Um modulador receptor de hidrocarboneto aromático seletiva 3,3-Diindolylmethane inibe a célula de câncer gástrico growth

A aril seletivo modulador receptor de hidrocarboneto 3,3'-Diindolylmethane inibe o crescimento de células de câncer gástrico da arte abstracta
Fundo
receptor de hidrocarboneto aromático (AhR) é um factor de transcrição activado por ligando associado a carcinogénese gástrica. 3,3'-Diindolylmethane (DIM) é um modulador selectivo AhR relativamente não-tóxico. Este estudo foi detectar os efeitos da DIM sobre o crescimento de células de câncer gástrico.
Métodos
SGC7901 de células de câncer gástrico foi tratado com DIM em diferentes concentrações (0,10,20,30,40,50 mmol /L) com ou sem um antagonista AhR, resveratrol. A expressão de Ahr e citocromo P4501A1 (CYP1A1), um gene alvo clássico de Ahr percurso, foram detectados por RT-PCR e transferência de Western; a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT, e as alterações no ciclo celular e apoptose foram analisados ​​por citometria de fluxo. Os resultados

de RT-PCR e Western-blot mostrou que, com o aumento da concentração de DIM, proteína AhR gradualmente diminuiu e expressão CYP1A1 aumentou, sugerindo que DIM ativada a via AhR e causou a translocação de AhR do citoplasma para núcleo. ensaio MTT indicaram que a viabilidade das células foi SGC7901 diminuiu significativamente de uma forma dependente da concentração e do tempo após o tratamento DIM e isto pode ser parcialmente revertida por resveratrol. A citometria de fluxo mostrou que a análise DIM preso ciclo celular em fase G1 e apoptose celular induzida.
Conclusão
modulador selectivo do receptor de hidrocarboneto de arilo 3,3'-Diindolylmethane inibe a proliferação celular através da indução de apoptose SGC7901 e retardar a progressão do ciclo celular. AhR pode ser um potencial alvo terapêutico para o tratamento do câncer gástrico.
Palavras-chave
receptor de hidrocarboneto aromático 3,3'-Diindolylmethane gástrica câncer citocromo P4501A1 fundo
O câncer gástrico é um dos malignidade mais comum. Nos países economicamente desenvolvendo, câncer gástrico é o segundo câncer mais frequntly diagnosticados ea terceira principal causa de morte por câncer em homens [1], a taxa de sobrevida global em 5 anos é baixa (15% a 35%), devido à alta recorrência taxas, metástase nodal ea resposta curta duração à quimioterapia [2]. No presente, mais e mais estudos se concentrar no diagnóstico molecular e terapia do câncer gástrico [3].
Receptor de hidrocarboneto aromático (AhR) é um factor de transcrição activado por ligando. Depois de ligantes, tais como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH) e hidrocarbonetos halogenados (HAH) se ligam com AhR no citoplasma, o complexo ligando-AhR é translocado para o núcleo e heterodimerizes com o translocator nuclear AhR (ARNT). O complexo liga-se à sequência potenciadora cognato e subsequentemente activa a expressão de genes a jusante [4].
Estudos tradicionais de função AhR focado no seu papel na regulação da expressão de enzimas metabolizadoras de xenobióticos (XMEs) e mediar o metabolismo xenobióticos. Estudos recentes demonstraram que a Ahr pode envolver, em muitos processos fisiológicos e patológicos importantes incluindo o desenvolvimento individual, a diferenciação celular, e carcinogénese [5]. Ahr expressão é regulada positivamente nos pulmões [6], glândula mamaria [7], do pâncreas [8] e cancros gástricos [9]. Outros estudos descobriram que AhR desempenharam papéis improtant na regulação celular proliferação, apoptose, ciclo celular, migração e invasão [10]. Como uma proteína relacionada com o cancro, talvez AhR um alvo promissor para a terapia do cancro. O nosso trabalho anterior constatou que um agonista de Ahr, 2,3,7,8 -tetrachlorodibenzo -para-dioxina (TCDD), inibiu o crescimento de células de cancro gástrico [9]. Mas a própria TCDD é cancerígenos moduladores AhR [11], Então, para encontrar não-tóxico ou de baixo tóxicas pode ser uma nova direção para a terapia molecular-alvo no cancro gástrico.
