Klinisk betydning af uPA-systemet i mavekræft med peritoneal metastaser

Kliniske betydning af uPA-systemet i gastrisk cancer med peritoneal metastase
Abstract
Baggrund
Det er blevet påvist, at urokinase-plasminogenaktivator (uPA) er involveret i tumorcellemetastase ved nedbrydning af ekstracellulær matrix. Men der er lidt direkte bevis for klinisk uPA systemets udtryk i peritoneale metastatisk væv af mavekræft. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge uPA systemet udtryk i peritoneale væv af peritoneale og nonperitoneal metastase patienter, og til at udforske den diagnostiske værdi af uPA-systemet.
Metoder
Udtryk af uPA, uPAR og PAI-1 var målt ved semikvantitativ RT-PCR og ELISA. uPA-aktivitet blev detekteret ved anvendelse af en uPA-aktivitet kit. Search Results
Der var ingen signifikant forskel i uPA, uPAR, og PAI-1-ekspression i to typer peritoneal væv hos syv patienter med peritoneal metastase. Men uPA, uPAR og PAI-1 udtryk i peritoneale metastatiske læsioner var væsentligt højere end i normale peritoneale væv af 24 nonperitoneal metastase patienter (P
< 0,05). Desuden blev ingen statistisk forskel på uPA-aktivitet observeret i forskellige væv.
Konklusioner
ekspression af uPA systemet positivt korrelerer med peritoneal metastase af mavekræft. Dette udtryk forskel i peritoneal eller nonperitoneal metastase patienter kan give en henvisning til diagnosticering af peritoneal metastaser.
Nøgleord
mavekræft ELISA peritoneal metastaser RT-PCR UPA-systemet Baggrund
Selvom forekomsten og dødeligheden af ​​mavekræft er faldet i Kina i de seneste årtier, mavekræft er stadig en stor byrde for den lokale sundhed program [1]. Vigtigt er, gentagelse af mavekræft forekommer selv efter potentiel kurativ resektion, hyppigst i form af peritoneal [2] metastase. Således er der et presserende behov for at udvikle effektive tidlig diagnose strategier for peritoneal metastase af mavekræft.
Cancer invasion og metastase er multifaktorielle processer [3], og et vigtigt skridt indebærer fortløbende ødelæggelse og genoprettelse af den ekstracellulære matrix og basalmembraner, hvilket igen kræver deltagelse af flere proteolytiske enzymsystemer, såsom serinproteaser og metalloproteaser [4]. Urokinase-plasminogenaktivator (uPA) er en af ​​de serinproteinaser og det binder til sin receptor, uPA receptoren (uPAR) på overfladen af ​​tumorcellen. Efter aktivering cellebundet uPA er stand til at omdanne plasminogen til plasmin, som derefter er i stand til at nedbryde flere komponenter af den ekstracellulære matrix [5]. Virkningen af ​​uPA-uPAR kompleks på plasminogen kan styres af proteasehæmmere PAI [6, 7]. Således er en afbalanceret produktion af cellulær og pericellulært uPA, uPAR, og PAI-1 er en forudsætning for en effektiv fokal proteolyse, celleadhæsion og migrering, og dermed tumorcelleinvasion og metastase [8, 9].
Det har blevet observeret, at uPA systemet er godt korreleret med gastriske cancere, ved at måle ekspressionsniveauet af uPA, uPAR, og PAI-1 i gastrisk cancer og normal slimhindevæv og analysere deres korrelation med forskellige kliniske patologiske karakteristika. For eksempel Plebani et al
. [10] bestemmes uPAR, uPA, og PAI-1 niveauer ved hjælp af ELISA i mavekræft og normale prøver fra 20 patienter med mavekræft foretaget en operation. uPAR ekspressionsniveauet er betydeligt højere i gastrisk cancer, og lave niveauer af uPAR er forbundet med en bedre overlevelse. Taniguchi et al
. [11] studerede forholdet mellem ekspressionen af ​​uPAR og clinicopathologic parametre under anvendelse immunhistokemisk analyse fra 102 primære gastriske carcinomer. uPAR immunreaktivitet blev observeret i 38 tilfælde ud af 102 (37%). Desuden er udtrykkene for uPA, uPAR, og PAI-1 signifikant korreleret med forskellige klinisk-patologiske faktorer: tumorstørrelse dybde af tumorinvasion, differentiering, lymfeknudemetastase [12-15], og peritoneum metastase [16, 17].
