Invloed van IL17A polymorfismen op de afwijkende methylering van DAPK en CDH1 in niet-kankerachtige maagslijmvlies

Invloed van IL17A
polymorfismen op de afwijkende methylering van DAPK Kopen en CDH1
in niet-kanker maagslijmvlies
Abstracte achtergrond
CpG eiland afwijkende methylering wordt aangetoond dat een belangrijk mechanisme in zijn genuitschakeling. De belangrijke rol van IL-17 bij inflammatoire respons op H. pylori
kolonisatie is aangegeven. We onderzochten de invloed van IL17A
polymorfismen, -197 G > A (rs2275913) en * 1249 C > T (rs3748067), op de methylering van DAPK Kopen en CDH1
.
Methods
Maagslijmvlies monsters werden verkregen van 401 personen zonder maligniteiten. Methyleringsstatus van gen werd bepaald door MSP. De genotypering van IL17A
werd uitgevoerd door PCR-SSCP.
Resultaten
methylaties van DAPK Kopen en CDH1
werden gezien in 196 en 149 van alle 401 proefpersonen, respectievelijk. Overall, * 1249 T drager werd geassocieerd met een verminderd risico op DAPK
methylering, terwijl -197 G > Een niet. In de personen ouder dan 60 jaar, * 1249 T drager werd sterker geassocieerd met gen methylatie en -197 Drager neiging geassocieerd met een verhoogd risico op CDH1
methylatie. Bij de evaluatie door een ontsteking bevorderen haplotype (-197 mutant drager met * 1249 homozygote), dit haplotype had een sterker verhoogd risico voor zowel DAPK Kopen en CDH1
methylaties in relatief oudere proefpersonen. Zowel atrofie en metaplasie scores waren significant verhoogd met de leeftijd in -197 A drager of * 1249 CC homozygote, terwijl * 1249 T vervoerder niet in -197 GG homozygote waren of niet. PG I /II-ratio was meer sterk gedaald in -197 Een vervoerder dan in GG homozygote onder invloed van H. pylori
infectie.
Conclusies
In -197 A allel drager met * 1249 CC homozygote, de methyleringen zowel DAPK Kopen en CDH1
kan geleidelijk sneller dan de andere genotypes worden verhoogd, maar, met de leeftijd en veranderde het maagslijmvlies structuur veroorzaakt door H. pylori
infectie.
Sleutelwoorden
IL17A
Aberrant DNA methylatie DAPK
CDH1 achtergrond
Interleukine-17 (IL-17) is een relatief nieuw beschreven cytokine dat de adaptieve en aangeboren immuunsysteem overbrugt. IL-17A is een cytokine verantwoordelijk voor de pathogène activiteit van de Th17 cellen [1], een duidelijke lijn van CD4 + effectorcellen [2]. IL-17A induceert meerdere proinflammatoire mediatoren, waaronder chemokines, cytokines en metalloproteinasen, van epitheliale en fibroblastcellen [3]. Een verhoogde expressie van IL-17 is ook gedocumenteerd en betrokken bij de pathogenese van immuun-gemedieerde ziekten, zoals reumatoïde artritis, multiple sclerose en psoriasis [4]. Bovendien, IL-17 heeft het vermogen om IL-8 productie stimuleren in zowel epitheelcellen en macrofagen [5, 6], waardoor de mogelijkheid dat dit cytokine een belangrijke rol bij de rekrutering van ontstekingscellen tijdens bacteriële infecties kunnen spelen. Aanvankelijk Lussa et al. gemeld dat bioactieve Il-17A productie verhoogd tijdens Helicobacter pylori
(H. pylori
) infectie, suggereert de mogelijkheid dat dit cytokine een belangrijke rol spelen bij de H. pylori
geïnduceerde ontstekingsreactie [7]. Daarna onderzoeken zien dat IL-17 stimuleert IL-8 afgifte door maagepitheelcellen en vergemakkelijkt de chemotaxis van neutrofielen via een IL-8-afhankelijk mechanisme, en draagt ​​bij aan de versterking van IL-8 niveaus in H. pylori
-colonized maagslijmvlies [8-10].
