Een selectieve arylkoolwaterstofreceptor modulator 3,3-Diindolylmethane remt de groei van maagkanker cel

Een selectieve arylkoolwaterstof receptor modulator 3,3'- Diindolylmethane maag remt de groei van kankercellen
Abstract achtergrond
arylkoolwaterstofreceptor (AhR) een ligand geactiveerde transcriptiefactor geassocieerd met maagkanker. 3,3-Diindolylmethane (DIM) is een relatief niet-toxisch selectieve AhR modulator. Deze studie was om de effecten van DIM op gastrische kanker celgroei gedetecteerd.
Methods
Maagkanker cel SGC7901 werd met DIM in verschillende concentraties (0,10,20,30,40,50 umol /L) met of zonder AhR antagonist, resveratrol. De expressie van AhR en cytochroom P4501A1 (CYP1A1), een klassieke doelgen AhR pathway werden gedetecteerd met RT-PCR en Western blot; cellevensvatbaarheid werd bepaald door MTT assay, en de veranderingen in de celcyclus en apoptose werd geanalyseerd door flow cytometrie.
Resultaten
RT-PCR en Western-blot toonde aan dat met de toename van de concentratie van DIM, AhR eiwitten geleidelijk gedaald en CYP1A1 expressie toegenomen, wat suggereert dat DIM geactiveerd AhR de route en de oorzaak van de translocatie van AhR van cytoplasma naar de kern. MTT-test gaf aan dat de levensvatbaarheid van cellen aanzienlijk SGC7901 een concentratie- en tijdsafhankelijke wijze was verminderd na behandeling DIM en dit kan gedeeltelijk omgekeerd door resveratrol. Flowcytometrie analyse toonde aan dat DIM gearresteerd celcyclus in G1-fase en geïnduceerde apoptose.
Conclusie
Selectieve arylkoolwaterstofreceptor modulator 3,3-Diindolylmethane remt SGC7901 celproliferatie door het induceren van apoptose en het uitstellen van voortgang van de celcyclus. AhR een potentieel therapeutisch doel voor de maag kankerbehandeling.
Sleutelwoorden
arylkoolwaterstofreceptor 3,3'- Diindolylmethane Maagkanker cytochroom P4501A1 Achtergrond
Maagkanker is een van de meest voorkomende maligniteit. In de economisch ontwikkelen landen, maagkanker is de tweede meest frequntly diagnose kanker en de derde belangrijke oorzaak van kanker overlijden bij mannen [1], de totale 5-jaarsoverleving is laag (15% tot 35%) als gevolg van de hoge herhaling prijzen, knooppunten metastase en de kortstondige reactie op chemotherapie [2]. In de huidige, steeds meer studies gericht op de moleculaire diagnose en therapie van maagkanker [3].
Aryl koolwaterstof receptor (AhR) een ligand geactiveerde transcriptiefactor. Na liganden zoals polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAH) en gehalogeneerde koolwaterstoffen (HAH) binden met AhR in cytoplasma, is het ligand-AhR complex translocatie naar de kern en een heterodimeer met de AhR nucleaire translocator (ARNT). Het complex bindt aan de verwante enhancersequentie en vervolgens activeert stroomafwaartse genexpressie [4].
Traditionele studies AhR functie gericht op de rol in het reguleren van de expressie van xenobiotische metaboliserende enzymen (XMEs) en medieert de xenobiotica metabolisme. Recente studies hebben aangetoond dat AhR veel belangrijke fysiologische en pathologische processen kunnen omvatten zoals individuele ontwikkeling, celdifferentiatie en carcinogenese [5]. AhR expressie is opgereguleerd in de longen [6], borstklier [7], alvleesklier [8] en maagkanker [9]. Verdere studies bleek dat AhR gespeeld improtant rol bij het reguleren van celproliferatie, apoptose, celcyclus, migratie en invasie [10]. Als een eiwit in verband met kanker, AhR misschien een veelbelovend doelwit voor kankertherapie. Onze vorige werk gevonden dat een AhR agonist, 2,3,7,8 -tetrachlorodibenzo para-dioxine (TCDD), remde de maag de groei van kankercellen [9]. Maar TCDD zelf kankerverwekkend is [11], dus op zoek naar niet-toxische of lage-toxische AhR modulators kan een nieuwe richting voor moleculair-gerichte therapie bij maagkanker zijn.
Selectieve AhR receptor modulator 3,3-Diindolylmethane (DIM ) is een klasse van relatief niet-toxisch indoolderivaten. DIM een zuur-catalyed consendation product van indool-3-carbinol, een consititudent van kruisbloemige groenten, en wordt gevormd in de maag [12]. DIM is een anti-kankermiddel, onderdrukt kankercelproliferatie mammae [13], colon [14] en alvleesklier [15] kankers.
