Superexpressão de Snail está associada com metástases em linfonodos e pior prognóstico em pacientes com câncer gástrico

Superexpressão de Snail está associada com metástases em linfonodos e pior prognóstico em pacientes com câncer gástrico
transição epitelial-mesenquimal Abstract
Fundo
(EMT) desempenha um papel significativo na progressão tumoral e invasão. Snail é um regulador conhecido do EMT em vários tumores malignos. Este estudo investigou o papel do Caracol em câncer gástrico.
Métodos
Foram examinados os efeitos da silenciados ou sobre-expressos Snail usando construções lenti-viral nas células cancerosas gástricas. A análise imuno-histoquímica de microarrays de tecido de 314 pacientes com adenocarcinoma gástrico (GC) foi utilizado para determinar a significância clínico-patológico e prognóstico do caracol. expressão diferencial de genes em 45 amostras de GC com Snail superexpressão foi investigada através de análise de cDNA microarray.
Resultados
silenciamento de caracol por shRNA diminuiu invasão e migração em linhas de células de GC. Por outro lado, a sobre-expressão aumentada do caracol invasão e migração de células de cancro gástrico, em linha com o aumento do VEGF e MMP11. superexpressão Snail (coloração nuclear ≥75% positivo) também foi significativamente associada com a progressão do tumor (P Art < 0,001), metástases em linfonodos (P
= 0,002), invasão linfática (P
= 0,002), e invasão perineural (P
= 0,002) nos 314 pacientes GC, e com menor sobrevida (P
= 0,023). análise de cDNA microarray revelou 213 genes expressos diferencialmente em tecidos de GC com Snail sobre-expressão, incluindo os genes relacionados com a metástase e invasão.
Conclusão
caracol afecta significativamente a capacidade de invasão /migratório dos GC, e pode também ser utilizada como um biomarcador para preditivo prognóstico ou agressividade dos GCs.
Palavras-chave
estômago Adenocarcinoma Snail metástases linfonodais Survival fundo
transição epitelial-mesenquimal (EMT), um processo de desenvolvimento pelo qual as células epiteliais reduzir a adesão intercelular e adquirir características miofibroblásticas, é fundamental para o tumor progressão [1-3]. Durante EMT, ocorrem mudanças significativas, incluindo a infra-regulação de marcadores epiteliais, tais como E-caderina, translocação de β-catenina (isto é, a dissociação de membranosa β-catenina e a translocação para o compartimento nuclear), e supra-regulação de marcadores mesenquimais, tais como vimentina e N -cadherin [3-6]. EMT é induzida pela repressão da expressão da caderina-E pelos reguladores EMT como Caracol, Lesma, e Twist. A família do caracol de zinc-finger repressores de transcrição reprime E-caderina in vitro e in vivo

diretamente através de uma interação entre a sua região COOH-terminal e 5 '- CACCTG-3 ' seqüência no promotor da E-caderina [7-9]. Snail é declaradamente importante em diversos carcinomas, incluindo carcinomas do pulmão de não pequenas células, carcinomas dos ovários, carcinomas uroteliais, e o carcinoma hepatocelular [10-13]. Estudos também têm utilizado imunohistoquímica análises para mostrar o significado clínico da Caracol superexpressão no adenocarcinoma gástrico (GC) [14, 15]. No entanto, poucos relatos sobre os papéis de Snail em GC têm incluído clínico-patológico, prognóstico e funcional in vitro
análises, bem como resultados de expressão gênica. Portanto, foram avaliados o efeito de Snail em invasividade capacidade /migratório em linhas celulares de cancro gástrico, e também investigou a possibilidade de Snail a ser utilizado como um marcador preditivo para a avaliação de prognóstico pobre ou agressividade do tumor em pacientes GC. Também avaliamos o padrão de expressão gênica em 45 tecidos GC com caracol sobre-expressão, utilizando microarrays de cDNA.