anderzijds, maagkanker is een van de meest voorkomende kankers wereldwijd [11, 12], maar de etiologie van deze tumor blijft onduidelijk. H. pylori
besmetting is geaccepteerd als een cruciale gebeurtenis bij de ontwikkeling van maagzweren en atrofische gastritis, en is betrokken bij de ontwikkeling van maagcarcinoom, vooral niet in cardia [13-15]. Verschillende vormen van kanker, met inbegrip van de maag tumoren, tonen methyleringen van meerdere genen met inbegrip van E-cadherine gen (CDH1
),
-dood geassocieerd proteïne kinase gen (DAPK
) en CDKN2A
[16, 17]. Sommige genen zijn ook gemethyleerd in niet-neoplastische weefsels verouderen, en deze verandering is bekend als leeftijdsgebonden methylering [18, 19]. Bovendien is ook aangetoond dat gen methylatie aanwezig in chronische ontsteking van verschillende weefsels [20, 21] kan zijn. In maagslijmvlies werd aangegeven dat methylatie van CpG eiland werd geïnduceerd door H. pylori infectie
in goedaardige mucosa [22, 23] en beschouwd als precancerous voorwaarden maagkanker [24]. Tussen verschillende genen, DAPK Kopen en CDH1
, alsmede CDKN2A
, vaak gemethyleerd in niet-neoplastische maagslijmvlies versus leeftijd, H. pylori infectie
, histologische graad van gastritis en maagkanker [22, 25, 26]
Onlangs hebben we gemeld dat IL-17A-gen (IL17A
) polymorfisme (rs2275913 G > A). IL-17 en F-gen (IL17F
) polymorfisme (rs763780 T > C) zijn nauw verbonden met de gevoeligheid voor maagkanker [27], en colitis ulcerosa [28]. Daarna verschillende studies bleek de associatie tussen IL17A
rs2275913 G > Een en reumatoïde artritis, maagkanker en astma [29-31]. De rs2275913 (G /A), bij een positie -197 van het startcodon van IL17A
, kan de expressie van mRNA te reguleren. Daarnaast is er een polymorfisme rs3748067 (* 1249 C > T) in IL17A
3'-UTR gerichte sommige microRNA. . Onze hypothese is dat deze IL17A
gen polymorfismen de ontwikkeling van afwijkende DNA mathylation van het maagslijmvlies kan beïnvloeden
In de huidige studie, onderzochten we de associatie tussen polymorfismen van IL17A
, rs2275913 (-197 G > A ) en rs3748067 (* 1249 C >. T), en de afwijkende DNA-methylatie van DAPK Kopen en CDH1
in niet-kanker maag epitheel
Methods
Klinische samples Ondernemingen de onderzochte populatie bestond uit 401 proefpersonen zonder maag maligniteiten het werven van de Endoscopie Center van Fujita Health University Hospital of Kanazawa Medical University Hospital. In HapMap-JPT, de frequentie van IL17A -
197 allel frequentie was 45,3%. We nemen aan dat een vermindering met 20% in de prevalentie van een allelische frequentie klinische relevantie (ongemethyleerde groep: 40% vs. gemethyleerde groep: 50%) was. Uitgaande van een alfa-waarde = 0,05 en een vermogen = 0,80, ten minste 200 ongemethyleerde proefpersonen en 200 gemethyleerde onderwerpen volstaat om een ​​klinisch relevant verschil identificeren. Dienovereenkomstig zou 400 patiënten klinische belang voor de studie. Alle patiënten ondergingen endoscopie met één of twee biopten van goedaardige mucosa in antrum. Delen van elk monster werd gefixeerd in 10% gebufferde formaline en ingebed in paraffine, terwijl anderzijds werd onmiddellijk ingevroren en opgeslagen bij -80 ° C. Later werd Genomisch DNA geïsoleerd uit bevroren monsters gebruik proteïnase K. Het model van de proefpersonen die slechts één biopsie toestemming niet gebruikt voor histologische evaluatie. Ondernemingen De personen zonder methylering van zowel DAPK Kopen en CDH1
werden geclassificeerd in niet CIHM (CpG eiland hoog gemethyleerde) groep, terwijl de andere met uitzondering van niet CIHM werden ingedeeld in CIHM groep. Verder werden de proefpersonen als volgt verdeeld in 2 groepen van genotype:
HR (hoog risico) groep: IL17A -
197 Een drager met * 1249 CC genotype
LR (laag risico) groep: de onderwerpen, behalve HR groep Victoire de ethische commissies van de Fujita Health University en Kanazawa Medical University keurde het protocol, en voorafgaande, werd geschreven geïnformeerde toestemming verkregen van alle deelnemende proefpersonen.