der har dog været meget lidt direkte dokumentation for den kliniske betydning af den uPA systemet skelne peritoneal metastatisk fra normale peritoneale væv i mavekræft. Sammenlignet med den almindelige fordeling og placering af lymfeknuder, peritoneal væv har et større område, besætter hele bughulen, hvilket medfører mere tilfældighed og uforudsigelighed i celle peritoneal metastase i mavekræft. Således er formålet med denne undersøgelse var at undersøge yderligere udtryk forskellen i uPA-systemet mellem peritoneale metastatiske væv og normale peritoneale væv af mavekræft og at bekræfte diagnosen betydning af uPA-systemet ved at kombinere disse resultater med kliniske data.
Metoder
Klinisk prøve
Vi vurderede 31 patienter (21 mænd, 10 kvinder) med en diagnose af mavekræft, der var blevet indlagt på vores afdeling mellem juli 2010 og december 2010. Deres gennemsnitlige alder var 62,58 år (interval, 23 til 85). Patienterne blev diagnosticeret med mavekræft baseret på præoperativ eller postoperativ patologisk analyse. Blandt dem, 7 patienter havde peritoneal metastaser (patologisk seværdighed: 1 tilfælde af moderat differentieret rørformede adenocarcinom, 1 tilfælde af grad II til III adenocarcinom, 3 tilfælde af dårligt differentieret adenocarcinom og 3 tilfælde af dårligt differentieret adenocarcinom kombineret med signetring celle karcinom) , mens 24 patienter havde nonperitoneal metastaser (patologisk seværdighed: 3 tilfælde af moderat differentieret rørformede adenocarcinom, 3 tilfælde af grad II adenocarcinom, 2 tilfælde af grad II til III adenocarcinom, 9 tilfælde af dårligt differentieret adenocarcinom, 3 tilfælde af signetring celle karcinom, 1 tilfælde af mucinous karcinom, 1 tilfælde af grad II adenocarcinom kombineret med signetring celle karcinom, 1 tilfælde af grad III adenokarcinom kombineret med signetring celle karcinom, og 1 tilfælde af grad II adenocarcinom kombineret med mucinøs karcinom).
i patienter med peritoneal metastase, vi udskåret de peritoneale metastase læsioner, samt en lille mængde af omentum majus, pelveoperitoneum og diafragma peritoneum uden peritoneal metastase. I patienter med nonperitoneal metastase, blev også udført et par resektioner af omentum majus, pelveoperitoneum og diafragma bughinden. De indsamlede prøver blev opbevaret ved -80 ° C til yderligere analyse.
Alle patienter var i live ved slutningen af ​​den forskning, og vores undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Shanghai East Hospital, tilknyttet Tong Ji Universitet.
Cellekultur
Celler fra en peritoneal mesothelial cellelinie (HMrSV5) blev opretholdt i DMEM (Sigma, St. Louis, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum. Cellerne blev subdyrket næsten hver dag med 1: 4 eller 1: 5-fortynding i dyrkningskolber ved 37 ° C under en atmosfære af 5% CO 2
Total RNA-ekstraktion og cDNA-syntese
Total RNA blev. isoleret ved celle udfældning under anvendelse af et RNeasy ™ RNA-ekstraktion kittet ifølge producentens instruktioner (Qiagen, Valencia, USA). RNA renhed og koncentration blev bestemt ved spektrofotometrisk absorbans ved 260 og 280 nm. Revers transkription blev udført på 1 ug totalt RNA ved anvendelse af oligo (dT) primere og AMV-revers transkriptase (Promega, Madison, USA). Den 20 pi PCR-reaktionsblanding indeholdt 2 pi 10 x RT-puffer, 2 pi dNTP'er, 4 pi MgCl 2, 0,5 pi RNasin, 1 pi oligo (dT) 18, 0,75 pi revers transkriptase, og 1 ug RNA . PCR betingelse var 70 ° C i 10 min, 42 ° C i 15 min, og 99 ° C i 5 minutter, hvorefter cDNA blev opbevaret ved 4 ° C (inden for 3 måneder).
