Die Überexpression von Schnecke ist mit Lymphknotenmetastasen und einer schlechten Prognose bei Patienten mit Magen-cancer

Überexpression von Schnecke verbunden ist mit Lymphknotenmetastasen und einer schlechten Prognose assoziiert bei Patienten mit Magenkrebs
Zusammenfassung
Hintergrund
Epithelial-mesenchymale Transition ( EMT) spielt eine bedeutende Rolle in der Tumorprogression und Invasion. Schnecke ist ein bekannter Regulator von EMT in verschiedenen bösartigen Tumoren. Diese Studie untersuchte die Rolle der Schnecke bei Magenkrebs.
Methoden
wir die Auswirkungen der zum Schweigen gebracht geprüft oder überexprimiert Schnecke lenti virale Konstrukte in Magenkrebszellen verwendet wird. Immunhistochemische Analyse von Gewebemikroarrays von 314 Patienten mit einem Adenokarzinom des Magens (GC) wurde verwendet, Schnecken klinisch-pathologischen und prognostische Bedeutung zu bestimmen. Differentielle Genexpression in 45 GC Proben mit Snail-Überexpression wurde mit cDNA-Microarray-Analyse untersucht.
Ergebnisse | Silencing von Schnecke durch shRNA verringerte Invasion und Migration in GC-Zelllinien. Im Gegensatz dazu erhöhte Schnecke Expression Invasion und Migration von Magenkrebszellen, im Einklang mit einer erhöhten VEGF und MMP11. Snail-Überexpression (≥75% positive Kernfärbung) wurde ebenfalls signifikant mit Tumorprogression assoziiert (P
< 0,001), Lymphknotenmetastasen (P
= 0,002), lymphovascular Invasion (P
= 0,002), und perineuralen Invasion (P
= 0,002) in den 314 GC-Patienten und mit kürzeren Überleben (P = 0,023
). cDNA-Microarray-Analyse ergab 213 differentiell exprimierten Gene in GC Gewebe mit Snail-Überexpression, einschließlich der Gene im Zusammenhang mit der Metastasierung und Invasion.
Fazit
Schnecke deutlich Invasivität /Migrationsfähigkeit von GCs betrifft, und kann auch als prädiktiver Biomarker verwendet werden für Prognose oder Aggressivität von GCs.
Schlüsselwörter Magen-Adenokarzinome Schnecke Lymphknotenmetastase Überleben hintergrund und epithelial-mesenchymale Transition (EMT), ein Entwicklungsprozess, wodurch Epithelzellen intercellular adhesion reduzieren und myofibroblastischer Funktionen erwerben, ist entscheidend für den Tumor Progression [1-3]. Während EMT, signifikante Veränderungen auftreten, einschließlich Herunterregulieren von epithelialen Marker wie E-Cadherin, Translokation von β-Catenin (dh Dissoziation von membranösen β-Catenin und Translokation in das nukleäre Kompartiment) und Aufregulation von mesenchymalen Marker wie Vimentin und N -cadherin [3-6]. EMT wird durch Repression von E-Cadherin-Expression von EMT-Regulatoren wie Schnecke, Slug und Twist induziert. Die Schnecke Familie von Zink-Finger Transkriptionsrepressoren reprimiert direkt E-Cadherin in vitro und in vivo

über eine Wechselwirkung zwischen den COOH-terminalen Bereich und dem 5 '- CACCTG-3 "-Sequenz in der E-Cadherin-Promotor [7-9]. Schnecke ist angeblich wichtig in mehreren Karzinomen, einschließlich nicht-kleinzellige Lungenkarzinome, Ovarialkarzinome, Urothelkarzinome und hepatozelluläres Karzinom [10-13]. Studien haben immunhistochemischen auch die klinische Bedeutung der Schnecke-Überexpression in einem Adenokarzinom des Magens (GC) [14, 15] Analysen zeigen, verwendet. Doch nur wenige Berichte über die Rollen von Snail in GC gehörten clinicopathological, prognostische und funktionelle in vitro
sowie Genexpressionsergebnisse analysiert. Wir haben daher Schnecken Wirkung auf Invasivität /Migrationsfähigkeit bei Magenkrebs-Zelllinien bewertet und untersucht auch die Möglichkeit der Schnecke als prädiktiver Marker verwendet werden für die Bewertung schlechter Prognose oder Tumoraggressivität in GC-Patienten. Wir untersuchten auch die Genexpressionsmuster in 45 GC Gewebe mit Snail Expression, cDNA-Microarrays verwendet.
