Influência de polimorfismos IL17A na metilação aberrante de DAPK e CDH1 na mucosa gástrica não-canceroso

Influência da IL17A
polimorfismos sobre a metilação aberrante de DAPK Comprar e CDH1
na mucosa gástrica não-cancerosas da arte abstracta
Fundo
CpG ilha metilação aberrante é mostrado para ser um mecanismo importante na silenciamento do gene. O papel importante da IL-17 na resposta inflamatória ao H. pylori
colonização foi indicado. Nós investigamos a influência de IL17A
polimorfismos, -197 G > A (rs2275913) e * 1249 C > T (rs3748067), na metilação de DAPK
e CDH1
.
Métodos
amostras da mucosa gástrica foram obtidos a partir de 401 indivíduos sem doenças malignas. estado de metilação do gene foi determinada por MSP. A genotipagem de IL17A
foi realizada por PCR-SSCP.

Resultados methylations de DAPK Comprar e CDH1
foram observados em 196 e 149 de todos os 401 indivíduos, respectivamente. Em geral, * 1249 transportador T foi associada a uma diminuição do risco para DAPK
metilação, enquanto -197 G > A não foi. Nos sujeitos com idade superior a 60 anos de idade, * 1249 transportador T foi mais fortemente associado com a metilação do gene e -197 Um transportador tende a estar associada com um risco aumentado para CDH1
metilação. Ao avaliar pela inflamação promover haplótipo (-197 transportadora mutante com * 1249 homozigoto), este haplótipo tinham um risco mais fortemente aumentado tanto para DAPK Comprar e CDH1
methylations em indivíduos comparativamente mais velhos. Ambas as pontuações atrofia e metaplasia aumentaram significativamente com a idade em -197 Um transportador ou * 1249 CC homozigoto, ao passo que não estavam em -197 GG homozigoto ou * 1249 transportadora T. PG relação I /II foi mais significativamente diminuída em -197 Um portador do que em homozigoto GG sob a influência da infecção por H. pylori
.
Conclusões Online em -197 A transportadora alelo com * 1249 CC homozigotos, os methylations de ambos DAPK Comprar e CDH1
pode ser aumentada gradualmente, mas mais rapidamente do que os outros genótipos, com a idade e a estrutura da mucosa gástrica alterada induzida por H. pylori
infecção.
Palavras-chave
IL17A
aberrante DAPK de metilação do DNA
CDH1
Fundo
interleucina-17 (IL-17) é uma citocina relativamente recém-descrita que preenche a adaptativa e sistemas imunológicos inatos. IL-17A é uma citocina responsável pela actividade patogénica das células Th17 [1], uma linhagem distinta de células efectoras CD4 + [2]. IL-17A induz vários mediadores pró-inflamatórios, incluindo citocinas, quimiocinas, e as metaloproteinases, a partir de células epiteliais e de fibroblastos [3]. Uma expressão aumentada de IL-17 foi também documentada e implicada na patogénese de doenças imuno-mediadas, tais como artrite reumatóide, esclerose múltipla, psoríase e [4]. Além disso, a IL-17 tem a capacidade de estimular a produção de IL-8 em células epiteliais e macrófagos [5, 6], levantando a possibilidade de que esta citocina possa desempenhar um papel importante no recrutamento de células inflamatórias durante infecções bacterianas. Em primeiro lugar, Lussa et ai. relataram que a produção de IL-17A bio-activo foi aumentada durante a Helicobacter pylori
(H. pylori
) infecção, o que sugere a possibilidade de que esta citocina possa desempenhar um papel importante na H. pylori
resposta inflamatória induzida [7]. Posteriormente, vários estudos mostraram que a IL-17 estimula a libertação de IL-8 por células epiteliais gástricas e facilita a quimiotaxia de neutrófilos através de um mecanismo dependente de 8-il, e contribui para o reforço de IL-8 níveis em H. pylori
mucosa gástrica -colonized [8-10].