Er was weinig verslagen over de effecten van DIM op maagkanker cellen groei geweest, de Deze studie werd ontworpen om de effecten van DIM op maagkanker cellen de groei van de mogelijke mechanismen te observeren en te verkennen.
Methods
cellijn
Human maagkanker cellijn SGC7901 werd verkregen van het Cancer Institute van de Chinese Academie van Medische Wetenschap. SGC7901 cellen werden in RPMI-1640-medium gehouden (GIBCO, Carlsbad, CA, USA) aangevuld met 10% foetaal runderserum (Hyclone, USA), 1 x 10 5 U /l penicilline en 0,1 g /l gentamycine. De cellulaire omgeving werd
bij 50 ml /l CO2 en 37 ° C gehouden. De behandeling van de cellen
DIM werd gekocht van Enzo Life Science bedrijf (Bulter Pike Plymouth Meeting, PA, USA), resveratrol en dimethylsulfoxide (DMSO ) werden gekocht bij Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, USA). DIM en resveratrol werden opgelost in DMSO. Na incubatie gedurende 24 uur, werd een groep van cellen behandeld met DIM in verschillende concentraties (0, 10, 20, 30, 40, 50 umol /L) gedurende 24 uur. Een tweede groep werd behandeld met DIM (30 umol /L) plus resveratrol (0, 1, 5, 10, 20 umol /l) gedurende 6 uur. Een andere groep werd behandeld met DIM (30 umol /l) gedurende verschillende tijdstippen (0, 1, 6, 24, 48, 72 uur), respectievelijk. Controlecellen kregen 1 ml /L DMSO alleen.
Omgekeerde transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR)
Na het oogsten van de cellen werd totaal RNA geëxtraheerd met behulp van de Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Duitsland) volgens de fabrikant. cDNA werd gesynthetiseerd met 1 ug totaal RNA met behulp van reverse transcriptase, ReverTraAceTM (Toyobo Co., Osaka, Japan) onder de volgende omstandigheden: 30 ° C gedurende 10 min, 42 ° C gedurende 20 min, 99 ° C gedurende 5 min en 4 ° C gedurende 5 minuten. Polymerase kettingreactie (PCR) werd uitgevoerd onder toepassing van 2 pl complementaire DNA en 0,6 U Ex Taq DNA polymerase (Takara, Dalian, China) in 20 pl reactiesysteem en 30 cyclus bij 94 ° C denaturatie gedurende 30 s, 55 ° C annealing . 30 s en 72 ° C gedurende 45 s elongatie Ondernemingen De primersequenties waren als volgt: reverse transcriptie-polymerase ketenreactie (RT-PCR): AhR, 5'-ACT CAG CCA CTT CCA CCA TC -3 '( forward) en 5'-ATG GGA CTC GGC ACA ATA AA-3 '(omgekeerde), de voorgestelde omvang van de PCR-product was 204 bp. CYP1A1, 5'-CCA TGT CGG CCA CGG AGT T -3 '(vooruit) en 5'-ACA GTG CCA GGT GCG GGT T-3' (omgekeerde), de proposedsize van PCR-product was 174 bp. Glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH), 5'-GGG AAA CTG TGG CGT GAT -3 '(voorwaarts) en 5'- AAA GGT GGA GGA GGT GTG -3' (omgekeerde), verkenden de grootte van PCR-product was 309 bp. PCR producten werden vervolgens aan elektroforese onderworpen op een 1,5% agarosegel, en gevisualiseerd onder UV transilluminator.