Methoden
shRNA Lentivirus-vermittelte Silencing und eine Überexpression von Snail in Zellen Magenkrebs menschlichen Magenkrebszelllinien SNU216 und SNU484
wurden von koreanischen Zelllinie Bank (KCLB) erhalten und wurden durch DNA-Profil authentifiziert. Diese Zellen in RPMI1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U /ml Penicillin und 100 ug /ml Streptomycin (Hyclone, Ogden, UT). Alle Zellen wurden bei 37 ° C in 5% CO gehalten 2. Lentivirale-basierte RNA Knockdown und die Überexpression wurden zum Schweigen zu bringen und die Überexpression von Schnecke verwendet. Lentiviren entweder Nicht-Ziel oder Schnecke ausdrücken
shRNAs -targeted Silencing wurden verwendet; ein PLKO lentiviralen Vektor Schnecke Targeting oder in einen leeren PLKO Vektor wurden für die Überexpression von Schnecke im SNU216 und SNU484 Zellen verwendet. Lentiviren Aktien wurden mit dem Virapower ™ lentiviralen Verpackungsmix mit der 293FT Zelllinie hergestellt nach dem Protokoll des Herstellers (Invitrogen, Carlsbad, CA). 1-Verdünnung von Virus: SNU216 und SNU484 bis 50% Konfluenz gezüchteten Zellen wurden für 24 h in einer 1 inkubiert Medium mit 5 ug /ml Polybrene. Nach einer 24-h Erholungsphase in komplettem Medium ohne Virus wurden die polyklonalen stabilen Zelllinien ausgewählt und in Medien, die 5 ug /ml Puromycin gehalten. Silencing oder Überexpression von Snail wurde mittels RT-PCR und Western Blot bestimmt.
Echtzeit-RT-PCR-Analyse von VEGF
, MMP11
und Schnecke
in Magenkrebszellen
gesamte zelluläre RNA mit dem TRIzol Verfahren (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) wurde extrahiert. Für RT-PCR-Analyse, 2-ug-Aliquots von RNA wurden in cDNA-Synthese mit 200 U MMLV reverser Transkriptase unterzogen, und 0,5 ug Oligo (dT) -15-Primer (Promega, Madison, WI, USA). Quantitative real-time PCR wurde mit dem Rotor-Gene ™ -System (QIAGEN, Hilden, Deutschland) durchgeführt unter Verwendung von AccuPower 2 × Greenstar qPCR Master Mix (Bioneer, Daejeon, Korea). cDNA in 1 &mgr; l des Reaktionsgemisches wurde mit 0,5 U von GoTaq DNA-Polymerase (Promega) und 10 pmol jedes der folgenden Sense- und Antisense-Primern amplifiziert: GAPDH
5 '- TCCATGACAACTTTGGTATCG-3 ', 5 '- TGTAGCCAAATTCGTTGTCA-3 '; Snail
5 '- CTTCCTCTCCATACCTG-3 ', 5 '- CATAGTTAGTCACACCTCGT-3 '; VEGF
5 '- TTGCTGCTCTACCTCCACCA-3 ', 5 '- GCACACAGGATGGCTTGAA-3 '; MMP11
5 '- CTTGGCTGCTGTTGTGTGCT-3 ', 5-AGGTATGGAGCGATGTGACG-3 '. Die Temperaturwechselprofil war: Denaturierung für 30 s bei 95 ° C, Annealing für 30 s bei 52 ° C (abhängig von den verwendeten Primer) und Verlängerung für 30 s bei 72 ° C. Für semi-quantitative Bewertung der Expressionsniveaus wurden 30 Zyklen für jede PCR-Reaktion verwendet. PCR-Produkte wurden Größe fraktioniert auf 1,0% Ethidiumbromid /Agarose-Gelen und unter UV-Trans quantifiziert. Der Schwellenwert-Zyklus (CT) als fraktionierte Zykluszahl definiert, bei der die Fluoreszenz eine feste Schwelle oberhalb der Grundlinie passiert. Relative Genexpression wurde mit der durchschnittlichen CT-Wert für jede dreifach Probe quantifiziert abzüglich des durchschnittlichen dreifach CT-Wert für GAPDH
. Die Unterschiede zwischen der Kontrolle (leerer Vektor) und Versuchsgruppen (mit dem Lentivirus infiziert) wurden unter Verwendung der Formel 2 berechnet - ([△ CT Lenti] - [△ CT control]) und als eine Falte Veränderung der Expression nach die Vergleichs threshold cycle-Methode (2- △△ CT) [16].