Métodos
shRNA silenciamento mediado por lentivírus e sobre-expressão de Snail em células cancerosas gástricas
linhas celulares de cancro gástrico humano SNU216 e SNU484 foram obtidos a partir celular Linha Korean Bank (KCLB) e foram autenticados por perfis de ADN. Estas células cultivadas em meio RPMI1640 com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (Hyclone, Ogden, UT). Todas as células foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO 2. -Lentiviral baseado knockdown RNA e superexpressão foram utilizados para silenciar e superexpressão de caracol. Lentivírus que expressam quer não-alvo ou Snail
-targeted shRNAs foram utilizados para silenciar; um vector lentiviral PLKO segmentação do caracol
ou um vector vazio PLKO foram usados ​​para a sobre-expressão de Snail em SNU216 e o ​​SNU484 células. existências lentivírus foram produzidas utilizando a mistura de embalagens lentiviral Virapower ™ usando a linha celular 293FT de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). SNU216 e SNU484 células cultivadas para 50% de confluência foram incubadas durante 24 h numa diluição 1: 1 do vírus: meios de comunicação com 5 ug /ml de polibreno. Após um período de recuperação de 24 h em meio completo sem vírus, linhas de células estáveis ​​foram seleccionadas policlonais e mantidas em meios contendo 5 ug /ml de puromicina. Silenciamento ou sobre-expressão de Snail foi determinada por RT-PCR e transferência de Western.
Em tempo real de RT-PCR do VEGF
, MMP11
, e caracol
em células de cancro gástrico
ARN total celular extraiu-se usando o método de TRIzol (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA). Para a análise de RT-PCR, alíquotas de 2 ug de ARN foram submetidos a síntese de cDNA com 200 U de transcriptase reversa MMLV e 0,5 ug de oligo (dT) -15 iniciador (Promega, Madison, WI, EUA). Quantitative PCR em tempo real foi realizado com o sistema de rotor-gene ™ (Qiagen, Hilden, Alemanha) utilizando AccuPower 2 × Greenstar qPCR Mistura Principal (Bioneer, Daejeon, Coreia do Sul). ADNc em 1 ul da mistura de reacção foi amplificada com 0,5 L de polimerase de ADN GoTaq (Promega) e 10 pmol de cada um dos seguintes iniciadores de sentido e anti-sentido: 5 GAPDH
'- TCCATGACAACTTTGGTATCG-3 ', 5 '- TGTAGCCAAATTCGTTGTCA-3 '; Snail
5 '- CTTCCTCTCCATACCTG-3 ', 5 '- CATAGTTAGTCACACCTCGT-3 '; VEGF
5 '- TTGCTGCTCTACCTCCACCA-3 ', 5 '- GCACACAGGATGGCTTGAA-3 '; MMP11
5 '- CTTGGCTGCTGTTGTGTGCT-3 ', 5-AGGTATGGAGCGATGTGACG-3 '. O perfil de ciclos térmicos foi: desnaturação durante 30 s a 95 ° C, emparelhamento durante 30 segundos a 52 ° C (dependendo dos iniciadores usados), e extensão durante 30 s a 72 ° C. Para a avaliação semi-quantitativa de níveis de expressão, 30 ciclos foram usados ​​para cada reacção de PCR. Os produtos da PCR foram de 1,0% etídio géis brometo /agarose e quantificados num transiluminador UV fracionado-size. O ciclo limite (CT) é definido como o número do ciclo fraccionai a que a fluorescência passa um limiar fixo acima da linha de base. expressão gênica relativa foi quantificada utilizando o valor médio CT para cada amostra triplicado menos o valor médio CT triplicado para GAPDH
. As diferenças entre o controlo (vector vazio) e grupos de experiência (infectadas com lentivírus) foram calculados utilizando a fórmula 2 - ([△ CT Lenti] - [△ controlo CT]) e expressa como uma mudança vezes na expressão de acordo com a o método comparativo ciclo limiar (2- △△ CT) [16].
blotting
ocidentais células foram colhidas e rompidas em tampão de lise (1% Triton X-100, 1 mM de EGTA, 1 mM de EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 e inibidores de protease). Os detritos celulares foram removidos por centrifugação a 10.000 x g
durante 10 min a 4 ° C. Os sobrenadantes resultantes foram resolvidos em um 12% de SDS-PAGE sob condições redutoras desnaturados e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com leite seco sem gordura 5% à temperatura ambiente durante 30 minutos e incubadas com anticorpos primários. As membranas foram lavadas e incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano. O sinal foi visualizado usando um quimioluminescência aumentada (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido).