Western blotanalyse
Cellen werden gelyseerd buffer bevattende 20 mmol /L HEPES, 1 mmol /L EGTA, 50 mmol /L β-glycerofosfaat, 2 mmol /L natriumorthovanadaat, 100 ml /l glycerol, 10 ml /l Triton X-100, 1 mmol /L DTT en 1 x Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim, Duitsland). Het lysaat werd gecentrifugeerd bij 13 000 g en 4 ° C gedurende 10 minuten. Het supernatant was het totale cellysaat. De eiwitconcentratie werd gemeten met de BCA eiwit assay kit (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA). Dertig microgram eiwit werd geladen per baan gescheiden door 100 g /l SDS-PAGE en op evenwicht gebracht polyvinylideendifluoridemembraan overgebracht door electroblotting. Membranen werden geblokkeerd met 5% magere melk in 1% TBS-T buffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. AhR, CYP1A1, en GAPDH werden gedetecteerd gedurende 2 uur met behulp van antilichamen tegen AhR (SC-5579, Santa Cruz Biotechnology, de VS, het werken verdunning 1: 150), CYP1A1 (AB1258, Chemicon International, USA, het werken verdunning 1: 500), en GAPDH (2118, Cell Signaling Technology, USA, het werken verdunning 1: 1000). Na secundair antilichaam incubatie (7074, Cell Signaling Technology, USA, werken verdunning 1: 2000) gedurende 2 uur werden eiwitbanden gedetecteerd met ECL systeem (Pierce Biotechnology, Inc., USA)
Cellevensvatbaarheid assay
. DIM effect op de proliferatie van maagkanker cellen werd bepaald door MTT-bepaling. Kort samengevat, in totaal 1 x 10 4-trypsine gedispergeerde cellen in 0,1 ml kweekmedium geënt in elk putje van een 96-well plaat en gekweekt gedurende 24 uur. Vervolgens werden de cellen behandeld met DIM zoals hierboven beschreven. Vervolgens 20 ui MTT (5 g /l) werd aan elk putje toegevoegd en de incubatie werd gedurende 4 uur voortgezet bij 37 ° C. Tenslotte werd het kweekmedium verwijderd en 150 pl DMSO toegevoegd aan elke well. De absorptie werd bepaald met een ELISA reader bij 490 nm. De levensvatbaarheid van de cellen werd berekend als percentage. Levensvatbaarheid percentage (%) = (absorptiewaarde van experimentgroep) /(absorptiewaarde van controlegroep) x 100%
Flow cytometrische analyse
SGC7901 cellen werden uitgeplaat op 60-mm diameter kweekplaten en behandeld met DIM in verschillende concentraties (10, 20, 30, 40, 50 umol /L) gedurende 48 uur. De controle bevatte slechts 1 mL /L DMSO. Vóór de oogst werden de cellen tweemaal met
0,01 mol /L PBS, getrypsiniseerd en gepelletiseerd gewassen. De cellen werden vervolgens gefixeerd met 70% ijskoude ethanol bij 4 ° C overnacht. Tenslotte werden de cellen tweemaal gewassen met PBS en gekleurd met PI. Het DNA-gehalte werd geanalyseerd met een stroomcytometer (Beckman-Coulter, Brea, USA). De celcyclus van SGC7901 cellen werden geanalyseerd met MULTYCYCLE en winMDI2.9 software (Phoenix, AZ, USA). Voor apoptose-analyse, na incubatie gedurende 48 uur werden de cellen gekleurd met annexine V-FITC en PI. Cellen met annexine V (-) en PI (-) geacht levensvatbare cellen. Cellen met annexine V (+) en PI (-) geacht vroege apoptotische cellen. Cellen met zowel annexine V (+) en PI (+) geacht late apoptotische cellen Statistische analyse Leer Alle kwantitatieve gegevens.
Werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD en geanalyseerd middels een variantieanalyse (ANOVA). Alle statistische analyses werden met behulp van de SPSS statistische softwarepakket uitgevoerd (versie 11.0, SPSS Inc. Chicago, USA). P < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
Activering van AhR route door DIM
Om te testen of het AhR signaalroute kan worden geactiveerd door DIM, behandelden wij de maagkanker cellijn SGC7901 met DIM. RT-PCR en Western-blot-analyse toonde aan dat na behandeling DIM, AhR eiwitten in totale cellysaten geleidelijk af (figuur 1). CYP1A1, een klassieke doelgen AhR werd toegepast als een indicator van AhR signaalroute activeren. Het basisniveau van de CYP1A1-expressie werd niet waargenomen in SGC7901 cellen, maar zowel CYP1A1 mRNA en eiwitexpressie verhoogd op een dosis- en tijdsafhankelijke wijze na behandeling DIM (figuur 1). Om de DIM-geïnduceerde CYP1A1 expressie verder te bevestigen was AhR-afhankelijke, we behandeld SGC7901 cellen met een specifieke AhR antagonist, resveratrol [16, 17]. cellen werden behandeld met DIM (30 umol /l) in of DIM (30 umol /L) plus verschillende concentraties resveratrol (0, 1, 5, 10, 20 umol /L), respectievelijk 6 uur (figuur 2). In overeenstemming met eerdere resultaten, de behandeling van SGC7901 cellen met 30 micromol /l DIM veroorzaakte een opmerkelijke toename van de CYP1A1 expressie. Echter, was dit DIM-geïnduceerde CYP1A1 expressie gedeeltelijk omgekeerd door resveratrol in een dosisafhankelijke wijze (figuur 2A en B). Figuur 1 AhR en CYP1A1 expressie in SGC7901 cellen na DIM behandeling. A en B: RT-PCR; C en D: Western blotting. Behandeling van cellen met SGC7901 AhR modulator DIM tot een tijd - (A en C) en concentratie afhankelijke (B en D) inductie van CYP1A1 expressie. De getoonde resultaten zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten.