Western-Blotting
Zellen wurden in Lysepuffer (1% Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 10 mM geerntet und aufgeschlossen Tris-HCl, pH 7,4 und Protease-Inhibitoren). Zelltrümmer wurden für 10 min bei 4 ° C durch Zentrifugation bei 10.000 × g
entfernt. Die resultierenden Überstände wurden auf einem 12% SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen denaturiert trennt und auf Nitrocellulosemembranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5% fettfreier Trockenmilch bei Raumtemperatur mit primärem Antikörper für 30 min inkubiert und blockiert. Die Membranen wurden mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem sekundärem Antikörper inkubiert und gewaschen. Das Signal wurde mit einem verstärkten Chemilumineszenz (Amersham, Buckinghamshire, UK) sichtbar gemacht.
Zellmigration und Matrigel Invasionsassay
Magenkrebszellen mit 0,05% Trypsin mit 0,02% EDTA (Sigma-Aldrich) wurden geerntet und suspendiert in RPMI in einer Konzentration von 3 x 10 3-Zellen gut /. Membranfilter (Porengröße: 8 um) in Einweg-96-Well-Chemotaxis-Kammern (Neuro Probe, Gaithersburg, MD) wurden vorbeschichtete für 4 h mit 5 mg /ml Fibronektin bei Raumtemperatur. Aliquots (50 &mgr; l /Vertiefung) der Zellsuspension wurden in die oberen Kammern geladen und 1% FBS wurde in die untere Kammer geladen. Nach 24 h Inkubation wurden die nicht-migrierenden Zellen aus der oberen Kammer mit einem Wattestäbchen entfernt; Zellen, die auf der unteren Oberfläche des Einsatzes wurden mit Hoechst33342 (Sigma-Aldrich) gefärbt. Invasiver Zellen wurden bei 10 × Vergrößerung unter einem Fluoreszenzmikroskop gezählt.
Für die Matrigel Invasionsassay, 3 × 104 Zellen /Vertiefung wurden in die obere Kammer ausgesät, die mit Matrigel (5 mg /ml in kaltem Medium aufgetragen wurde, BD transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA), und serumfreies Medium, das 1% FBS oder Kontrollvehikel wurde in die untere Kammer gegeben. Nach 24 h Inkubation vorliegenden, nicht migrierenden Zellen aus der oberen Kammer mit einem Baumwolltupfer entfernt, und die Zellen auf der unteren Oberfläche des Einsatzes wurden mit Hoechst33342 (Sigma-Aldrich) gefärbt. Invasive Zellen wurden dann bei 10 × Vergrößerung unter einem Fluoreszenzmikroskop gezählt.