Semikvantitativ RT- PCR
genekspressionen niveauer af uPA, uPAR, og PAI-1, blev bestemt ved sammenligning med β-actin-genet eller glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH). Den 25 pi RT-PCR reaktionsblandingen indeholdt 1 pi cDNA, sense- og anti-sense-primere (hver 0,25 pi), 2,5 pi 10 x PCR-puffer, 2 pi 25% MgCl 2, 0,5 pi Taq-polymerase, 1 pi dNTP og 17,5 pi Rnase-fri H 2O. Nested PCR blev anvendt til amplifikation af carcinoembryonisk antigen (CEA) med 1 pi første PCR-produkt, der anvendes til den anden PCR-skabelon. Amplificeringsbetingelserne var: (i) indledende denaturering ved 95 ° C i 5 minutter; (Ii) 30 cykler af denaturering ved 94 ° C i 1 min; (Iii) annealing ved 56 ° C i 30 s for uPA, 60 ° C i 1 min for uPAR, 55 ° C i 1 min for PAI-1, eller 72 ° C i 2,5 min for CEA; og (iv) forlængelse ved 72 ° C i 1 min eller 2,5 min. De anvendte PCR-primere var som følger: for uPA, A, 5'-AGAATTCACCACCATCGA GA-3 'og B, 5'-ATCAGCTTCACAACAGTCA T-3'; for uPAR, A, 5'-ACA GGAGCTGCCCTCGCGAC-3 'og B, 5'-GAGGGGGATTT CAGGTTT AGG-3'; PAI-1, A, 5'-CTTTGGTGAAGGGTCTGC-3 'og B, 5'-CTC CACCTCTGAAAAGTCC-3'; for CEA, A, 5'-TCTGGAACTTCTCCTGGTCT CAGCTGG-3 ', B, 5'-TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3', og C, 5'-GGGCCACTGTCGGCATCATG ATTGG-3 '; for β-actin, A, 5'-TTGAAGGTAGTTTC GGGAAT-3 'og B, 5'-GAA AATCTG GCACCACAC CTT-3'; for GAPDH, A, 5'-GAAGGTGAAGGCGGAGT C-3 'og B, 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'. A- og B-primere af CEA blev anvendt til den første PCR, medens B og C-primere blev anvendt til den anden amplifikation. Amplifikationsproduktet var 474 bp, 1046 bp, 409 bp, 131 bp, 591 bp og 230 bp.
Kvantitativ ELISA-analyse
Tris-bufret saltvand (pH 8,5, 1,8 ml) blev tilsat til frosne væv (100 til 300 mg) og homogenisering blev udført i et isbad. Efterfølgende blev 0,2 ml 10% Trixon X-100 tilsat for at sikre en slutkoncentration på 1% Trixon X-100 i homogenat. Homogenatet blev rystet i 16 timer og derefter centrifugeret i en nedkølet centrifuge ved 4 ° C i 1 time ved 100.000 g
. Supernatanten blev overført til et nyt rør og proteinkoncentrationen blev bestemt ved en bicinchoninsyre assay. Koncentrationer af uPA, uPAR, og PAI-1 antigen blev bestemt ved anvendelse af ELISA-kit ifølge producentens instruktioner (American Diagnostica, Greenwich, USA). Reaktionen blev standset ved tilsætning af 50 pi H 2SO 4, og absorptionen blev målt ved 450 nm på en ELISA-pladelæser (EL312e mikropladelæser, Bio-Tek Instruments, Winooski, USA). Værdier af uPA, uPAR, og PAI-1-antigenet blev udtrykt som ng /mg protein.
UPA aktivitetsassay
uPA-aktivitet blev målt under anvendelse af et uPA aktivitet assaykit (Chemicon). Kort fortalt blev vævsprotein blandet med assaypuffer og inkuberet med et kromogent substrat i 96-brønds plader ved 37 ° C i 2 til 24 timer. Absorbansen blev aflæst ved OD 405, og aktiviteten (enheder) blev ekstrapoleret fra en standardkurve.
