekreciją PRO-uždegiminių citokinų, ir šie citokinai sukelti uždegimą, taip pat papildomą limfocitų aktyvaciją, kad rezultatas tonzilių hipertrofija. Pastaroji hipotezė, atrodo, turi daugiau paramos nei buvęs kadangi, kaip parodyta Fig 4, pepsino ir CD68-teigiamomis ląstelėmis, buvo colocalized žemiau paviršiaus epitelio, esančio kriptoje (pav 4A) ir taip pat aplink limfinio folikulus su pernelyg kylančių fibrozės (Pav 4B). Tačiau mažai koreliacija su pepsino ir CD20 ir CD45, nes žymenų B ir T ląstelių atitinkamai buvo stebimas tonzilių audinio (pav 4c).

Mes taip pat įvertino CD163 išraišką nuo PBMNCs kultūrą tonzilių hipertrofija , CD163 yra išreikšti tik subrendusių makrofagų, bet nėra ant monocitų. Mes išauginti PBMNCs 8 ir 15 dienomis, 10% FCS ir 10 ng /ml M-CSF akivaizdoje po standartines sąlygas žmogaus makrofagų kultūrą. Rezultatai in vitro
PBMNCs kultūros tyrimai parodė, kad vaikų grupės, CD163 teigiamų ląstelių skaičius buvo žymiai didesnis, dalyvaujant aktyvintos pepsino taip pat CD11c teigiamas ląsteles. Palyginimui, nebuvo skirtumo CD11c ir CD163 išraiška nuo PBMNCs kultūros nuo suaugusiųjų (S1 pav). Šie duomenys rodo, kad PBMNC reakcija į aktyvintą pepsino vaikams gali būti jautresni nei suaugusiųjų. Nors mes negalime paaiškinti, pepsino sukeltos mechanizmas dalyvauja makrofagų diferenciacijos, mes negalime atmesti galimybės, kad pati makrofagų diferenciacija gali paspartinti refliukso sukelta migdolas žalą.

Pagal dabartinį tyrimą, pepsino tarpininkaujant refliukso sukelti ne tik tiesioginė žala į tonzilių epitelio, bet ir skatino tonzilių makrofagus ar tonzilių epitelio ląsteles išskirti chemokinus /citokinus, kad traukia ir aktyvuojant imuninės sistemos ląsteles, tarpininkaujant kai į tonzilių gleivinė žalą. Mikroskopinis uždegimas, kuriam būdingas TGF-β1 ir iAOS reikšti savo mintis tonzilių audinio (kriptų epitelio, aplinkinių germinaciniame centrą ir limfoidinio folikulus su pernelyg plėtoti Fibrozinės išvaizdą), stebimas pacientams, turintiems sunkių simptomų (duomenys neparodyti). Tai reiškia, kad pepsinas (ir rūgštis) indukuotų gamyba IL-8 ir kitų uždegimo mediatorių pagal refluxate skatinti migracijos ir aktyvacijos periferinio kraujo leukocitų. [14] Šie duomenys patvirtina hipotezę, kad citokinų tarpininkaujant mechanizmas yra atsakingas už tonzilių žalos vaikams, sergantiems tonzilių hipertrofija. Pacientų gleivinė su tonzilių hipertrofija gamina žymiai daug įvairių citokinų. [29, 30] Šie uždegimo mediatorių aktyvuoti imuninių ląstelių įdarbinimą ir migracija į refluxate sąveikos svetaines ir gali būti įtraukti į tonzilių hipertrofija patofiziologija.

remiantis išvadomis iš literatūros, ir mūsų rezultatai šiame tyrime, mes siūlome, kad vietinis ir sisteminis aktyvavimo uždegimo būdus skatins limfocitų infiltracija ir proliferaciją (įskaitant T ląstelių), kartu su makrofagų diferenciacija ir platinimu todėl tonzilių hipertrofija iš padidėjo monocitinę ir limfocitinės ląstelių skaičių. Jei dabartiniai faktai įrodyti būti tikslūs, jie gali teikti perspektyvią tikslą plėtoti intervencinės metodų gydymo ar prevencijos tonzilių hipertrofija vaikams. Nepaisant didelių įrodymų uždegimo mediatorių ir limfocitų proliferacijos į tonzilių hipertrofija patogenezės, tarp jautrumas pepsino refliukso ir tonzilių uždegimas sąveika lieka neaišku, šiame tyrime. Tolesni tyrimai yra tikslingas siekiant geriau suprasti signalo perdavimo kelių dalyvaujančių refliukso simptomų genezės ir uždegimą, ir nustatyti kartu su kurti naujus gydymo metodus.

Išvados

nustatyta, kad limfocitai ir monocitai yra labai proliferacijos narė tonzilių su tonzilių hipertrofija ir susijęs su padidėjusia išraiškos pro-uždegiminių veiksnių kaip poveikio skrandžio refliukso pepsino rezultatas. Šie rezultatai rodo, kad potencialiai naujų patofiziologinių mechanizmų, tonzilių hipertrofija. Nuo mūsų vitro
duomenimis, mes sukurti, kad gali būti objektyviai charakterizuoti mechanizmų, dalyvaujančių siekiant parengti konkrečius gydymo nuo šios ligos nuoroda galimybė. Mūsų duomenys rodo, kad mechanizmus, sukeliančius limfoidinio audinio proliferaciją in tonzilių hipertrofija skiriasi ir gali leisti ateityje ne chirurginiai gydymo priemones nukreipti pepsinas, kad gali išvengti, kad reikalinga tirtieji poreikį ir todėl involiucijos hipertrofinė tonziles.

Parama Informacija
S1 paveiksle. Tėkmės citometrijos analizę monocitų gyventojų ir monocitų diferenciacijos nuo PBMNCs suaugusiems, sergantiems lėtine tonzilitas.
Limfocitų ir monocitų buvo tapatinamas su pusės ir pirmyn sklaida. Limfocitų ir monocitų taip pat buvo patvirtinta, nudažant CD4 ir CD8 ir CD14 antikūnai. PBMNCs buvo auginamas makrofagų konkrečių kultūros sąlygomis su arba be aktyvuotos pepsino 15 dienų. Monocitai gyventojai buvo identifikuoti iš vienos pusės ir išankstinio išsklaidyti profilių tėkmės citometrijos kiekvienoje būklės. Kiekvienas lygis buvo palyginti su 8 diena ląstelių vertės nėra pepsino, kad buvo suteikta savavališkai vertę "1". Monocitų į makrofagų diferenciacijos buvo nagrinėjama nudažant CD11c ir CD163 antikūnų
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0152336.s001
(TIF)

• PLoS ONE: Geometrinis maišymas, peristaltiką ir geometrinių etapas Stomach
• PLoS ONE: Žarnyno kamieninių ląstelių Žymekliai žarnyno Metaplasia skrandžio ir Bareto stemplės