Tissue Microarrays, Immunhistochemie und Interpretation der Ergebnisse
ein halbautomatisches Gewebe Arrayers (Beecher Instruments, WI, USA) wurde verwendet, um die Gewebe-Mikroarrays zu konstruieren . Wir 3 erhaltenen Gewebekerne, die jeweils 0,6 mm Durchmesser, die aus Tumor Blocks von GC Patienten entnommen. Kerne wurden nicht von der invasiven Frontal- oder zentralen Bereichen der Tumoren gesammelt. Die Objektträger wurden für 30 min bei 60 ° C gebacken, entparaffiniert mit Xylol und dann rehydratisiert. Die Schnitte wurden anschließend in Citrat-Antigen-Retrieval-Puffer eingetaucht, für Antigen-Retrieval wärmten, mit 3% Wasserstoffperoxid in Methanol behandelt, um endogene Peroxidase-Aktivität zu löschen, und dann mit 1% Rinderserumalbumin inkubiert unspezifische Bindung zu blockieren. Danach wurden die Schnitte mit Kaninchen-Anti-Snail (Abcam, UK) über Nacht bei 4 ° C inkubiert. Normales Kaninchenserum wurde als negative Kontrolle verwendet. Nach dem Waschen Gewebeschnitte wurden mit sekundärem Antikörper, mit Hämatoxylin gegengefärbt behandelt, entwässert und gelagert. Mindestens 500 wurden Tumorzellen gezählt. Der Prozentsatz an Zellen mit Snail + Kerne wurde ausgedrückt relativ zu zählen die Gesamtzahl der Tumorzellen. Nukleare Expression von Snail benotet wurde durch das Ausmaß der positiven Kernfärbung als ≤50% Klassifizierung, 50-75% oder ≥75%.
Clinicopathological und das Überleben Analyse von Magenkrebspatienten kaufen Wir eine Kohorte von 314 GC untersucht Patienten, die jeweils zwischen 2005 und 2007. Die Gruppe umfasste 218 Männer und 96 Frauen mit einem mittleren Alter von 58,3 Jahren (Bereich: 25 bis 83 Jahre) eine Gastrostomie mit Lymphknotendissektion bei Pusan ​​National University Hospital (PNUH) unterzog. Standard-Formalin-fixierten und in Paraffin eingebettete Schnitte wurden von der Abteilung für Pathologie, PNUH, und der National Biobank Korea, PNUH erhalten. Die Studie wurde von der Institutional Review Board genehmigt. Keiner der Patienten erhielten eine präoperative Strahlentherapie und /oder Chemotherapie. Adjuvante Chemotherapie auf Basis von 5-FU wurde an Patienten mit Stufen verabreicht II, III und IV nach kurativer Resektion. Wir untersuchten mehrere klinisch-pathologischen Faktoren entsprechend der koreanischen Standardisierte Pathologie-Bericht für Magenkrebs, der japanischen Klassifikation von Magenkarzinom (3 rd englische Ausgabe) und der American Joint Committee on Cancer Staging Manual (7 th edition), einschließlich Tumorstelle, Brutto Aussehen und Größe, Tiefe der Invasion, histologischen Klassifikation (dh Darm oder diffus) und lymphovascular Invasion [17-19]. Klinische Ergebnisse für jeden Patienten wurde ab dem Zeitpunkt der Operation zu dem Zeitpunkt des Todes oder 1. März folgte 2012. Follow-up-Perioden von etwa 1 bis 81,5 Monate lag (durchschnittlich 51,4 Monate). Fälle verloren zu Follow-up oder Tod jeglicher Ursache außer Magenkrebs von der Überlebensrate Analyse zensiert wurden. Klinisch-pathologischen Eigenschaften wurden unter Verwendung von Student t analysiert
-Test, der χ 2-Test oder Fisher-Test für die Unterschiede in der Schnecke Ausdruck zu testen. Kumulative Überleben Parzellen wurden mit der Kaplan-Meier-Methode erhalten, und Signifikanz wurde mit dem Log-Rank-Test verglichen. Die prognostische Faktoren wurden unter Verwendung des Cox-Regression schrittweise Methode (Proportional Hazard-Modell) identifiziert, für das Alter der Patienten angepasst, Geschlecht, Tumorstelle, morphologischer Typ (Darm gegen diffus). Die statistische Signifikanz wurde bei P <
gesetzt; 0,05. Statistische Berechnungen wurden mit SPSS Version 10.0 für Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) durchgeführt.