Statistisk analyse
Alle data blev analyseret ved hjælp af SAS-version 6.12 software, og resultaterne blev registreret som gennemsnit ± standard afvigelse. Betydningen af ​​forskellene mellem grupperne blev vurderet ved variansanalyse efterfulgt af en parret t
test. P
< 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Resultater
Semi-kvantitativ RT-PCR-analyse af CEA, uPA, uPAR, og PAI-1-mRNA-ekspression
CEA er et vigtigt markør for gastroenteriske tumorer. Derved anvendtes en høj sensibilitet indlejret RT-PCR-metode til påvisning af ekspression af CEA i gastrisk cancer væv med eller uden peritoneal metastase. Som forventet var resultaterne alle positive for CEA i de peritoneale metastatiske læsioner af syv peritoneal metastase patienter (figur 1). Også ved at blotte øje observation af peritoneale metastase patienter, viste tre tilfælde CEA-positive udtryk i nonperitoneal metastatiske væv. Blandt de 24 patienter med nonperitoneal metastase, 2 havde CEA-positive ekspression i normale peritoneale væv. Nr CEA-ekspression blev detekteret i den peritoneale mesothelial cellelinie HMrSV5. Imidlertid uPA, uPAR, og PAI-1could udtrykkes i HMrSV5 celler (figur 2). Figur 1 CEA mRNA-ekspression i syv tilfælde af mavekræft med peritoneal metastase. M: 1000 bp markør; Bane 1, 2, 3, 4, 5, 6, og 7 er angivet de syv peritoneale metastatiske tilfælde. p-actin blev anvendt til intern reference til at normalisere ekspressionen af ​​CEA. Amplifikationsprodukterne var 131 bp af CEA og 591 bp af β-actin henholdsvis. CEA, carcinoembryonisk antigen.
Figur 2 uPA systemet mRNA-ekspression i HMrSV5 celle. M, 1000 bp markør; bane 1, uPA; bane 2, uPAR; bane 3, PAI-1; bane 4, β-actin. β-actin blev anvendt til intern reference. Amplifikationsprodukterne var 474 bp af uPA, 1046 bp af uPAR, 409 bp af PAI-1, og 591 bp af β-actin henholdsvis.
UPA systemet proteinekspression i gastrisk cancer væv med eller uden peritoneal metastase
En kvantitativ ELISA-metode blev anvendt til at determinate uPA, uPAR, og PAI-1 proteinindholdet i peritoneale metastatiske læsioner og CEA-negative nonperitoneal metastatiske væv af 7 peritoneale metastase patienter, og CEA-negative normale peritoneale væv af 24 nonperitoneal metastase patienter. Resultaterne (tabel 1) viste, at der var ingen signifikante forskelle i uPA, uPAR og PAI-1-ekspression i to typer af peritoneal væv af syv peritoneal metastase patienter. Imidlertid uPA, uPAR, og PAI-1-ekspression var betydeligt højere i peritoneale metastatiske læsioner end de normale peritoneale væv af 24 nonperitoneal metastase patienter (P
< 0,05) .table 1 uPA systemet proteinekspression i gastrisk cancer væv med eller uden peritoneal metastase
Protein
peritoneal metastaser (7 sager)
Nonperitoneal metastaser (24 cases)

CEA(+)

CEA(−)

CEA(−)

uPA
3.312
2.488
0.408
0.784
0.640
3.088
1.664
0.280
0.632
0.488
2.952
0.648
0.672
0.664
0.224
0.712
0.504
0.280
0.800
0.424
0.520
0.488
0.440
0.656
0.328
0.480
0.128
0.440
0.256
0.384
0.376
1.440
0.512
0.440
0.848
0.312
0.464
0.168
uPAR
3.664
4.936
1.432
0.345
1.034
2.720
2.304
0.640
1.256
0.532
2.744
2.192
1.536
0.239
0.479
1.432
1.808
0.704
0.671
0.561
0.912
1.280
0.792
0.845
0.390
1.184
0.480
0.272
0.432
0.633
1.064
2.728
1.280
0.467
0.291
1.120
0,968
0,776
PAI-1
1,511
4,204
0,568
3,665
Ingen påvisning
3,872
1,725 ​​
0,262
1,426
0,071
2,782
0,876
0,488
3,598
Ingen påvisning
0,369
0,745
0,662
0,488
Ingen påvisning
1,315
3,023
0,894
0,127
0,289
1.041
0,262
0,963
Ingen påvisning
0,195
1,181
0,977
0,041
0,329
0,395
0,085
0,316
0,382
uPA aktivitet afsløring
Vi har detekteret også uPA aktivitet i peritoneale metastatiske læsioner og CEA-negative nonperitoneal metastatiske væv af 7 peritoneal metastaser patienter, og CEA-negative normale peritoneale væv af 24 nonperitoneal metastase patienter. resultaterne viste, at ingen statistisk forskel blev observeret i forskellige væv (tabel 2) .table 2 uPA-aktivitet i gastrisk cancer væv med eller uden peritoneal metastase
peritoneal metastaser (7 sager)
Nonperitoneal metastaser (24 cases)

CEA(+)

CEA(−)

CEA(−)

19.936
16.536
3.914
4.510
5.635
0.846
3.091
1.942
5.407
4.151
1.417
8.725
3.117
4.702
0.899
2.352
16.170
2.142
10.046
2.419
2.820
4.799
1.302
3.730
2.828
2.123
3.310
5.299
7.287
1.233
6.066
6.533
7.922
6.485
8.150
7,802
4,466
3,468
Diskussion