Migração celular e ensaio de invasão de Matrigel
células gástricas cancerosas foram colhidas com tripsina a 0,05% contendo EDTA a 0,02% (Sigma-Aldrich), e suspendeu-se em RPMI a uma concentração de 3 x 10 3 células /poço. Os filtros de membrana (dimensão de poro: 8 uM) em câmaras de quimiotaxia de 96 poços (Neuro Probe descartáveis, Gaithersburg, MD) foram pré-revestidas, durante 4 horas com 5 mg /mL de fibronectina, à temperatura ambiente. Alíquotas (50 ul /poço) da suspensão de células foram colocadas nas cavidades superiores, e 1% de FBS foi carregado para dentro da câmara inferior. Após 24 h de incubação, as células não-migração foram removidos da câmara superior com uma cotonete de algodão; células presentes na superfície inferior do inserto foram coradas com Hoechst33342 (Sigma-Aldrich). células invasivas foram contadas sob um microscópio de fluorescência a 10 × ampliação.
Para o ensaio de invasão de Matrigel, 3 × 104 células /cavidade foram semeadas na câmara superior, que foi revestida com Matrigel (5 mg /ml em meio frio, BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, EUA), e 1% de FBS ou controlo de veículo isento de soro contendo meio foi adicionada à câmara inferior. Após 24 h de incubação, as células não-migração foram removidos da câmara superior, com uma mecha de algodão, e as células presentes na superfície inferior do inserto foram coradas com Hoechst33342 (Sigma-Aldrich). células invasoras foram então contadas sob um microscópio de fluorescência no × 10 ampliação. microarrays
tecido, imuno-histoquímica e interpretação dos resultados
A arrayer tecido semi-automatizado (Beecher Instruments, WI, EUA) foi utilizado para a construção dos microarrays de tecido . Obteve-se 3 fragmentos de tecido, cada uma com 0,6 mm de diâmetro, a partir de blocos de tumor retiradas de pacientes GC. Núcleos não foram coletadas a partir do frontal mais invasivo ou áreas centrais dos tumores. As lâminas foram cozidos a 60 ° C durante 30 minutos, desparafinados em xileno e, em seguida, re-hidratadas. As secções foram depois submersos em tampão de citrato de recuperação de antigénios, micro-ondas para a recuperação de antigénio, tratada com peróxido de hidrogénio a 3% em metanol para extinguir a actividade da peroxidase endógena, e, em seguida, incubadas com 1% de albumina de soro de bovino para bloquear a ligação não específica. Em seguida, as secções foram incubadas com anticorpo de coelho anti-Snail (Abcam, Reino Unido) durante a noite a 4 ° C. soro normal de coelho foi usado como controlo negativo. Após a lavagem, as secções de tecido foram tratadas com o anticorpo secundário, contrastadas com hematoxilina, desidratadas, e montado. Pelo menos 500 células tumorais foram contadas. A percentagem de células com Snail + núcleos foi expressa relativamente ao número total de células tumorais contados. expressão nuclear de Snail foi graduada classificando o grau de coloração nuclear positiva como ≤50%, 50-75% ou ≥75%.
análise clínico-patológica e sobrevivência de câncer gástrico pacientes
Nós estudamos uma coorte de 314 GC pacientes que se submeteram cada uma gastrostomia com dissecção de linfonodos no Hospital da Universidade Nacional de Pusan ​​(PNUH) entre 2005 e 2007. O grupo foi composto por 218 homens e 96 mulheres, com idade média de 58,3 anos (variação, 25-83 anos). Standard and secções embebidas em parafina foram obtidos do Departamento de Patologia da PNUH, eo Biobank Nacional da Coreia, PNUH fixado em formol. O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board. Nenhum dos pacientes receberam radioterapia e /ou quimioterapia pré-operatória. A quimioterapia adjuvante com base em 5-FU foi administrado em pacientes com as fases II, III e IV Após ressecção curativa. Foram avaliados vários fatores clínico-patológicos de acordo com o Relatório Coreano Padronizado Patologia para o cancro gástrico, a Classificação japonesa de carcinoma gástrico (3 rd edição em Inglês), eo Comité Misto americana sobre o Câncer Staging Manual (7 th edição), incluindo local do tumor, aparência bruta e tamanho, profundidade de invasão, classificação histológica (ie, intestinal ou difuso) e invasão linfática [17-19]. evolução clínica de cada paciente foi seguido a partir da data da cirurgia até a data da morte ou 1 de março de 2012. Os períodos de acompanhamento variou de aproximadamente 1 a 81,5 meses (média, 51,4 meses). Casos perdidos para follow-up ou morte por qualquer causa que não seja câncer gástrico foram censurados da análise da taxa de sobrevivência. características clinicopatológicas foram analisados ​​utilizando t de Student
-teste, o χ 2 test, ou teste exato de Fisher para testar diferenças na expressão do caracol. parcelas cumulativas de sobrevida foram obtidos utilizando o método de Kaplan-Meier, e significância comparadas pelo teste de log-rank. fatores prognósticos foram identificados usando o método de Cox por etapas de regressão (modelo de riscos proporcionais), ajustado para idade dos pacientes, sexo, local do tumor, tipo morfológico (intestinal contra difusa). A significância estatística foi fixado em P Art < 0,05. Os cálculos estatísticos foram realizados com SPSS 10.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).