Natriumbisulfaat modificatie en Methylatie Specifieke PCR (MSP)
DNA methylatie te onderzoeken, werd genomisch DNA behandeld met natrium bisulfiet gebruik BislFast DNA Modificatie Kit voor gemethyleerde DNA Detection (TOYOBO Co., Ltd., Osaka, Japan). MSP voor DAPK Kopen en CDH1
werden uitgevoerd met behulp van de methoden Katzenellenbogen et al. [32] en Herman et al. [33], respectievelijk. In het kort werden MSP reacties uitgevoerd met primerparen hieronder beschreven, met behulp van EX Taq HS (Takara Bio, Inc., Shiga, Japan) uitgevoerd
Primer paren DAPK:. Forward gemethyleerd; 5'-ggatagtcggatcgagttaacgtc-3 ', reverse; 5'-ccctcccaaacgccga-3 ',
DAPK: niet-gemethyleerd naar voren; 5'-ggaggatagttggattgagttaatgtt-3 ', reverse; 5'-caaatccctcccaaacaccaa-3 '
CDH1: vooruit gemethyleerd; 5'-ttaggttagagggttatcgcgt-3 ', reverse; 5'-taactaaaaattcacctaccgac-3 ',
CDH1: niet-gemethyleerd naar voren; 5'-taattttaggttagagggttattgt-3 ', reverse; 5'-cacaaccaatcaacaacaca-3 ',
Een annealing temperatuur en tijden werden bepaald met behulp van DNA uit het perifere bloed van een jong individu zonder H. pylori
infectie en DNA gemethyleerd met SSSI methylase (New England Biolabs Inc., Beverly, MA). De MSP werd uitgevoerd in een volume van 20 ui met 0,1 ug bislufite-van wijziging DNA uitgevoerd. De banden van MSP werden gedetecteerd door elektroforese in 3,0% agarosegels gekleurd met ethdium bromide. Hypermethylering werd gedefinieerd als de aanwezigheid van een positieve methylatie band signalen toont ongeveer gelijk aan of groter dan die van de grootte marker (10 ng /ul: 100 bp DNA Ladder, Takara Bio Inc., Shiga, Japan), ongeacht de aanwezigheid van gemethyleerd bands.
Genotypering van polymorfismen
De DNA geïsoleerd uit biopten of perifeer bloed werd gebruikt. Polymorfisme werd gegenotypeerd door PCR-SSCP Werkwijze eerder [27, 28] beschreven. Om IL-17A
* 1249 C >te detecteren; T met de primerparen (1249F: 5'- cccctcagagatcaacagaccaaca-3'- 1249R: 5'- gcgaaaatggttacgatgtgaaacttg-3 ') werd PCR uitgevoerd in een volume van 20 ui bevattende 0,1 ug genomisch DNA uitgevoerd. Het DNA werd gedenatureerd bij 95 ° C gedurende 3 minuten gevolgd door 35 cycli bij 95 ° C gedurende 30 seconden, 52 ° C gedurende 40 seconden en 72 ° C gedurende 45 seconden, met een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 5 minuten. Daarna werd 2 pl van het PCR-product werd gedenatureerd door 10 pl formamide (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) bij 90 ° C gedurende 5 minuten. SSCP werd uitgevoerd bij 18 ° C met gebruikmaking van een DNA GenePhor scheidingssysteem met GeneGel Excel 12,5 /24 (Amersham Biosciences Corp., USA), waarna het gedenatureerde enkelstrengs DNA-banden werden gedetecteerd met een DNA Silver Staining Kit (Amersham Biosciences Corp. .)
te detecteren IL-17A -197 G > Een gebruik van de primerparen (IL17AF: 5'-aacaagtaagaatgaaaagaggacatggt-3 'en IL17AR: 5'-cccccaatgaggtcatagaagaatc-3') werd PCR uitgevoerd in een volume van 20 ui bevattende 0,1 ug genomisch DNA uitgevoerd. Het DNA werd gedenatureerd bij 96 ° C gedurende 90 s, gevolgd door 35 cycli bij 96 ° C gedurende 15 s, 58 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 45 s, met een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 3 min. Daarna werd SSCP uitgevoerd bij 6 ° C uitgevoerd als eenzelfde wijze zoals hierboven beschreven.