grund af sin mangel på specifikke kliniske manifestationer i den tidlige fase af peritoneal metastase, har den optimale behandling mulighed altid været savnet i mavecancerpatienter. Forekomsten af ​​ascites, abdominale tumorer og tarm forhindringer indikerer et fremskredent stadium af mavekræft. Derfor er den effektive diagnosen mavekræft med peritoneal metastaser er stadig en udfordring i klinikker. i øjeblikket er den vigtigste diagnostiske metode til mavekræft med peritoneal metastaser inkluderer peritoneal lavage og cytologisk undersøgelse [18, 19]. imidlertid positive resultater kun angive subklinisk peritoneal metastase fordi den peritoneale metastaser er heller ikke emergente selvom tumorceller er til stede i den peritoneale væske. således detektion i peritoneale væv synes at være mere direkte og præcis. Bemærkelsesværdigt peritoneale væv dækker hele bughulen, mens tumorcelleimplantation er tilfældig, så direkte påvisning af tumorceller i peritoneale væv er meget vanskeligt. Molekylærbiologer mener, at der er nogle molekylære ændringer i selv-tumorceller og deres angrebne væv, og disse ændringer i væv kan indledes før tumorcellerne kontakte dem [9]. Baseret på dette koncept, vi undersøgte molekylære forandringer i peritoneale væv til at udforske potentialet diagnose af peritoneal metastaser.
CEA er en almindelig tumor-associeret antigen, og er accepteret internationalt som mave-tumormarkør [20, 21]. Derfor detekteres vi ekspressionen af ​​CEA i peritoneale væv. Positive CEA-ekspression resultater indikerer, at tumorceller er til stede i peritoneale væv. Som forventet viste vores resultater, at CEA blev udtrykt i alle de peritoneale metastatiske læsioner af syv peritoneal metastase patienter. Interessant, der var tre patienter med peritoneal metastase i hvem CEA var positivt udtrykt i nonperitoneal metastatiske væv og to patienter med nonperitoneal metastaser, som havde positiv CEA udtryk i normale peritoneale væv. Dette antyder, at disse patienter havde et potentiale for at udvikle peritoneal metastase
Da det indeholder vigtige proteolytiske enzymer, uPA-systemet i tumorceller er blevet påvist at vekselvirke med den ekstracellulære matrix for at lette mikromiljøet dannelsen af ​​metastaser.; således kan uPA systemet være involveret i processen med peritoneal metastase [22]. Ekspression af uPA-systemet viser sig at blive forøget i implanterede tumor og vært væv [23, 24]. UPA-systemet består af serinproteasen uPA, den glycolipid-forankrede receptor, uPAR, og serpin-inhibitor, PAI-1, [25]. Derfor vi havde til formål at undersøge, omfattende ændringer i disse tre faktorer i peritoneale væv med eller uden metastaser
uPA-systemet er vidt udbredt i forskellige celler.; vores RT-PCR viste, at uPA, uPAR, og PAI-1 selv kunne udtrykkes i mesotelceller. For at undgå uspecifikke resultater, blev yderligere kvantitativ ELISA anvendes til at detektere ekspression af UPA systemets proteiner. Vi fandt, at uPA, uPAR, og PAI-1 proteinindhold var signifikant højere i CEA-positive læsioner eller CEA-negative peritoneale væv af peritoneal metastase patienter sammenlignet med normale peritoneale væv af nonperitoneal metastase patienter (P
< 0,05) . Især kan der være større klinisk betydning i den øgede uPA systemet proteinindholdet i CEA-negative peritoneale væv af peritoneale metastase patienter. Dette fund viste, at disse CEA-negative peritoneale væv kan være i en tilstand af subklinisk peritoneal metastase og at progression af denne sygdom kan føre til peritoneal metastase. Selvom uPA systemændringer i peritoneale væv endnu ikke afgjort blevet påvist i tumorceller, ændringer i peritoneale væv mindst giver en referenceværdi for diagnosticering af peritoneal metastaser [26]. Heiss et al
. [27] finder, at uPAR kunne betragtes som en afhængig indeks for forudsigelse af mavekræft knoglemarven mikrometastase sammenlignet med cytokeratin (CK18). I denne undersøgelse uPAR proteinindhold var også signifikant højere hos CEA-negative peritoneale væv af peritoneal metastase patienter end i CEA-negative peritoneale væv af nonperitoneal metastase patienter (P
< 0,05). Kort sagt, foreslår vi, at øget uPAR og PAI-1 udtryk i peritoneale væv af nonperitoneal metastase patienter kan betragtes som en reference indikator for peritoneal metastaser.