Modulador selectivo do receptor de AhR 3,3'-Diindolylmethane (DIM ) é uma classe de derivados de Índole relativamente não-tóxicos. DIM é um produto consendation catalyed-ácido de indole-3-carbinol, um consititudent de vegetais crucíferos, e é formada no estômago [12]. DIM é um agente anti-câncer, ele suprime a proliferação de células cancerosas no mamária [13], cólon [14] e pancreáticas [15] cânceres.
Tinha havido pouca relatórios sobre os efeitos da DIM sobre o crescimento de células de câncer gástrico, o Este estudo foi projetado para observar os efeitos da DIM sobre o crescimento de células de câncer gástrico e explorar os possíveis mecanismos.
Métodos
linha celular
linha de células de câncer gástrico humano SGC7901 foi obtida a partir do Instituto do câncer da Academia chinesa de Medicina Ciência. SGC7901 As células foram mantidas em meio RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, Califórnia, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, EUA), 1 × 10 5 U /L de penicilina e 0,1 g /L de gentamicina. O meio celular foi mantida a 50 G ml de CO2 /e 37 ° C. O tratamento de células

DIM foi adquirido a empresa Enzo Life Science (Plymouth Meeting Bulter Pike, PA, EUA), o resveratrol e sulfóxido de dimetilo (DMSO ) foram adquiridos da Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, EUA). DIM e resveratrol foram dissolvidos em DMSO. Após incubação durante 24 h, um grupo de células foi tratado com DIM em diferentes concentrações (0, 10, 20, 30, 40, 50 umol /L) durante 24 horas. Um segundo grupo foi tratado com DIM (30 umol /L) mais o resveratrol (0, 1, 5, 10, 20 umol /L) durante 6 h. Um outro grupo foi tratado com DIM (30 mmol /L) para diferentes intervalos de tempo (0, 1, 6, 24, 48, 72 h), respectivamente. As células de controlo recebeu 1 mL /L de apenas DMSO.
reverso reacção em cadeia de polimerase (RT-PCR)
Após colheita das células, o ARN total foi extraído utilizando o kit Qiagen RNeasy Mini (Qiagen, Alemanha) de acordo com a as instruções do fabricante. O ADNc foi sintetizado com ARN total de 1 ug utilizando transcriptase reversa, ReverTraAceTM (Toyobo Co., Osaka, Japão), sob as seguintes condições: 30 ° C durante 10 min, 42 ° C durante 20 min, 99 ° C durante 5 min, e quatro ° C durante 5 min. reacção em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada usando 2 ul de ADN complementar e a polimerase de 0,6 L Ex Taq ADN (Takara, Dalian, China) em sistema de reacção de 20 ul e durante 30 ciclo com 94 ° C desnaturação durante 30 s, 55 ° C, recozimento . durante 30 s e 72 ° C, alongamento durante 45 s
As sequências dos iniciadores eram as seguintes: reacção em cadeia com transcrição reversa da polimerase (RT-PCR): Ahr, 5'-ACT CCA CCA CCA CAG CTT TC -3 '( para a frente) e 5'- ATG GGA CTC GGC ACA ATA AA -3 '(reverso), o tamanho proposto de produto da PCR foi de 204 pb. CYP1A1, 5'- CCA TGT CGG CCA CGG AGT T-3 '(para a frente) e 5'-ACA GTG CCA GGT GCG GGT T -3' (reverso), o proposedsize de produto da PCR foi de 174 pb. O gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), 5'- GGG AAA TGG CTG CGT GAT -3 '(directo) e 5'-AAA GGT GGA GGA GTG GGT -3' (reversa), o tamanho prospectada de produto de PCR era 309 pb. Os produtos de PCR foram subsequentemente sujeitas a electroforese em um gel de agarose a 1,5%, e visualizados sob um transiluminador de UV.