Histologisch
In 286 van 401 proefpersonen werd de ernst van chronische gastritis ingedeeld naar de bijgewerkte Sydney stelsel [34] door een patholoog die had geen toegang tot klinische informatie.
Serologische evaluatie
pepsinogeen (PG) I /II werd berekend op basis van de gegevens van het serum PG I en PG II niveaus gemeten door radioimmunoassay in 74 van de 401 proefpersonen. A PG I /II verhouding die een afname in verhouding tot de ernst van maagslijmvlies atrofie vertoonde werd gebruikt als een marker van atrofische gastritis [35, 36] Statistische analyse.
De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Gemiddelde leeftijd tussen de 2 groepen werd vergeleken door Student's t-Electronics Test. De verhouding van H. pylori
infectiestatus en man /vrouw werd vergeleken door Fisher's exact test. Allel en genotype frequenties werden berekend door directe telling. Het allel tellingen werden ook vergeleken met exact test van een Fisher's. De sterkte van de associatie tussen allelfrequenties en de ziekte werd bepaald door berekening van de odds ratio (OR) en 95% betrouwbaarheidsintervallen (CI) door logistische regressie. Gecorrigeerd OR's werden berekend na correctie voor leeftijd, geslacht en H. pylori
infectiestatus. Elk bijgewerkt Sydney systeem score en PG I /II verhouding tussen de 2 groepen werden vergeleken door Mann Whitney U test. De relatie tussen leeftijd en bijgewerkt Sydney systeem score werd beoordeeld door ANCOVA. Bij het instellen α = 0,05, werd de β berekend door post-hoc analyse. Voor alle analyses, werd het niveau van significantie vastgesteld op p
< 0.05.
Resultaten
onderwerpen en genotype
De kenmerken van proefpersonen werden samengevat in Tabel 1. H. pylori
positieve verhouding was in CIHM groep significant hoger dan bij niet CIHM groep. De verdeling van -197 G > Een genotype in niet CIHM groep was 65GG, 74GA en 14AA. Het was in de Hardy-Weinberg evenwicht (p = 0,36). Die van 1249 * C > T was 124cm 3, 20CT en 9TT, die niet in de Hardy-Weinberg evenwicht was. De verdeling van -197 G > Een genotype was niet verschillend tussen beide groepen. De frequenties van 1249 * kleinere allel was CIHM groep significant lager dan niet CIHM groep (p = 0,023, 1-βpower = 0,636) .table 1 Kenmerken van de onderwerpen en de frequentie van genotypes
Totaal

non CIHM
CIHM
p-waarde *
aantal onderwerpen
401
153
248
gemiddelde leeftijd ± SD
60,0 ± 13,8
60,2 ± 13,7
59,9 ± 13,9
NS
man: vrouw
230: 171
87: 66
143: 105
NS
H. pylori
positief tarief
241/401
71/153
170/248 Restaurant < 0,0001
-197 G > Een
GG
155
65
90
GA
204
74
130
AA
41
14
27
(onbekend) 1
0 1
A allel frequentie
35,8%
33,3%
37,2%
NS
* 1249 C > T Shirts CC
340
124
216
0.058a
CT
42
20
22
TT
16
9
7
(onbekend)
3
0
3
T-allel frequentie
9,3%
12,4%
7,3%
0.023
non CIHM:. noch DAPK
noch CDH1
werden gemethyleerd
CIHM: beide of één DAPK golfreizen of CDH1
werd methyaled
*:.. gemethyleerd vs. gemethyleerd
:. frequentie van * 1249 CC genotype
Uitkering van IL17A genotypes en gen mathylations Ondernemingen De H. pylori