por outro lado, o câncer gástrico é um dos cancros mais comuns em todo o mundo [11, 12], mas a etiologia deste tumor permanece obscuro. A infecção por H. pylori
agora é aceite como um evento crucial no desenvolvimento da doença de úlcera péptica e gastrite atrófica, e que está implicada no desenvolvimento de carcinoma gástrico, especialmente não localizado na cárdia [13-15]. Vários cancros, incluindo tumores gástricos, mostra methylations de vários genes, incluindo gene da caderina-E (CDH1
),
gene da proteína quinase associada à morte (DAPK
) e CDKN2A
[16, 17]. Alguns genes também são metilados em tecidos não-neoplásicas com o envelhecimento, e esta alteração é conhecido como relacionado com a idade metilação [18, 19]. Além disso, também demonstrou que a metilação do gene podem estar presentes na inflamação crónica de vários tecidos [20, 21]. Na mucosa gástrica, foi indicado que a metilação da ilha de CpG foi induzida pela infecção por H. pylori na mucosa
não-cancerosas [22, 23] e considerados como as condições pré-cancerosas na carcinogénese gástrica [24]. Entre vários genes, DAPK
e CDH1
, bem como CDKN2A
, são frequentemente metilado na mucosa gástrica, não neoplásico em relação à idade, infecção por H. pylori
, grau histológico de gastrite, e carcinogênese gástrica [22, 25, 26]
recentemente, nós relataram que o gene IL-17A (IL17A
) polimorfismo (rs2275913 G > a). e gene F IL-17 (IL17F
) polimorfismo (rs763780 T > C) estão intimamente associados com a susceptibilidade a carcinogénese gástrica [27], bem como a colite ulcerativa [28]. Depois disso, vários estudos revelaram a associação entre IL17A
rs2275913 G > A e artrite reumatóide, carcinogênese gástrica e asma [29-31]. O rs2275913 (G /A), localizado numa posição -197 a partir do codão de partida de IL17A
, pode regular a expressão de ARNm. Além disso, há um polimorfismo rs3748067 (* 1249 C > T) em IL17A
3'-UTR, segmentadas por alguns microARNs. . Nossa hipótese é que estes IL17A
polimorfismos do gene pode influenciar o desenvolvimento de mathylation DNA aberrante da mucosa gástrica
No presente estudo, foi investigada a associação entre os polimorfismos de IL17A
, rs2275913 (-197 G > A ) e rs3748067 (* 1249 C >. T), ea metilação do DNA aberrante de DAPK Comprar e CDH1
no epitélio gástrico não-cancerosas
Métodos
amostras clínicas
a população estudada foi composta por 401 indivíduos sem doenças malignas gástricas recrutamento do Centro de Endoscopia do Hospital Universitário de Saúde Fujita ou Hospital Universitário Kanazawa Medical. Em HapMap-JPT, a frequência de IL17A -
197 A freqüência do alelo foi de 45,3%. Assumimos que uma diminuição de 20% na prevalência de um freqüências alélicas seria relevância clínica (grupo não metilado: 40% vs. grupo metilado: 50%). Assumindo um valor alfa = 0,05 e uma potência = 0,80, pelo menos 200 indivíduos não metiladas e 200 indivíduos metilados seria suficiente para identificar uma diferença clínica relevante. Por conseguinte, a 400 indivíduos seria relevância clínica para o estudo. Todos os indivíduos foram submetidos a endoscopia digestiva alta com uma ou duas amostras de biópsia da mucosa não-cancerosas no antro. Partes de cada espécime foi fixado em formalina a 10% tamponada e embebidos em parafina, enquanto a outra parte foi imediatamente congelado e armazenado a -80 ° C. Mais tarde, o DNA genómico foi isolado a partir de amostras congeladas utilizando proteinase K. Uma amostra de sujeitos que consentiram a apenas uma biópsia não foi utilizado para a avaliação histológica.
