significado clínico do sistema de uPA em câncer gástrico com metástase peritoneal

O significado clínico do sistema de uPA em cancro gástrico com metástases peritoneais
Resumo
fundo
Demonstrou-se que o activador do plasminogénio tipo uroquinase (uPA) está envolvida na metástase de células tumorais através da degradação da matriz extracelular. No entanto, há pouca evidência direta de expressão clínica sistema de uPA em tecidos metastáticos peritoniais de câncer gástrico. O objetivo deste estudo foi investigar a expressão sistema de uPA em tecidos peritoneal de pacientes com metástase peritoneal e nonperitoneal, e explorar o valor diagnóstico do sistema de uPA.
Métodos
expressões de uPA, uPAR e PAI-1 foram medido pela semi-quantitativo de RT-PCR e ELISA. actividade de uPA foi detectada utilizando um kit de actividade de uPA.

Resultados Não houve diferença significativa em uPA, uPAR e PAI-1 expressão em dois tipos de tecido peritoneal em sete pacientes com metástases peritoneais. No entanto, uPA, uPAR e PAI-1 expressões em lesões metastáticas peritoneal foram significativamente maiores do que aqueles em tecidos normais peritoneais de 24 pacientes com metástase nonperitoneal (P Art < 0,05). Além disso, não se observou qualquer discrepância estatística da atividade uPA em vários tecidos diferentes.
Conclusões
A expressão do sistema de uPA correlaciona-se positivamente com metástase peritoneal do câncer gástrico. Esta diferença expressão em pacientes com metástase peritoneal ou nonperitoneal podem fornecer uma referência para o diagnóstico de metástase peritoneal.
Palavras-chave
gástrica câncer de ELISA Peritoneal metástase RT-PCR UPA fundo sistema
Embora a incidência e mortalidade do cancro gástrico diminuíram na China ao longo das últimas décadas, o câncer gástrico ainda é um grande fardo do programa local de saúde [1]. É importante ressaltar que a recorrência de câncer gástrico ocorre mesmo após a ressecção potencialmente curativa, mais frequentemente na forma de metástase peritoneal [2]. Assim, há uma necessidade urgente de desenvolver estratégias de diagnóstico precoce eficazes para metástase peritoneal do câncer gástrico. Invasão
cancro e metástases são processos multifatoriais [3] e um passo essencial envolve a destruição consecutiva e reconstituição das membranas da matriz e cave extracelulares, que por sua vez requer a participação de vários sistemas de enzimas proteolíticas, tais como as proteases de serina e metaloproteases [4]. -Tipo uroquinase activador de plasminogénio (uPA) é uma das proteases de serina e que se liga ao seu receptor, o receptor de uPA (uPAR) na superfície da célula tumoral. Após a activação, uPA ligada à célula é capaz de converter plasminogénio em plasmina, a qual é então capaz de degradar vários componentes da matriz extracelular [5]. A acção do complexo uPA-uPAR em plasminogénio pode ser controlada pela inibidores da protease PAI [6, 7]. Assim, uma produção equilibrada de celular e pericelular uPA, uPAR e PAI-1 é um pré-requisito para a proteólise eficiente focal, adesão celular e migração, e portanto, a invasão da célula tumoral e metástase [8, 9].
Tem foi observado que o sistema de uPA está bem correlacionada com cancros gástricos, medindo o nível de uPA, uPAR e PAI-1 na expressão do cancro gástrico e tecido da mucosa normal e analisando a sua correlação com várias características patológicas clínicas. Por exemplo, Plebani
et ai. [10] determinou uPAR, uPA e PAI-1 níveis usando ELISA em câncer gástrico e amostras normais de 20 pacientes com câncer gástrico submetidos a cirurgia. nível de expressão de uPAR é significativamente mais elevada no cancro gástrico, e baixos níveis de uPAR estão associados a uma melhor sobrevivência. Taniguchi et al