análise de Western blot
As células foram lisadas em tampão contendo 20 mmol /L de HEPES, 1 mmol /L de EGTA, 50 mmol /L β-glicerofosfato, 2 mmol /L de ortovanadato de sódio, 100 mL /L de glicerol, 10 ml /l de Triton X-100, 1 mmol /l de DTT, e 1 × Cocktail de Inibidor de Protease (Roche, Mannheim, Alemanha). O lisado foi centrifugado a 13 000 g e 4 ° C durante 10 min. O sobrenadante foi o lisado de células totais. A concentração de proteínas foi medida utilizando o kit de ensaio de proteína BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, EUA). Trinta microgramas de proteína foi carregada por pista, separados por 100 g /L de SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de difluoreto de polivinilideno equilibrada por electrotransferência. As membranas foram bloqueadas com leite magro a 5% em tampão de 1% de TBS-T, durante 2 h à temperatura ambiente. AhR, CYP1A1, e GAPDH foram detectados durante 2 h utilizando anticorpos contra AhR (SC-5579, Santa Cruz Biotechnology, EUA, diluição de trabalho 1: 150), CYP1A1 (AB1258, Chemicon International, EUA, a diluição de trabalho 1: 500), e GAPDH (2118, Cell Signaling Technology, EUA, diluição de trabalho 1: 1000). Após incubação do anticorpo secundário (7074, Cell Signaling Technology, EUA, trabalhando diluição 1: 2000) durante 2 h, as bandas de proteína foram detectadas utilizando o sistema ECL (Pierce Biotechnology, Inc., EUA)
ensaio de viabilidade celular in the. efeito de DIM sobre a proliferação de células de cancro gástrico foi determinada por ensaio MTT. Em resumo, um total de 1 x 10 4 células dispersas com tripsina em 0,1 mL de meio de cultura foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços e cultivadas durante 24 horas. Em seguida, as células foram tratadas com DIM como descrito acima. Em seguida, 20 ul de MTT (5 g /L) foi adicionado a cada poço e a incubação foi continuada durante 4 h a 37 ° C. Finalmente, o meio de cultura foi removido e 150 ul de DMSO foi adicionado a cada poço. A absorvância foi determinada com um leitor de ELISA a 490 nm. A percentagem de viabilidade celular foi calculada como:. Percentagem de viabilidade (%) = (valor de absorção de grupo de ensaio) /(valor de absorção de grupo de controlo) × 100%
análise de citometria de fluxo
SGC7901 células foram plaqueadas em 60 mm placas de cultura de diâmetro e tratada com DIM em diferentes concentrações (10, 20, 30, 40, 50 umol /L) durante 48 h. O controlo continha apenas 1 mL /L de DMSO. Antes da colheita, as células foram lavadas duas vezes com
0,01 mol /L de PBS, tripsinizadas, e peletizada. As células foram então fixadas com etanol a 70% arrefecido em gelo a 4 ° C durante a noite. Finalmente, as células foram lavadas duas vezes com PBS e coradas com PI. O teor de ADN foi analisada com um citómetro de fluxo (Beckman-Coulter, Brea, EUA). O ciclo celular de SGC7901 células foram analisadas usando software de MULTYCYCLE e winMDI2.9 (Phoenix, AZ, EUA). Para a análise da apoptose celular, após incubação durante 48 h, as células foram coradas com anexina V-FITC e PI. As células com anexina V (-) e PI (-) foram consideradas células viáveis. As células com anexina V (+) e PI (-) foram consideradas células apoptóticas precoce. As células com ambos anexina V (+) e PI (+) foram consideradas células final apoptóticos.
