Ein selektiver Arylhydrocarbonrezeptor Modulator 3,3-Diindolylmethane hemmt Magenkrebs Zellwachstum

Ein selektiver Arylhydrocarbonrezeptor Modulator 3,3'-Diindolylmethane hemmt Magenkrebs Zellwachstum
Zusammenfassung
Hintergrund
Arylhydrocarbonrezeptor (AHR) ist ein Ligand-aktivierte Transkriptionsfaktor mit Magen-Krebsentstehung in Verbindung gebracht. 3,3'-Diindolylmethane (DIM) ist ein relativ nicht-toxisches selektiven AhR-Modulators. Diese Studie war es, die Auswirkungen von DIM auf Magenkrebs Zellwachstum zu erkennen.
Methoden
Magenkrebszelle SGC7901 wurde in verschiedenen Konzentrationen mit DIM behandelt (0,10,20,30,40,50 &mgr; mol /L) mit oder ohne AhR-Antagonist, Resveratrol. Die Expression von AhR und Cytochrome P4501A1 (CYP1A1), ein klassisches Zielgen von AhR Stoffwechselweg, wurden durch RT-PCR und Western Blot nachgewiesen; die Lebensfähigkeit der Zellen durch einen MTT-Assay gemessen wurde, und die Veränderungen im Zellzyklus und der Apoptose durch Durchflusscytometrie analysiert.
Ergebnisse
RT-PCR und Western-Blot zeigte, dass mit der Erhöhung der Konzentration von DIM, AhR Protein allmählich verringert und CYP1A1-Expression erhöht, was darauf hindeutet, dass DIM der Ahr-Weg und verursacht die Translokation von AhR vom Zytoplasma in Kern aktiviert. MTT-Test zeigte, dass die Lebensfähigkeit der Zellen deutlich SGC7901 in einer konzentrations- und zeitabhängigen Weise nach DIM Behandlung verringert wurde, und dies teilweise durch Resveratrol umgekehrt werden könnte. Durchflusszytometrie-Analyse zeigte, dass DIM Zellzyklus in der G1-Phase verhaftet und induziert Zell-Apoptose.
Fazit Selective Arylhydrocarbonrezeptor Modulator 3,3'-Diindolylmethane hemmt SGC7901 Zellproliferation durch Induktion von Apoptose und verzögern Progression des Zellzyklus
. AhR kann ein mögliches therapeutisches Ziel für Magenkrebs Behandlung.
Schlüsselwörter Arylhydrocarbonrezeptor 3,3'-Diindolylmethane Magenkrebs Cytochrome P4501A1 hintergrund und Magenkrebs ist eine der häufigsten malignen Erkrankungen ist. In den wirtschaftlich developping Ländern ist Magenkrebs die zweithäufigste frequntly diagnostizierten Krebserkrankungen und die dritthäufigste Ursache für Krebstod bei Männern [1], die insgesamt 5-Jahres-Überlebensrate ist gering (15% bis 35%) wegen der hohen Rezidiv Tarife, Lymphknotenmetastasen und die kurzlebige Reaktion auf Chemotherapie [2]. In der Gegenwart konzentrieren sich mehr und mehr Studien über die molekularen Diagnostik und Therapie von Magenkrebs [3]. Arylhydrocarbonrezeptor
(AHR) ist ein Ligand-aktivierte Transkriptionsfaktor. Nach Liganden, wie polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAH) und halogenierte Kohlenwasserstoffe (HAH) binden mit AhR in Cytoplasma, wird der Ligand-AhR-Komplex in den Zellkern und heterodimerisiert mit dem AhR Kern Translokator (ARNT) transloziert. Der Komplex bindet an die kognaten Enhancersequenz und aktiviert anschließend stromabwärts Genexpression [4].
Traditionelle Studien der Funktion AhR auf seine Rolle konzentriert in der Expression von Xenobiotika metabolisierenden Enzyme regulieren (xMES) und der Xenobiotika Stoffwechsel vermitteln. Jüngste Studien zeigten, dass AhR in vielen wichtigen physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich individuelle Entwicklung, Zelldifferenzierung verbunden sein können, und Karzinogenese [5]. AhR-Expression in der Lunge [6], Brustdrüse [7], der Bauchspeicheldrüse [8] und Magenkarzinome [9] nach oben reguliert. Weitere Studien festgestellt, dass AhR improtant Rollen bei der Regulierung der Zellproliferation, Apoptose, Zellzyklus, die Migration und Invasion spielt [10]. Als Protein im Zusammenhang mit Krebs, Ahr vielleicht ein vielversprechendes Ziel für die Krebstherapie. Die bisherige Arbeit festgestellt, dass ein AhR-Agonisten, 2,3,7,8 -tetrachlorodibenzo -p-dioxin (TCDD), Magenkrebs Zellwachstum gehemmt [9]. Aber TCDD selbst ist krebserregend [11] So finden nicht toxisch oder niedrig-toxische AhR-Modulatoren eine neue Richtung sein kann für die molekulare zielgerichtete Therapie bei Magenkrebs.