Os sujeitos sem metilação de ambos DAPK
e CDH1
foram classificados em grupo não CIHM (ilha CpG alta metilado), enquanto os outros, exceto não CIHM foram classificados em grupo CIHM. Além disso, os indivíduos foram divididos em 2 grupos pelo genótipo da seguinte forma:
HR (alto risco) grupo: IL17A -
197 A transportadora com * 1249 CC genótipo
LR (baixo risco) grupo: os assuntos excepto grupo de RH
os Comitês de Ética da Universidade de Saúde Fujita e Kanazawa University Medical aprovou o protocolo, e antes, consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos participantes.
modificação Bissulfato e metilação-Specific PCR (MSP)
para examinar a metilação do DNA, o DNA genómico foi tratada com bissulfito de sódio utilizando o kit de ADN BislFast Modificação para Detecção de ADN metilado (TOYOBO, Co., Ltd., Osaka, Japão). MSP para DAPK
e CDH1
foram realizados utilizando os métodos descritos por Katzenellenbogen et al. [32] e Herman et al. [33], respectivamente. Em resumo, as reacções foram realizadas MSP com os pares de iniciadores descritos a seguir, utilizando EX Taq HS (Takara Bio Inc., Shiga, Japão)
Primer pares DAPK:. Metilado para a frente; 5'-ggatagtcggatcgagttaacgtc-3 ', reverso; 5'-ccctcccaaacgccga-3 ',
DAPK: forward não metilado; 5'-ggaggatagttggattgagttaatgtt-3 ', reverso; 5'-caaatccctcccaaacaccaa-3 '
CDH1: metilado para a frente; 5'-ttaggttagagggttatcgcgt-3 ', reverso; 5'-taactaaaaattcacctaccgac-3 ',
CDH1: forward não metilado; 5'-taattttaggttagagggttattgt-3 ', reverso; 5'-cacaaccaatcaacaacaca-3 ',
uma temperatura de recozimento e os tempos foram determinados utilizando ADN a partir de sangue periférico de um indivíduo jovem, sem pylori
infecção por H. e ADN metilado com metilase SSSI (New England Biolabs Inc., Beverly, MA). A MSP foi realizada num volume de 20 uL contendo 0,1 ug de ADN bislufite-modificated. As bandas de MSP foram detectados por electroforese em géis de agarose a 3,0% corado com brometo de ethdium. A hipermetilação foi definido como a presença de uma banda de metilação positivo mostrando sinais aproximadamente iguais ou maiores do que a do marcador de tamanho (10 ng /mL: 100 pb de DNA Ladder, Takara Bio Inc., Shiga, Japão), independentemente da presença de bandas não metiladas.
genotipagem de polimorfismos
O DNA isoladas a partir de amostras de biópsia ou sangue periférico foi usado. Polimorfismo foi genotipados pelo método de PCR-SSCP conforme relatado anteriormente [27, 28]. Para detectar IL-17A
* 1249 C > T utilizando os pares de iniciadores (1249F: 5'- cccctcagagatcaacagaccaaca-3'and 1249R: 5'-gcgaaaatggttacgatgtgaaacttg-3 '), a PCR foi realizada num volume de 20 uL contendo 0,1 ug de ADN genómico. O ADN foi desnaturado a 95 ° C durante 3 minutos, seguido de 35 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, 52 ° C durante 40 segundos, e 72 ° C durante 45 segundos, com extensão final a 72 ° C durante 5 minutos. Depois disso, 2 uL do produto de PCR foi desnaturado com 10 ul de formamida (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, EUA) a 90 ° C durante 5 minutos. SSCP foi efectuada a 18 ° C usando um sistema de separação de DNA GenePhor com GeneGel Excel 12.5 /24 (Amersham Biosciences Corp., EUA), após o que as bandas de ADN de cadeia única desnaturadas foram detectados utilizando um DNA Kit de coloração com prata (Amersham Biosciences Corp. .)