CDNA-Microarray-Analyse von GC Gewebe auf Basis von Snail Expression
Insgesamt 45 frisch GC Gewebe aus dem Nationalen erhalten Biobank Korea, PNUH und CNUH; Zustimmung wurde von ihrer Institutional Review Boards erhalten. Gesamt-RNA wurde aus den frischen gefrorenen Gewebe extrahiert, um eine Mirvana RNA Isolation Kit (Ambion Inc., Austin, TX). Fünfhundert Nanogramm der Gesamt-RNA wurde für die cDNA-Synthese, gefolgt von einer Verstärkung /Markierungsschritt (in vitro Transkription
) unter Verwendung der Illumina TotalPrep RNA Amplification-Kit (Ambion) verwendet, um Biotin-markierte cRNA synthetisieren. cRNA-Konzentrationen wurden durch das Verfahren RiboGreen (Quant-iT RiboGreen RNA-Assay-Kit; Invitrogen-Molecular Probes, ON, Kanada), gemessen unter Verwendung eines Spektrophotometers Victor3 (PerkinElmer, CT) und cRNA Qualität wurde auf einem 1% Agarosegel bestimmt. Beschriftete, amplifizierte Material (1500 ng pro Array) hybridisiert an Illumina HumanHT-12 BeadChips v4.0, gemäß den Anweisungen des Herstellers (Illumina, San Diego, CA). Array-Signale wurden durch Streptavidin-Cy3 entwickelt. Die Arrays wurden mit einem Illumina iScan System gescannt. Die Microarray-Daten wurden unter Verwendung des Quantil Normierungsverfahren in Illumina BeadStudio Software normalisiert. Das Expressionsniveau von jedem Gen wurde in ein Protokoll umgewandelt 2-Basis vor der weiteren Analyse. Excel wurde für statistische Analysen eingesetzt. Die Genexpression Unterschiede waren statistisch signifikant, wenn P
<betrachtet; 0,05; Alle Tests wurden 2-tailed. Clusteranalysen wurden unter Verwendung von Cluster und Treeview durchgeführt [20]. Die Gene Ontology (GO) Programm (http:... //David abcc ncifcrf gov /) wurde verwendet, um Gene in Untergruppen basierend auf biologische Funktion zu kategorisieren. Fisher wurde der exakte Test in jeder Kategorie durch Gruppe unterschieden, um zu bestimmen, ob die Anteile von Genen verwendet. GC Gewebe wurden weiter unterteilt in solche mit höheren (≥75%) und niedriger (< 75%) Ebenen der Schnecke Ausdruck; differentiellen Genexpression zwischen den Gruppen wurde identifiziert. Primäre Microarray-Daten verfügbar sind in NCBI GEO (Gene Expression Omnibus) Datenbank (http:.....? //Www ncbi NLM nih gov /geo /query /acc cgi acc = GSE38024).
Ergebnisse | Regulation der Migration und Invasion von Magenkrebszellen durch Snail
Lentivirale-basierte RNA und wurden Knockdown-Überexpression Ansätze Snail Rolle bei der Invasion und Migration von Magenkrebs-Zelllinien zu bestimmen. SNU216 und SNU484 in dieser Studie verwendeten Zellen werden von Korean Patienten Magen-Adenokarzinom-Zelllinien etabliert. Diese Zellen wurden mit einem Lentivirus infiziert entweder Nicht-Ziel oder Schnecke
-targeted shRNAs Silencing Ausdruck zu bringen. Ein PLKO lentiviralen Vektor, der Schnecke
gezielte und einem leeren PLKO Vektor wurden verwendet, Snail-Überexpression in SNU216 und SNU484 Zellen zu induzieren. Polyklonale stabile Zelllinien wurden mit Puromycin selektiert. Snail
Expression wurde durch RT-PCR und Western-Blotting bestimmt wird; stabile Schnecke
Knockdown (sh-Schnecke) und Schnecke-Überexpression Zelllinien (OE-Schnecke) erhalten wurden (Abbildung 1). Abbildung 1 Die Rolle der Schnecke in Invasion und Migration von Magenkrebs-Zelllinien. A. SNU216 (oberes Feld) und SNU484 (unteres Bild) Zellen wurden mit Lentiviren infiziert, die entweder nicht zu den Ziel shRNA (shNT
) oder Schnecke
shRNA am Tag 0, und dann am 7. Tag nach der Infektion geerntet. Snail
Zuschlags wurde durch RT-PCR und Western-Blotting bestimmt wird; stabile Zelllinien wurden für jede der Zelllinien (sh-Snail) erzeugt wird. Silencing von Snail
in SNU216 und SNU484 Zellen induzierte verringerte Migration und Invasion. B. SNU216 (oberes Feld) und SNU484 (unteres Bild) Zellen wurden mit Lentiviren infiziert entweder einen lentiviralen PLKO exprimierenden Vektor Schnecke Targeting oder in einen leeren PLKO Vektor (EV) am Tag 0, und dann geerntet am Tag 7 nach der Infektion . Die Überexpression von Snail wurde durch RT-PCR und Western-Blotting bestimmt wird; stabile Zelllinie wurde für jede der Zelllinien (O /E-Schnecke) erzeugt wird. Snail-Überexpression in SNU216 und SNU484 Zellen erhöhte Migration und Invasion induziert. C. Snail Überexpression erhöhte mRNA-Expression von VEGF
und MMP11
in SNU216 induziert und SNU484 Zellen in real-time RT-PCR-Analyse. Das untere Feld zeigt repräsentative RT-PCR-Zahlen für VEGF
, MMP11
, Schnecke
und GAPDH
. Die Daten zeigen die mittlere SE von mindestens 3 unabhängigen Experimenten ±. * Zeigt P
< 0,05 von Student t
-test.