análise de cDNA microarray de tecidos com base em GC caracol superexpressão
Um total de 45 tecidos GC frescos foram obtidos a partir do National biobanco da Coreia, PNUH e CNUH; aprovação foi obtida a partir de seus conselhos de revisão institucionais. O ARN total foi extraído dos tecidos fresco congelado usando um kit de isolamento de ARN miRvana (Ambion Inc., Austin, TX). Quinhentos ng de ARN total foi usada para síntese de ADNc, seguido por um passo de amplificação /rotulagem (in vitro
transcrição) usando o kit de amplificação de ARN Ilumina TotalPrep (Ambion) para sintetizar ARNc marcado com biotina. As concentrações de ARNc foram medidos pelo método RiboGreen (Quant-iT RiboGreen kit de ensaio de ARN; Invitrogen Molecular Probes, ON, Canada) utilizando um espectrofotómetro Victor3 (Perkin Elmer, CT), e a qualidade de cRNA foi determinada num gel de agarose a 1%. Rotulados, material amplificado (1500 ng por array) foi hibridizada para Illumina HumanHT-12 BeadChips v4.0, de acordo com as instruções do fabricante (Illumina, San Diego, CA). sinais de matriz foram desenvolvidos por estreptavidina-Cy3. Arrays foram digitalizados com um sistema Illumina iScan. Os dados de microarranjos foram normalizados utilizando o método de normalização quantil em software Illumina BeadStudio. O nível de cada gene expressão foi transformado em um log 2 base antes de uma análise mais aprofundada. Excel foi usado principalmente para análises estatísticas. diferenças de expressão gênica foram considerados estatisticamente significativos se P Art < 0,05; todos os testes foram 2-atados. análises de agrupamento foram realizadas utilizando Cluster e Treeview [20]. O programa ontologia gene (GO) (http:... //David ABCC ncifcrf gov /) foi utilizada para categorizar os genes em subgrupos com base na função biológica. teste exacto de Fisher foi utilizado para determinar se as proporções de genes em cada categoria diferiram por grupo. GC tecidos foram ainda divididos naqueles com maiores (≥75%) e inferiores (< 75%) dos níveis de expressão de Snail; a expressão diferencial de genes entre os grupos foi identificado. Estão disponíveis dados de microarranjos primários na base de dados GEO do NCBI (Gene Expression Omnibus) (http:.....? //www NCBI NLM nih gov /geo /query /acc cgi acc = GSE38024).
resultados
Regulamento de migração e invasão das células cancerosas gástricas por Snail
RNA baseada em Lentivirus knockdown e abordagens superexpressão foram utilizados para determinar o papel do Caracol na invasão e migração de linhas celulares de cancro gástrico. células SNU216 e SNU484 utilizados neste estudo são estabelecidas linhas de células de adenocarcinoma gástrico de pacientes coreanos. Estas células foram infectadas com um lentivírus expressando quer não-alvo ou caracol
shRNAs -targeted para silenciar. A lentiviral vector PLKO que teve como alvo Snail
e um vector PLKO vazio foram usadas para induzir Snail superexpressão em SNU216 e SNU484 células. As linhas celulares estáveis ​​foram seleccionados usando policlonais puromicina. Snail
expressão foi determinada por RT-PCR e transferência de Western; estável caracol
knockdown (SH-caracol) e linhas de células sobre-expressão do caracol (OE-caracol) foram obtidos (Figura 1). Figura 1 Papel de Snail em invasão e migração de linhas celulares de cancro gástrico. células A. SNU216 (painel superior) e SNU484 (painel inferior) foram infectadas com lentivírus que expressam quer não-alvo shRNA (shNT
) ou Snail
shRNA no dia 0, e em seguida colhidas no dia 7 pós-infecção. Snail
knockdown foi determinada por RT-PCR e transferência de Western; As linhas celulares estáveis ​​foram gerados para cada uma das linhas celulares (SH-Snail). Silenciamento de Caracol
em SNU216 e SNU484 células induzidas diminuiu migração e invasão. células B. SNU216 (painel superior) e SNU484 (painel inferior) foram infectadas com lentivírus que expressam quer uma lentiviral vector de direccionamento PLKO caracol
ou um vector vazio PLKO (VE) no dia 0, e, em seguida, colhidas no dia 7, pós-infecção . A sobre-expressão de Snail foi determinada por RT-PCR e transferência de Western; A linha celular estável foi gerada para cada uma das linhas celulares (O /E-caracol). superexpressão Snail em células SNU216 e SNU484 induzida aumento da migração e invasão. C. caracol sobre-expressão induzida por aumento da expressão do mRNA de VEGF
e MMP11
em SNU216 e SNU484 células em análise em tempo real de RT-PCR. painel inferior indica figuras de RT-PCR representativos para VEGF
, MMP11
, Caracol
e GAPDH
. Os dados mostram a média ± SE de pelo menos 3 experiências independentes. * Indica P Art < 0,05 por t de Student
-teste.