Análise estatística
Todos os dados quantitativos foram expressos como média ± SD e analisados ​​utilizando uma análise de uma via de variância (ANOVA). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote de software estatístico SPSS (versão 11.0, SPSS Inc. Chicago, EUA). P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
Ativação de AhR via pela DIM
Para testar se o sinal via AhR poderia ser ativada por DIM, que tratou o SGC7901 linha de células de câncer gástrico com DIM. RT-PCR e análise de Western blot mostrou que após o tratamento DIM, AHR em proteína dos lisados ​​celulares totais diminuiu gradualmente (Figura 1). CYP1A1, um gene alvo clássico de Ahr, foi utilizada como um indicador de Ahr activação da via de sinal. O nível basal de expressão de CYP1A1 não foi observado em células SGC7901, mas ambos os ARNm de CYP1A1 e a expressão da proteína foram aumentadas de um modo dose e dependente do tempo após o tratamento DIM (Figura 1). Para confirmar ainda mais a expressão de CYP1A1 induzida por DIM foi AhR-dependente, nós tratamos SGC7901 células com um antagonista AhR específico, resveratrol [16, 17]. As células foram tratadas com DIM (30 umol /L), apenas ou DIM (30 umol /L) mais concentrações diferentes de resveratrol (0, 1, 5, 10, 20 umol /L), respectivamente, durante 6 h (Figura 2). Em concordância com os resultados anteriores, o tratamento de células SGC7901 com 30 mmol /L DIM causou um notável aumento na expressão de CYP1A1. No entanto, esta expressão induzida por CYP1A1 DIM foi parcialmente revertida pelo resveratrol de um modo dependente da dose (Figura 2A e B). Figura 1 AhR e expressão CYP1A1 em SGC7901 células após o tratamento DIM. A e B: RT-PCR; C e D: Western blotting. O tratamento de células com SGC7901 AhR modulador DIM resultou em tempos de - (A e C) e dependente da concentração (B e D) indução da expressão de CYP1A1. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes.
Figura 2 Inibição de DIM induzida de ARNm de CYP1A1 e a expressão da proteína pelo resveratrol. A: CYP1A1 ARNm foi detectada por RT-PCR; B: proteína CYP1A1 foi detectada por transferência Western. RSV: resveratrol. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes. Tratamento de SGC7901 células com 30 mmol /L DIM causou um notável aumento na expressão de CYP1A1. Esta expressão de CYP1A1 foi induzida pelo DIM parcialmente revertida pelo resveratrol de um modo dependente da concentração.
Efeito sobre a proliferação de DIM cellur
Proliferação de SGC7901 células foi determinada por ensaio MTT após 6-72 h de tratamento com concentrações crescentes de DIM (0-50 umol /L). Os resultados mostraram que o DIM SGC7901 inibiu a proliferação celular de um modo da sua concentração e tempo-dependente, resveratrol (10 umol /L) pode parcialmente reverter os efeitos de inibição de dim (30 umol /L) sobre a proliferação cellur nos pontos de tempo: de 6 h e 12 h (Figura 3), mas não encontramos os efeitos de reversão em outros pontos de tempo (24 h, 48 h e 72 h, os dados não foram apresentados). Figura 3 viabilidade das células após o tratamento SGC7901 DIM foi avaliada pelo ensaio de MTT. A viabilidade das células foi SGC7901 diminuiu significativamente de uma forma dependente da concentração e do tempo após o tratamento DIM. O resveratrol (10 umol /L) pode parcialmente reverter os efeitos de inibição de dim (30 umol /L) sobre a proliferação cellur.
Efeito de DIM no ciclo celular
análise citométrica de fluxo revelaram que o tratamento DIM mudanças na distribuição de ciclo celular induzida , com o aumento da acumulação de SGC7901 células na fase G1 e compensação para esta mudança por uma redução de células na fase S (Figura 4 e Tabela 1). Figura 4 O efeito de DIM no ciclo celular de células SGC7901. SGC7901 células foram tratadas com diferentes concentrações de DIM e submetidas a análise citométrica de fluxo. A percentagem de cada fase é indicado em cada painel. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes.
Tabela 1 O efeito de DIM no ciclo celular de células SGC7901
DIM concentração (mol /L)
Percentagem de ciclo celular (%)

G1
G2
S
0
55,90 ± 1,48
10,5 ± 0,95
33,63 ± 0,55
10
57,20 ± 0,36 *
9,10 ± 0,3
33,70 ± 0,53
20
61,03 ± 1,53 *
8,17 ± 0,68
30,77 ± 0,97 *
30
61,97 ± 0,32 *
9,83 ± 0,32
28,23 ± 0,60 *
40
62,77 ± 1,46 *
9,13 ± 0,91
28,10 ± 0,56 *
50
73,03 ± 4,05 *
9,17 ± 1,51
18,07 ± 0,57 *
* p < 0,05, vs controlo.