Ved analyse af uPA aktivitet i mavekræft væv og deres ekstracellulære matrix, Okusa et al
. [28] rapport, at jo højere uPA aktivitet er signifikant associeret med tumorer med peritoneale metastaser og tumorer med dybere invasion i mavens væg. uPA produceret af stromaceller kan regulere cancercelleinvasion [29]. viste imidlertid vores resultater, at der ikke var signifikant forskel i uPA aktivitet mellem forskellige væv. Dette kan tilskrives den dynamiske aktivitet af uPA, som synes at være afhængig af de særlige cellulære miljøer og anfører, at det støder [30].
Konklusioner Salg Vores undersøgelse viser, at uPA systemekspression er betydeligt højere i peritoneale væv af peritoneal metastase patienter end i nonperitoneal metastase patienter. Dette udtryk forskel kan give en henvisning til diagnosticering af peritoneal metastaser. Der er dog stadig nogle begrænsninger i denne undersøgelse. Antallet af sager, der indgår i denne undersøgelse var temmelig små, primært fordi nogle patienter med peritoneal metastaser blev optaget i vores hospital mellem juli 2010 og december 2010. Vi forsøgte at fjerne indflydelsen af ​​dette problem ved at inkludere væv (herunder omentum majus, pelveoperitoneum, og diafragma bughinden) i denne undersøgelse. Yderligere undersøgelser med højere antal emner er stadig behov for at få klarere og mere overbevisende resultater
Forkortelser
CEA:.
Carcinoembryonalt antigen
DMEM:
Dulbeccos modificerede Eagles medium
ELISA:
enzymmaerket assay
GAPDH:
glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase
PCR:
Polymerase kædereaktion
RT:
Reverse transcriptase
RT-PCR:
Revers transkriptase polymerasekædereaktion
uPA:
Urokinase-plasminogenaktivator
uPAR:
urokinase-plasminogenaktivator receptor
erklæringer
Taksigelser
Vi takker følgende personer:. Xuehua Chen, som deltog i sekvensalignment og hjalp med at forberede manuskriptet. Vi anerkender også Yubao Ji, Yi Zhang, og Bin LV, der har bidraget til denne undersøgelse.
Forfattere 'originale indsendte filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 40001_2012_56_MOESM1_ESM.tif Forfatternes oprindelige fil til figur 1 40001_2012_56_MOESM2_ESM.tif Forfatternes oprindelige fil til figur 2 konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer, at de ikke har økonomiske eller ikke-økonomiske konkurrerende interesser.
Forfattere bidrag
YD og ZZ designet undersøgelsen, og udførte RT-PCR, ELISA, og aktivitet detektion med HZ og ZZhou. YD, MZ, og XW deltog i sekvensalignment og udarbejdet manuskriptet. ZZ været med til at gennemføre statistiske analyser. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• FOLFIRI som en anden linje behandling af patienter med docetaxel-forbehandlet mavekræft: en historisk cohort
• Påvisning af promotor hypermethylering af CpG øen E-cadherin i gastrisk kardial adenocarcinoma