Para determinar papéis de caracol na invasão de células de câncer gástrico, medimos invasão quimiotático pelas células que utilizam o sistema Transwell com filtros pré-revestidas com Matrigel. Para medir a migração de células de cancro gástrico, que a migração de células ensaiadas utilizando um aparelho de câmara de Boyden. O silenciamento de Snail por
shRNA induziu uma diminuição da migração e invasão de células SNU216 e SNU484, como mostrado na Figura 1A. Em contraste com o caracol
resultados de silenciamento, a sobre-expressão de Snail induziu o aumento da migração e invasão de SNU216 e SNU484 células, como mostrado na Figura 1B. Superexpressão de caracol também foi associado com o aumento do VEGF e MMP11 (Figura 1C).
Efeito do Caracol superexpressão sobre a agressividade do tumor e sobrevida do paciente GC
coloração nuclear positiva para Caracol em níveis de ≤50%, 50-75%, e ≥75% foi observada em 13,4% (42/314), 52,2% (164/314) e 34,4% (108/314), respectivamente, dos 314 doentes com GC na análise imuno-histoquímica. expressão de Snail foi observado no tipo intestinal e difuso dos GC (Figura 2A, B). superexpressão Snail (≥75% de positividade) significativamente correlacionada com o tamanho do tumor, o tipo bruto, profundidade de invasão, invasão linfática, invasão perineural e metástases em linfonodos (Tabela 1). superexpressão do caracol também foi associado com o tamanho do tumor aumentou (P
= 0,028) e escavado tipo bruto (P Art < 0,001); e aumento da capacidade de invasão do tumor, isto é, maior estádio T (P Art < 0,001) ea presença de invasão perineural (P Art < 0,001) e linfovascular êmbolos tumorais (P
= 0,002). Aumento metástases em linfonodos foi também relacionada com Snail superexpressão (P
= 0,002) .Em conformidade com os dados acima mostram a relação positiva entre Snail superexpressão e agressividade GC, Caracol superexpressão significativamente correlacionada com sobrevida global entre os pacientes do GC (P
= 0,023) (Figura 2C). Foi observada uma relação linear entre a expressão nuclear aumentado de caracol e sobrevivência encurtado (≤50%: 76,6 ± 2,7 meses; 50-75%: 68,5 ± 2,0 meses; ≥75%: 63,3 ± 2,8 meses). superexpressão Snail (≥75% de positividade) foi identificado como um preditor independente de mau prognóstico em 314 pacientes com GC, ajustado para idade, sexo, classificação histológica e localização do tumor, utilizando um modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox (P = 0,033
; Mesa 2). expressão Snail Figura 2 em adenocarcinoma gástrico (CG) amostras de tecido e gráficos de Kaplan-Meir de sobrevida global de 314 pacientes do GC. Snail foi expressa principalmente em núcleos de células de GC (tipo intestinal (A), e do tipo difuso (anel de sinete) células (B)) incluído em amostras de arranjo de tecido. Alguns fibroblastos reativos também mostrou Snail expressão nuclear (ampliação: × 400). C. Análise de Kaplan-Meier da sobrevivência global dos doentes com base em GC expressão de Snail. A relação linear entre o aumento da expressão nuclear Caracol e sobrevida menor foi observada entre os pacientes do GC (P
= 0,023). Teste log-rank foi utilizado para calcular valores
P.