Efeito de DIM na apoptose de células
48 h após o tratamento DIM, as alterações de apoptose celular foram observadas por análise de citometria de fluxo. Em comparação com o grupo de controlo, foi induzida a apoptose das células em concentrações de 20 a 50 mmol /L, e a taxa de apoptose aumentou de uma forma dependente da dose. Estes resultados mostraram que o DIM poderia induzir apoptose celular em células SGC7901 (Figura 5 e Tabela 2). Figura 5 O efeito da DIM na apoptose de células SGC7901. SGC7901 células foram tratadas com diferentes concentrações de DIM e submetidas a análise citométrica de fluxo. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes.
Tabela 2 O efeito do DIM na apoptose de células SGC7901
DIM concentração (mmol /L)
a taxa de apoptose (%)

0
4,18 ± 0,23
10
4,81 ± 0,42
20
6,07 ± 0,33 *
30
7,23 ± 0,78 #
40
7,39 ± 1,08 #
50
9,14 ± 0,32 #
* p < 0,05, # p < 0.01vs o controlo.

Discussão O trabalho anterior constatou que a expressão de Ahr foi significativamente sobre-regulada no cancro gástrico, e pode estar envolvido na fase precoce da carcinogénese gástrica, regulação da via pode ter um AhR papel potencial no tratamento do cancro gástrico. Colocámos a hipótese de que ligandos AhR podem ser utilizados para a terapia do cancro gástrico. Em seguida, os nossos estudos mostraram que a TCDD futher, um agonista potente Ahr, poderia supresse o crescimento de células de cancro gástrico AGS de uma maneira dose e tempo-depengent através da indução da paragem do crescimento na fase G1-S [9]. Mas a própria TCDD é cancerígeno, induz um amplo espectro de respostas biológicas, incluindo a indução da CYP1A1, a interrupção das vias normais de sinalização hormonal, reprodutiva e defeitos de desenvolvimento, a imunotoxicidade, danos no fígado, desperdiçando síndrome, e câncer [18], de modo não-tóxico ou moduladores de baixo-toxic AhR seletivos talvez serviu como possíveis agentes para câncer gástrico
a partir dos estudos em câncer de mama, Seguro encontrados duas classes de moduladores seletivos AhR:. Alternate-substituídos (1,3,6,8- e 2, 4,6,8-) dibenzofuranos policlorados (PCDF alquilo) e diindolylmethanes substituídos (escurece), em comparação com a TCDD, estes compostos são relativamente não-tóxicos e inibir ER-positivo e ER-negativo do crescimento do tumor da mama, mas não induzem AhR- respostas mediadas tóxicos induzidos por TCDD [19].
DIM representa uma nova classe de moduladores AhR antitumorigénico relativamente não-tóxicos que são de origem fitoquímicos. Em comparação com a TCDD, DIM é um fraco agonista de Ahr para a indução da expressão do gene CYP1A1 [20] e as actividades de [21], e que mostra capacidade para competir para a ligação de TCDD a Ahr [22]. Para testar
meteorológicas o via de sinal AhR poderia ser Activited por DIM em células cancerosas gástricas, nós tratados gástrica linha SGC7901 célula cancerosa com DIM. Os resultados mostraram que a proteína AHR em lisados ​​celulares totais diminuiu gradualmente (Figura 4C e D), fenómenos semelhantes foram relatadas pelos nossos laboratórios e vários outros grupos [9, 23], a sub-regulação de Ahr ligando que se segue a ligação é considerado como um etapa imprtant de sinal via AhR [23]. CYP1A1, um gene alvo clássico de Ahr, foi escolhido como um indicador de Ahr activação da via de sinal. Os níveis basais de expressão CYP1A1 não foram observados nos SGC7901 células no presente estudo. No entanto, a expressão de CYP1A1 foi significativamente aumentada de uma maneira dependente da concentração e do tempo após o tratamento DIM, que indica a activação de Ahr. Para confirmar a activação da via de sinal AhR por DIM, que tratada SGC7901 células com um antagonista específico Ahr, o resveratrol. Os nossos resultados mostraram que o DIM induzida por expressão de CYP1A1 foi parcialmente revertida por resveratrol em uma maneira dependente da concentração. A inversão incompleta de expressão de CYP1A1 por o resveratrol pode ser devido ao facto de Ahr não é o único regulador da transcrição do gene CYP1A1 [24]. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o DIM pode activar a via de sinal AHR em células de cancro gástrico. Ensaio MTT
demonstrado que a viabilidade das células foi SGC7901 diminuiu significativamente de uma forma dependente da concentração e do tempo após o tratamento DIM. Para esclarecer melhor wether estes efeitos foi AhR- dependente, nós tratamos SGC7901 células com DIM e resveratrol, descobrimos que os efeitos de inibição de DIM no crescimento SGC7901 células era parcialmente, mas não completamente reservado pelo reservatrol, sugerindo que DIM inibe o crescimento de células de câncer gástrico parcialmente via AhR via. Este resultado está de acordo com estudos anteriores: Hong, C descobriu que DIM inibiu o crescimento de ambas as células cancerosas da mama Ah-responsivos e Ah-não-responsivos. algumas das actividades anti-cancerígenos de DIM são AhR independente de [25]. Curiosamente, foi observado o efeito de inversão na proliferação de células após as células foram tratadas com DIM mais reservatrol durante 6 h ou 12 h, mas não em pontos de tempo mais longos (24 h, 48 h e 72 h), que pode estar relacionado com o tempo de eficácia de reservatrol.