Para detectar IL-17A -197 G > Um, utilizando os pares de iniciadores (IL17AF: 5'-aacaagtaagaatgaaaagaggacatggt-3 'e IL17AR: 5'-cccccaatgaggtcatagaagaatc-3'), a PCR foi realizada num volume de 20 uL contendo 0,1 ug de ADN genómico. O ADN foi desnaturado a 96 ° C durante 90 s, seguido de 35 ciclos a 96 ° C durante 15 s, 58 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 45 s, com uma extensão final a 72 ° C durante 3 min. Em seguida, SSCP foi efectuada a 6 ° C, como um modo igual ao descrito acima.
Avaliação histológica Online em 286 de 401 pacientes, a gravidade da gastrite crónica foi classificada de acordo com o sistema Sydney [34] por um patologista que não tinham acesso a qualquer informação clínica.
avaliação sorológica
o pepsinogen (PG) I /II rácio foi calculado com base nos dados do soro PG I e os níveis de PG II medidos por radioimunoensaio em 74 de 401 pacientes. Uma razão PG I /II, que mostrou uma diminuição na proporção com a gravidade da atrofia da mucosa gástrica foi usada como um marcador de gastrite atrófica [35, 36] A análise estatística.
Os dados foram expressos como média ± DP. As idades médias entre 2 grupos foi comparado pelo teste
t de Student. A proporção de H. pylori
estado de infecção e masculino /feminino foi comparado pelo teste exato de Fisher. Freqüências alélicas e genotípicas foram calculadas pela contagem direta. As contagens de alelos também foram comparados pelo teste exacto de Fisher. A força da associação entre as freqüências alélicas e a doença foi avaliada por meio do odds ratio (OR) e intervalos de confiança de 95% (IC) por meio de análise de regressão logística. OR ajustadas foram calculados após o ajuste para idade, sexo e H. pylori
estado da infecção. Cada pontuação do sistema de Sydney atualizado e PG I rácio /II entre 2 grupos foram comparados por Mann Whitney U-teste. A relação entre idade e pontuação sistema atualizado Sydney foi avaliada por ANCOVA. Ao definir α = 0,05, o valor β foi calculada pela análise post-hoc. Para todas as análises, o nível de significância foi estabelecido em p Art < 0.05.
Resultados
Sujeitos e genótipo
As características dos indivíduos foram resumidos na tabela 1. H. pylori
relação positiva foi significativamente maior no grupo CIHM do que no grupo não CIHM. A distribuição de -197 G > Um genótipo em grupo não CIHM foi 65GG, 74GA e 14AA. Foi no equilíbrio de Hardy-Weinberg (p = 0,36). O de * 1249 C > T foi 124 centímetros 3, 20CT e 9TT, que não estava no equilíbrio de Hardy-Weinberg. A distribuição de -197 G > Um genótipo não foi diferente entre os dois grupos. No entanto, as frequências de * 1249 minor alelo foi significativamente menor no grupo CIHM que o grupo não CIHM (p = 0,023, 1-βpower = 0,636) .table 1 Características dos indivíduos e frequência de genótipos
Total

não CIHM
CIHM
valor de p *
número de indivíduos
401
153
248
idade média ± SD
60,0 ± 13,8
60,2 ± 13,7
59,9 ± 13,9
NS
macho: fêmea
230: 171
87: 66
143: 105
NS
H. pylori
taxa positiva
241/401
71/153
170/248 Art < 0,0001
-197 G > A
GG
155
65
90
GA
204
74
130
AA
41
14
27
(desconhecido)
1

• IL-induzido-1β activação de p38 promove a metástase no adenocarcinoma gástrico através de regulação positiva de AP-1 /C-fos, MMP2 e MMP9
• NF-kappaB dependente upregulation MicroRNA-425 promove o crescimento de células de câncer gástrico, visando PTEN em cima IL-1β induction