Tabela 1 Relação entre a expressão Caracol e características clínico-patológicas em 314 pacientes com câncer gástrico
Número de pacientes (N = 314)

Snail positividade
ValorP
< 75%
≥75%
Idade (anos)
58,5 ± 10,6
59,1 ± 11,9
0,695 Sexo seguro
Masculino
218
143
75
0,996
Feminino
96
63
33
tamanho do tumor
≤4.0 cm
192
135
57
0,028 Art > 4,0 cm
122
71
51
Localização
Alto /Médio
167
112
55
0,561
Lower
147
94
53
profundidade Invasion
T1
160
127
33 Restaurant < 0,001
T2
41
26
15
T3
68
33
35
T4
43
19
24
tipo de Gross
Elevated
77
51
26 Restaurant < 0,001
Plano /deprimido
131
105
26
escavada
106
50
56
tipo histológico
Intestinal
182
123
59
0,609
difusa
122
76
46
Mixed
10
7 Sims 3
invasão perineural
negativo
202
150
52 Restaurant < 0,001
positiva
111
55
56
linfovascular êmbolos
negativo
193
139
54
0,002
Positivo 120
66
54
metástases linfonodais
N0, N1
270
186
84
0,002
N2, N3
44
20
24
Tabela 2 a análise multivariada com modelo de regressão Cox em 314 cânceres gástricos
Variáveis ​​
B
SE
HR (IC 95%)
P
Idade (≤59 contra > 59)
-0,438
0,264
0,645 (0,385-1,082)
0,097
sexo (masculino contra o sexo feminino)
-0,037
0,267
0,963 (0,571-1,626)
0,889
site (superior e médio contra inferior)
0,635
0,264
1.887 (1.126 -3,164)
0,016
Lauren (intestinal vs difusa)
-0,537
0,263
0,585 (0,349-0,978)
0,041
Snail (≥75% versus < 75 %)
-0,528
0,248
0,590 (,363-,958)
0,033
Nota: B, coeficiente; HR, taxa de risco; CI, intervalo de confiança.
Identificação de padrões de expressão gênica com base em Caracol superexpressão utilizando microarrays de cDNA
microarrays de cDNA foram usados ​​para comparar os perfis de 45 amostras GC de expressão gênica. Foram identificados 213 genes que foram diferencialmente expressos em níveis significativos (P
< 0,05) entre as amostras de GC com níveis mais elevados (≥75%) e inferiores (< 75%) da expressão de Snail (Tabela 3). Destes 213 genes, 82 foram regulados positivamente e 131 foram reprimidos nas amostras de GC com níveis mais elevados (≥75%) de expressão Caracol. Utilizou-se análise de agrupamento hierárquico para avaliar os 213 genes e 45 espécimes de GC; análise de agrupamento supervisionado deu padrões para amostras com níveis mais altos e mais baixos de expressão de Snail agrupadas em 2 grupos distintos, com exceção de uma amostra com níveis mais elevados de expressão de Snail (Figura 3). Para investigar as funções biológicas envolvidas na genes discriminantes, foi realizada uma análise da categoria GO. Onze genes foram associados com a regulação câncer de células-ECM adesão (P Art < 0,021) e proteína ECM Regulamento (P Art < 0,028, Tabela 4). A maioria tem sido implicado no cancro. ONECUT1
, ADAMTS
, IFNAR2
, MSR1
, e SORL1
afectar a migração ou metástase, um processo que envolve a ligação de células tumorais à membrana basal, a degradação do tecido conjuntivo local, e de penetração e migração de células tumorais através do estroma [21-25] .table 3 genes diferencialmente expressos em amostras de GC com maiores níveis de expressão de Snail
PROBE_ID
SÍMBOLO
NOME

Genes regulados positivamente em amostras com níveis mais elevados (≥75%) de expressão Snail (P Art < 0,05)
ILMN_2374449
SPP1
fosfoproteína 1 secretada
ILMN_2337923
TPD52L1
proteína Tumor D52-like 1

• celularidade nas vias aéreas, os macrófagos lipídicas carregadas e microbiologia do suco gástrico e das vias aéreas em crianças com refluxo oesophagitis
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