positieve verhouding was in gemethyleerde groep significant hoger dan in niet-gemethyleerd groep DAPK golfreizen of CDH1
(Tabel 2). De verdeling van -197 G > Een genotype was niet verschillend tussen beide groepen van beide genen, terwijl de frequentie van * 1249 CC homozygoot was gemethyleerde groep significant hoger dan in ongemethyleerde groep DAPK
(p = 0,023). Bovendien, het kleinere allel frequentie was gemethyleerde groep significant lager dan in groep ongemethyleerde DAPK
(p = 0,020
, 1-βpower = 0,641). Echter, de verdeling van 1249 * C > T genotype was niet verschillend tussen de twee groepen van CDH1
.table 2 Uitkering van IL17A genotypes en gen mathylations
DAPK
CDH1
gemethyleerd

gemethyleerde
p-waarde *
gemethyleerd
gemethyleerde
p-waarde *
aantal onderwerpen
205
196
252
149
gemiddelde leeftijd ± SD
59,3 ± 13,6
60,8 ± 13,9
NS
60,1 ± 14,1
59,9 ± 13,2
NS
man: vrouw
118: 87
112: 84
NS
145: 107
85: 64
NS
H. pylori
positief tarief
104/205
137/196 Restaurant < 0,0001
131/252
110/149 Restaurant < 0,0001
-197 G > Een
GG
86
69
98
57
GA
99
105
128
76
AA
19
22
26
15
(onbekend) 1
0
0 1
A allel frequentie
33,6%
38,0%
NS
35,7%
35,8%
NS
* 1249 C > T Shirts CC
167
173
0.023a
210
130
CT
28
14
28
14
TT
10
6
11
5
(onbekend)
0
3
3
0
T-allel frequency11.
7%
6,7%
0,020
10,0%
8,2% NS pagina Home:. gemethyleerd vs. gemethyleerd
: frequentie van * 1249 CC genotype
Risico van IL17A polymorfismen voor. de genmethylatie Ondernemingen de -197 G > A werd niet geassocieerd met CIHM en werd niet geassocieerd met elk DAPK Kopen en CDH1
methylaties (tabel 3). Anderzijds, * 1249 C > T neiging te worden bij CIHM (OR 0,611; 95% BI 0,343-1,09; p = 0,096, Tabel 4). Ondertussen * 1249 mutant carrier had een verminderd risico voor het ontwikkelen van DAPK
methylering (OR 0,513; 95% BI 0,282-0,933; p = 0,028) en geen significant risico op het ontwikkelen van CDH1
methylatie (p = 0,62, tabel 4) .table 3 Associatie tussen IL17A -197 G > Een polymorfisme en genmethylatie
CIHM (DAPK
orCDH1)
GG
GA
AA
onbekend
Een drager vs. GG; OR (95% CI)
p-waarde
niet-gemethyleerd (153)
65
74
14
0
verwijzing
-
gemethyleerd (248)
90
130
27 1
1,33 (,870-2,04)
0,19
DAPK
niet-gemethyleerd (205)
86
99
19 1
verwijzing
- gemethyleerd (196)
69
105
22
0
1,37 ( ,907-2,08)
0.13
CDH1
niet-gemethyleerd (252)
98
128
26
0
verwijzing
- gemethyleerde (149)
57
76
15 1
1,04 (,676-1,60)
0,86
door logistische regressie-analyse na correctie voor leeftijd, geslacht en H. pylori
infectiestatus
():.. aantal onderwerpen
tabel 4 Verband tussen IL17A * 1249 C > T polymorfisme en genmethylatie
CIHM (DAPK
orCDH1)
CC
CT
TT
onbekend
T carrier vs. CC; OR (95% CI)
p-waarde
niet-gemethyleerd (153)
124
20
9
0
verwijzing
-
gemethyleerd (248)
216
22
7
3
0,611 (,343-1,09)
0,096
DAPK
niet-gemethyleerd (205)
167
28
10

• -IL-1β activatie van p38 bevordert metastase in adenocarcinoom via opregulatie van AP-1 /c-fos, MMP2 en MMP9
• NF-kappaB-afhankelijke MicroRNA-425 opregulatie bevordert de maag de groei van kankercellen door zich te richten PTEN op IL-1β induction