Selective AhR-Rezeptor-Modulator 3,3'-Diindolylmethane (DIM ) ist eine Klasse von relativ nicht-toxischen Indolderivate. DIM ist ein säure catalyed consendation Produkt von Indol-3-carbinol, einem consititudent von Kreuzblütlern und wird im Magen [12] gebildet. DIM ist ein Antikrebsmittel, unterdrückt es Krebszellproliferation in Brust [13], Kolon [14] und Pankreas [15] Krebserkrankungen.
Eine wenig Berichte über die Wirkung von DIM war auf Wachstum Magenkrebszellen, die vorliegende Studie wurde entworfen, um die Auswirkungen von DIM auf die Magenkrebszellen Wachstum zu beobachten und die möglichen Mechanismen erforschen.
Methoden
Zelllinie
menschlichen Magenkrebszelllinie SGC7901 vom Krebsinstitut der chinesischen Akademie der Medizinischen erhalten Wissenschaft. SGC7901 Die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium (GIBCO, Carlsbad, Calif, USA) mit 10% fötalem Rinderserum (Hyclone, USA), 1 × 10 5 U /l Penicillin, und 0,1 g /l Gentamicin. Die zelluläre Umgebung wurde bei 50 ml /l CO2 und 37 ° C gehalten.
Behandlung von Zellen
DIM wurde von Enzo Life Science Unternehmen (Bulter Pike Plymouth Meeting, PA, USA), Resveratrol und Dimethylsulfoxid (DMSO gekauft ) wurden von Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, USA) erworben. DIM und Resveratrol wurden in DMSO gelöst. Nach Inkubation für 24 h wurde eine Gruppe von Zellen mit DIM in verschiedenen Konzentrationen behandelt wurden (0, 10, 20, 30, 40, 50 &mgr; mol /l) für 24 Stunden. Eine zweite Gruppe wurde mit DIM (30 umol /L) und Resveratrol (0, 1, 5, 10, 20 umol /L) für 6 h behandelt. Eine weitere Gruppe wurde mit DIM (30 umol /L) für verschiedene Zeitintervalle behandelt (0, 1, 6, 24, 48, 72 h), respectively. Kontrollzellen erhielten 1 ml /L DMSO nur.
Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) Rückwärts
Nach Ernten der Zellen wurde Gesamt-RNA extrahiert unter Verwendung des Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Deutschland) gemäß dem Anweisungen des Herstellers. cDNA wurde mit 1 &mgr; g Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase synthetisiert, ReverTraAceTM (Toyobo Co., Osaka, Japan) unter den folgenden Bedingungen: 30 ° C für 10 min, 42 ° C für 20 min, 99 ° C für 5 min und 4 ° C für 5 min. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde unter Verwendung von 2 &mgr; l komplementärer DNA und 0,6 U Ex Taq DNA-Polymerase (Takara, Dalian, China) in 20 &mgr; l-Reaktionssystem und 30-Zyklus mit 94 ° C-Denaturierung für 30 s, 55 ° C Annealing . 30 s und 72 ° C Dehnung für 45 s
Die Primer-Sequenzen waren wie folgt: Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Reverse: AhR, 5 'ACT CCA CTT CAG CCA CCA TC-3' ( vorwärts) und 5 'ATG GGA CTC GGC ACA ATA AA -3' (rückwärts), war die vorgeschlagene Größe des PCR-Produkts 204 bp. CYP1A1, 5 'CCA TGT CGG CCA CGG AGT T-3' (vorwärts) und 5 'ACA GTG CCA GGT GCG GGT T -3' (rückwärts), war die proposedsize von PCR-Produkt 174 bp. Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), 5 'GGG AAA CTG TGG CGT GAT-3' (vorwärts) und 5 'AAA GGT GGA GGA GTG GGT -3' (rückwärts), war die prospektierten Größe des PCR-Produkts 309 bp. PCR-Produkte wurden anschließend auf einem 1,5% Agarosegel elektrophoretisch behandelt und unter einem UV-Transilluminator sichtbar gemacht.