Houve alguns estudos sobre os machanisms anti-câncer de DIM. Choi HJ mostrou que DIM induzida G1 e G2 /M parada do ciclo celular fase HT-29 células cancerígenas do cólon humano [26]. Vivar OI e Hong C encontrados DIM induziu uma G (1) prisão em células humanas de câncer de próstata [27] e células de cancro da mama humanos [28]. Por outro lado, alguns artigos relatam que o DIM podem promover a apoptose em células cancerosas através da survivina, uPA e uPAR ou NF-kappaB sinaling [29-33].
Para explorar melhor os mecanismos específicos de inibição do crescimento de células de cancro gástrico por DIM , nós tratamos SGC7901 células com DIM, em seguida, testadas as alterações do ciclo celular e apoptose celular por análise de citometria de fluxo. Os resultados mostraram que, com o aumento da concentração de DIM, as células em fase G1 gradualmente aumentada, as células em fase S diminuiu, mas as células em fase G2 permaneceu inalterada, indicando que o DIM poderia paragem do ciclo celular na fase G1. Diferente de TCDD, DIM apoptose celular também induzido, sugerindo que DIM poderia suprimir a proliferação de células de câncer gástrico através de indução de apoptose e prendendo ciclo celular, no entanto, os mecanismos responsáveis ​​pelos efeitos da DIM no ciclo celular câncer gástrico e apoptose são ainda precisava de ser mais estudada.
Conclusões Online em surmary, este relatório mostrou que não tóxica seletiva AhR modulador DIM inibiu a proliferação de linha celular de cancro gástrico humano SGC7901 in vitro através da indução de apoptose de células e prendendo ciclo celular na fase G1. Nossos achados sugerem que AhR pode ser um alvo promissor para o tratamento do câncer gástrico
Notas
Xiao-Fei Yin, Jie Chen contribuiu igualmente para este trabalho
abreviações
AhR:..
receptor de hidrocarboneto aromático
GAPDH:
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase
RT-PCR:
transcrição reversa -polimerase Chain Reaction
MTT:
metil tiazolil tetrazólio
DMSO:
Dimetilsulfóxido
FBS: soro fetal bovino
TCDD:
2,3,7,8-tetracloro-para-dioxina
TBST:
salina contendo 0,05% de Tween 20. Tris
declarações
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelos subsídios da National Science Foundation Natural da China (No. 30871145 e nº 81072048), o Projeto Cultivo Professor Júnior, da Universidade Sun Yat-sen (No. 09ykpy22), subsídios para grandes projectos e emergentes estudos interdisciplinares de Sun Yat-sen University (No.10ykjc23) apoiados pelos Fundos investigação fundamental para Universidades Central.
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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes contribuições
dos autores
Yin XF e Chen J contribuíram igualmente para este trabalho.; Yin XF e Chen J realizado pesquisas e escreveu o papel; Mao W organizados os dados e analisaram dados; Wang YH assistida com cultura de células. Chen MH concebido pesquisa e supervisionou o processo de escrita e organização. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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