. [11] estudaram a relação entre a expressão de uPAR e parâmetros clinicopatológicas usando análise imuno-histoquímica de 102 carcinomas gástricos primários. uPAR imunorreactividade foi observada em 38 casos de 102 (37%). Além disso, as expressões de uPA, uPAR e PAI-1 estão significativamente correlacionados com vários factores clinicopatológicas: tamanho do tumor, profundidade de invasão tumoral, diferenciação, nódulo linfático metástase [12-15], e metástase peritoneu [16, 17].
evidência direta muito pouco no entanto, tem sido o de demonstrar o significado clínico do sistema de uPA em metastático peritoneal distintiva a partir de tecidos normais peritoneal em câncer gástrico. Em comparação com a distribuição regular e disposição dos nódulos linfáticos, o tecido peritoneal tem uma área maior, ocupando toda a cavidade peritoneal, o que implica, portanto, mais aleatoriedade e imprevisibilidade na metástase peritoneal celular no cancro gástrico. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar ainda mais a diferença do sistema de uPA entre os tecidos metastáticos peritoneal e tecidos peritoneais normais de câncer gástrico e para confirmar o significado diagnóstico do sistema de uPA pela combinação desses resultados com os dados clínicos expressão.
métodos
amostra clínica
foram avaliados 31 pacientes (21 homens, 10 mulheres) com diagnóstico de câncer gástrico, que tinha sido admitido para o nosso departamento entre julho de 2010 e dezembro de 2010. a idade média foi de 62,58 anos (variação, 23-85). Os pacientes foram diagnosticados com câncer gástrico com base na análise patológica pré ou pós-operatório. Entre eles, 7 pacientes apresentavam metástase peritoneal (tipo patológico: 1 caso de adenocarcinoma tubular moderadamente diferenciado, um caso de grau II a III adenocarcinoma, 3 casos de adenocarcinoma pouco diferenciado, e 3 casos de adenocarcinoma pouco diferenciado combinado com carcinoma de células anel de sinete) , enquanto que 24 pacientes apresentavam metástase nonperitoneal (tipo patológico: 3 casos de adenocarcinoma tubular moderadamente diferenciado, 3 casos de grau II adenocarcinoma, 2 casos de grau II a III adenocarcinoma, 9 casos de adenocarcinoma pouco diferenciado, 3 casos de carcinoma de células anel de sinete, 1 caso de carcinoma mucinoso, 1 caso de grau II adenocarcinoma combinado com carcinoma de células anel de sinete, um caso de adenocarcinoma de grau III combinado com carcinoma de células anel de sinete, e 1 caso de grau II adenocarcinoma combinado com carcinoma mucinoso).
no pacientes com metástase peritoneal, nós excisadas as lesões metástase peritoneal, assim como uma pequena quantidade de majus omento, pelveoperitoneum e peritônio diafragmática sem metástase peritoneal. Nos pacientes com metástase nonperitoneal, também foram realizados alguns ressecções do majus omento, pelveoperitoneum e peritônio diafragmática. As amostras coletadas foram armazenadas a -80 ° C para análise posterior.
Todos os pacientes estavam vivos no final da pesquisa, e nosso estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Shanghai East Hospital, afiliado à Tong Ji University.
cultura celular
células de uma linha de células de mesotélio peritoneal (HMrSV5) foram mantidas em DMEM (Sigma, St. Louis, EUA) suplementado com soro bovino fetal a 10%. As células foram subcultivadas por quase todos os dias 1: 4 ou 1: 5 de diluição em frascos de cultura a 37 ° C sob uma atmosfera de 5% de CO 2
extracção total de ARN e síntese de ADNc ARN total foi