Figuur 2 Remming van DIM geïnduceerde CYP1A1 mRNA en eiwitexpressie door resveratrol. A: CYP1A1 mRNA werd gedetecteerd met RT-PCR; B: CYP1A1-eiwit werd gedetecteerd door Western blotting. RSV: resveratrol. De getoonde resultaten zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. Behandeling van SGC7901 cellen met 30 umol /L DIM veroorzaakte een opmerkelijke toename van CYP1A1 expressie. Dit DIM geïnduceerde CYP1A1-expressie werd gedeeltelijk omgekeerd door resveratrol in een concentratie-afhankelijke wijze.
Effect van DIM op cellur proliferatie
SGC7901 Proliferatie van de cellen werd bepaald door MTT-bepaling na 6-72 uur behandeling met toenemende concentraties DIM (0-50 micromol /l). De resultaten toonden aan dat DIM remde SGC7901 cellulaire proliferatie in een concentratie- en tijdsafhankelijke manier, Resveratrol (10 micromol /l) kan de remming effecten van DIM (30 umol /L) op cellur proliferatie gedeeltelijk te keren op het moment punten: 6 uur en 12 uur (figuur 3), maar we hebben niet de omkering effecten op andere tijdstippen te vinden (24 uur, 48 uur en 72 uur werden de gegevens niet getoond). Figuur 3 Levensvatbaarheid van cellen na SGC7901 DIM behandeling werd beoordeeld door MTT assay. Levensvatbaarheid van SGC7901 cellen werd significant verlaagd in een concentratie- en tijdsafhankelijke wijze na DIM behandeling. Resveratrol (10 micromol /l) kan de remming effecten van DIM (30 umol /L) op cellur proliferatie.
Effect van DIM op celcyclus
Flow cytometrische analyse gedeeltelijk omgekeerde bleek dat DIM behandeling veroorzaakte veranderingen in de celcyclus distributie met verhoogde accumulatie van SGC7901 cellen in de G1 fase en compensatie voor deze verandering door een afname van cellen in de S fase (Figuur 4 en Tabel 1). Figuur 4 Het effect van DIM op de celcyclus van SGC7901 cellen. SGC7901 cellen werden behandeld met verschillende concentraties DIM en onderworpen aan cytometrische analyse stromen. Het percentage van elke fase wordt aangegeven in elk paneel. De getoonde resultaten zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten.
Tabel 1 het effect van DIM op de celcyclus van cellen SGC7901
DIM concentratie (umol /L)
Percentage celcyclus (%)

G1
G2
S
0
55.90 ± 1.48
10.5 ± 0.95
33,63 ± 0,55
10
57.20 ± 0.36 *
9.10 ± 0.3
33,70 ± 0,53
20
61,03 ± 1,53 *
8.17 ± 0.68
30.77 ± 0.97 *
30
61,97 ± 0.32 *
9.83 ± 0.32
28,23 ± 0,60 *
40
62,77 ± 1,46 *
9.13 ± 0.91
28.10 ± 0.56 *
50
73.03 ± 4.05 *
9.17 ± 1.51
18.07 ± 0.57 *
* p < 0,05, versus de controlegroep.
Effect van DIM op mobiele apoptose
48 uur na DIM behandeling, de veranderingen van de cel apoptose werden waargenomen door flowcytometrische analyse. In vergelijking met de controlegroep, werd apoptose geïnduceerd bij concentraties van 20 tot 50 umol /L, en de apoptose steeg op een dosis-afhankelijke wijze. Deze resultaten toonden aan dat DIM cel apoptose te induceren in SGC7901 cellen (Figuur 5 en Tabel 2). Figuur 5 Het effect van DIM op apoptose van SGC7901 cellen. SGC7901 cellen werden behandeld met verschillende concentraties DIM en onderworpen aan cytometrische analyse stromen. De getoonde resultaten zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten.
Tabel 2 Het effect van DIM op apoptose van SGC7901 cellen
DIM concentratie (micromol /l)
apoptose tarief (%)

0
4.18 ± 0.23
10

• Een nieuwe oncolytische virale therapie en beeldvormende techniek voor maagkanker met behulp van een genetisch gemanipuleerde vaccinia virus dragen van de menselijke natriumjodide symporter
• FOLFIRI als tweede lijn therapie bij patiënten met docetaxel voorbehandeld maagkanker: een historisch cohort