Western blot analysis
Zellen in Puffer, enthaltend 20 mmol /L HEPES, 1 mmol /l EGTA, lysiert wurden 50 mmol /L β-Glycerophosphat, 2 mmol /L Natriumorthovanadat, 100 ml /l Glycerin, 10 ml /l Triton X-100, 1 mmol /l DTT und 1 × Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim, Deutschland). Das Lysat wurde bei 13 000 g und 4 ° C für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde die gesamte Zell-Lysat. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des BCA-Protein-Assay-Kits (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA) gemessen. Dreißig Mikrogramm Protein wurden pro Spur geladen, getrennt durch 100 g /l SDS-PAGE und auf äquilibriert Polyvinylidendifluorid-Membran transferiert durch Elektroblotting. Die Membranen wurden mit 5% fettfreier Milch in 1% TBS-T-Puffer für 2 h bei Raumtemperatur blockiert. AhR, CYP1A1 und GAPDH wurden nachgewiesen 2 h Antikörper gegen AhR (SC-5579, Santa Cruz Biotechnology, USA, Arbeitsverdünnung 1: 150) mit, CYP1A1 (AB1258, Chemicon International, USA, Arbeitsverdünnung 1: 500), und GAPDH (2118, Cell Signaling Technology, USA, Arbeitsverdünnung 1: 1000). Nach sekundärem Antikörper inkubiert (7074, Cell Signaling Technology, USA, Verdünnung Arbeits 1: 2000). Für 2 h wurden die Proteinbanden unter Verwendung von ECL-System (Pierce Biotechnology, Inc., USA)
Zelllebensfähigkeitstest
Die detektierte Wirkung von DIM auf die Proliferation von Magenkrebs-Zellen wurde durch MTT-Assay bestimmt. Kurz gesagt, insgesamt 1 × 10 4 Trypsin-dispergierten Zellen in 0,1 ml Kulturmedium wurden in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät und 24 Stunden kultiviert. Als nächstes wurden die Zellen mit DIM wie oben beschrieben behandelt. Dann wurden 20 ul MTT (5 g /l) wurde zu jeder Vertiefung zugegeben und die Inkubation wurde bei 37 ° C für 4 h fortgesetzt. Schließlich wurde das Kulturmedium entfernt und 150 &mgr; l DMSO wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Extinktion wurde bei 490 nm mit einem ELISA-Reader bestimmt. Die Lebensfähigkeit der Zellen Prozentsatz wurde berechnet als:. Viability Prozentsatz (%) = (Absorptionswert von Experiment-Gruppe) /(Absorptionswert der Kontrollgruppe) × 100%
Durchflusszytometrieanalyse
SGC7901 Zellen wurden ausplattiert auf 60 mm Durchmesser-Kulturplatten und mit DIM bei verschiedenen Konzentration (10, 20, 30, 40, 50 &mgr; mol /l) für 48 h. Die Kontrolle enthielt 1 ml /l DMSO nur. Vor der Ernte wurden die Zellen zweimal mit
0,01 mol /l PBS, mit Trypsin behandelt, und pelletiert, gewaschen. Die Zellen wurden dann über Nacht mit 70% eiskaltem Ethanol bei 4 ° C fixiert. Schließlich wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und gefärbt mit PI gewaschen. Der DNA-Gehalt wurde mit einem Durchflusszytometer (Beckman-Coulter, Brea, USA) analysiert. Der Zellzyklus von SGC7901 Zellen wurden unter Verwendung MULTYCYCLE und winMDI2.9 Software (Phoenix, AZ, USA) analysiert. Für Zell-Apoptose-Analyse nach der Inkubation für 48 h wurden die Zellen mit Annexin V-FITC und PI gefärbt. Zellen mit Annexin V (-) und PI (-) wurden lebende Zellen betrachtet. Zellen mit Annexin V (+) und PI (-) wurden früh apoptotischen Zellen angesehen. Zellen, die mit beiden Annexin V (+) und PI (+) wurden spät apoptotischen Zellen angesehen.
Statistische Analyse
Alle quantitativen Daten als Mittelwert ± SD ausgedrückt wurden und analysiert, um eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) verwendet wird. Alle statistischen Analysen wurden mit Hilfe der SPSS Statistik-Software-Paket durchgeführt (Version 11.0, SPSS Inc. Chicago, USA). P < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.
Ergebnisse

• Eine neuartige onkolytischen Virustherapie und Bildgebungstechnik für Magenkrebs einen gentechnisch veränderten Vaccinia-Virus das menschliche Natriumiodid symporter
• FOLFIRI als Second-Line-Therapie bei Patienten mit Docetaxel-vorbehandelten Magenkrebs: einer historischen Kohorte