. isolado por precipitação de células utilizando um estojo de extracção de ARN RNeasy ™ seguindo as instruções do fabricante (Qiagen, Valencia, EUA). A pureza e a concentração de ARN foi determinada por absorvância espectrofotométrica a 260 e 280 nm, respectivamente. A transcrição reversa foi realizada em 1 ug de ARN total, utilizando iniciadores oligo (dT) e transcriptase reversa de AMV (Promega, Madison, EUA). A PCR mistura de reacção 20 uL continha 2 mL de 10 x tampão de RT, 2 de dNTPs ul, 4 ul de MgCl 2, 0,5 ul de RNasin, 1 ul de oligo (dT) 18, 0,75 ul de transcriptase reversa, e RNA 1 ug . A condição de PCR foi de 70 ° C durante 10 min, 42 ° C durante 15 min, e 99 ° C durante 5 min, após o qual o ADNc foi armazenado a 4 ° C (a 3 meses).
Semi-quantitativo de RT- PCR
Os níveis de uPA, uPAR de expressão de genes, e de PAI-1 foram determinados por comparação com o gene β-actina ou gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH). A 25 ul de RT-PCR mistura de reacção continha um cDNA de pi, com sentido e anti-sentido iniciadores (cada 0,25 ul), 2,5 ul de 10 x tampão de PCR, 2 ul de 25% de MgCl 2, 0,5 jil de polimerase Taq, 1 ul de dNTP e 17,5 ul RNase H 2O. Nested PCR foi utilizado para a amplificação de antigénio carcinoembrionário (CEA) com 1 ul de primeiro produto de PCR utilizados para o segundo molde de PCR. As condições de amplificação foram os seguintes: (i) desnaturação inicial a 95 ° C durante 5 min; (II) 30 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 1 min; (Iii) emparelhamento a 56 ° C durante 30 s para uPA, a 60 ° C durante 1 min para uPAR, 55 ° C durante 1 min para o PAI-1, ou seja, 72 ° C durante 2,5 min para CEA; e (iv) extensão a 72 ° C durante 1 min ou 2,5 min. Os iniciadores de PCR utilizados foram como se segue: para a uPA, A, 5'-AGAATTCACCACCATCGA GA-3 'e B, 5'-ATCAGCTTCACAACAGTCA T-3'; para uPAR, A, 5'-ACA GGAGCTGCCCTCGCGAC-3 'e B, 5'-GAGGGGGATTT CAGGTTT AGG-3'; para o PAI-1, A, 5'-CTTTGGTGAAGGGTCTGC-3 'e B, 5'-CTC CACCTCTGAAAAGTCC-3'; para o CEA, A, 5'-TCTGGAACTTCTCCTGGTCT CAGCTGG-3 ', B, 5'-TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3', e C, 5'-GGGCCACTGTCGGCATCATG ATTGG-3 '; para β-actina, A, 5'-TTGAAGGTAGTTTC GGGAAT-3 'e B, 5'-GAA AATCTG GCACCACAC CTT-3'; para GAPDH, A, 5'-GAAGGTGAAGGCGGAGT C-3 'e B, 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'. Os iniciadores A e B de CEA foram utilizados para a primeira PCR, enquanto que os iniciadores B e C foram usados ​​para a segunda amplificação. O produto da amplificação foi de 474 pb, 1046 pb, 409 pb, 131 pb, 591 pb e 230 pb, respectivamente análise.
ELISA Quantitativo
solução salina tamponada com Tris (pH 8,5, 1,8 ml) foi adicionado aos tecidos congelados (100 a 300 mg) e a homogeneização foi realizada num banho de gelo. Subsequentemente, 0,2 ml de 10% Trixon X-100 foi adicionado para assegurar uma concentração final de 1% Trixon X-100 no homogenato. O homogeneizado foi agitado durante 16 h e, em seguida, centrifugada numa centrífuga refrigerada a 4 ° C durante 1 h a 100000 g
. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e a concentração de proteína foi determinada por um ensaio de ácido bicinconínico. As concentrações de uPA, uPAR e PAI-1 de antigénio foram determinadas usando kits de ELISA de acordo com as instruções do fabricante (American Diagnostica, Greenwich, EUA). A reacção foi parada pela adição de 50 ul de H 2SO 4, e a absorção foi medida a 450 nm num leitor de placas de ELISA (leitor de microplacas EL312e, Bio-Tek Instruments, Winooski, USA). Valores de uPA, uPAR e PAI-1 de antigénio foram expressos como ng /mg de proteína.
Ensaio de actividade de uPA
actividade de uPA foi medida utilizando um kit de ensaio de actividade de uPA (Chemicon). Resumidamente, a proteína de tecido foi misturado com tampão de ensaio e incubada com um substrato cromogénico, em placas de 96 poços a 37 ° C durante 2 a 24 h. A absorvância foi lida a OD 405, e a actividade (unidades) foi extrapolada a partir de uma curva padrão. Análise
Estatística
Todos os dados foram analisados ​​usando SAS versão 6.12 do software e os resultados foram registrados como padrão ± médio desvio. A significância das diferenças entre grupos foi avaliada por análise de variância, seguida por um teste t emparelhado
. P Art < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados da análise semi-quantitativa RT-PCR da CEA, uPA, uPAR e PAI-1 expressão do mRNA
CEA é um importante marcador para tumores gastrointestinais. Deste modo, utilizou-se uma alta sensibilidade aninhados método de RT-PCR para detectar a expressão de CEA em tecidos de cancro gástrico, com ou sem metástases peritoneal. Como esperado, os resultados foram todos positivos para CEA nas lesões metastáticas peritoneais de sete pacientes com metástases peritoneais (Figura 1). Além disso, pela observação olho nu pacientes com metástase peritoneal, três casos apresentaram expressão CEA-positivos nos tecidos metastáticos nonperitoneal. Entre os 24 pacientes com metástases nonperitoneal, 2 tiveram expressão CEA-positiva em tecidos peritoneais normais. Nenhuma expressão de CEA foi detectado na linha celular de mesotélio peritoneal HMrSV5. No entanto, uPA, uPAR e PAI-1could ser expresso em células HMrSV5 (Figura 2). Figura 1 expressão do mRNA CEA em sete casos de câncer gástrico com metástase peritoneal. M: marcador de 1000 pb; As faixas 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 indicou os sete casos metastáticos peritoneal. p-actina foi utilizado como referência interna para normalizar a expressão de CEA. Os produtos de amplificação foram 131 pb de CEA e 591 pb de β-actina, respectivamente. CEA, antigénio carcinoembriónico.
Figura 2 uPA expressão de ARNm em células do sistema HMrSV5. M, marcador de 1000 pb; pista 1, uPA; pista 2, uPAR; pista 3, PAI-1; pista 4, β-actina. β-actina foi utilizado como referência interna. Os produtos de amplificação foram 474 pb do uPA, uPAR 1046 pb de, 409 pb de PAI-1, e 591 pb de β-actina, respectivamente.
Expressão da proteína do sistema de uPA em tecidos de cancro gástrico, com ou sem metástases peritoneais
Um método ELISA quantitativo foi usado para determinar a uPA, uPAR e PAI-1 teores de proteína em lesões metastáticas peritoneal e tecidos metastáticos nonperitoneal CEA-negativas de 7 pacientes com metástase peritoneal, e os tecidos normais peritoneal CEA-negativos de 24 pacientes com metástase nonperitoneal. Os resultados (Tabela 1) indicaram que não houve diferenças significativas em uPA, uPAR e PAI-1 expressão em dois tipos de tecido peritoneal de sete pacientes com metástases peritoneais. No entanto, uPA, uPAR e PAI-1 foram significativamente mais elevados de expressão em lesões metastáticas peritoneais do que os tecidos normais peritoneais de 24 pacientes com metástases nonperitoneal
(P < 0,05) .table uma proteína do sistema de expressão de uPA em tecidos de cancro gástrico com ou sem metástase peritoneal
Protein
metástase peritoneal (7 casos)
Nonperitoneal metástase (24 cases)

CEA(+)

CEA(−)

CEA(−)

uPA
3.312
2.488
0.408
0.784
0.640
3.088
1.664
0.280
0.632
0.488
2.952
0.648
0.672
0.664
0.224
0.712
0.504
0.280
0.800
0.424
0.520
0.488
0.440
0.656
0.328
0.480
0.128
0.440
0.256
0.384
0.376
1.440
0.512
0.440
0.848
0.312
0.464
0.168
uPAR
3.664
4.936
1.432
0.345
1.034
2.720
2.304
0.640
1.256
0.532
2.744
2.192
1.536
0.239
0.479
1.432
1.808
0.704
0.671
0.561
0.912
1.280
0.792
0.845
0.390
1.184
0.480
0.272
0.432
0.633
1.064
2.728
1.280
0.467
0.291
1.120
0,968
0,776
PAI-1

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