An der Schnecke Rollen bei Magenkrebs Zellinvasion zu bestimmen, maßen wir chemotaktische Invasion der Zellen, die die Transwell-System mit Filter vorbeschichtet mit Matrigel verwenden. Um die Migration von Magenkrebszellen zu messen, untersucht man die Zellmigration eine Boyden Kammervorrichtung verwendet wird. Silencing von Schnecke und Videos shRNA induziert verringerte Migration und Invasion von SNU216 und SNU484 Zellen, wie in 1A gezeigt. Im Gegensatz zum Silencing Ergebnisse
Schnecke, die Überexpression von Snail bedingter Migration und Invasion von SNU216 und SNU484 Zellen erhöht wird, wie in 1B gezeigt. Die Überexpression von Snail wurde auch mit einer erhöhten VEGF assoziiert und MMP11 (1C).
Wirkung von Snail-Überexpression auf Tumoraggressivität und GC das Überleben des Patienten
Positive Kernfärbung für Schnecke auf einem Niveau von ≤50%, 50-75%, und ≥75% wurde in 13,4% (42/314), 52,2% (164/314) und 34,4% (108/314) verbunden sind, der 314 Patienten in GC immunhistochemische Analyse beobachtet. Snail-Expression wurde in Darm- und diffuse Art von GCs beobachtet (2A, B). Snail-Überexpression (≥75% Positivität) signifikant korreliert mit der Größe des Tumors, der groben Art, Tiefe der Invasion, lymphovascular Invasion, perineuralen Invasion und Lymphknotenmetastasen (Tabelle 1). Snail-Überexpression wurde auch mit einer erhöhten Tumorgröße assoziiert (P
= 0,028) und ausgegraben Brutto-Typ (P
< 0,001); und erhöhte Tumorinvasivität, d.h. höhere T Stufe (P
< 0,001) und das Vorhandensein von perineural invasion (P
< 0,001) und lymphovascular Tumor Embolien (P
= 0,002). Erhöhte Lymphknotenmetastasen wurde auch im Zusammenhang mit Schnecke-Überexpression (P
= 0,002) .In Übereinstimmung mit den oben genannten Daten die positive Beziehung zwischen Schnecke Expression und GC Aggressivität zeigen, Schnecke Expression signifikant das Gesamtüberleben bei GC Patienten (P
= 0,023) (Figur 2C). (:; 50-75% 76,6 ± 2,7 Monate: 68,5 ± 2,0 Monate, ≥75%: 63,3 ± 2,8 Monate ≤50%) wurde eine lineare Beziehung zwischen dem Anstieg der Kernexpression von Schnecke und verkürzt Überleben beobachtet. Snail-Überexpression (≥75% Positivität) wurde mit GC bei 314 Patienten als unabhängiger Prädiktor für schlechte Prognose identifiziert, korrigiert für Alter, Geschlecht, histologische Klassifikation und Lokalisation des Tumors, mit einer Regression Cox Proportional Hazard Modell (P
= 0,033; Tabelle 2). Abbildung 2 Snail-Expression in einem Adenokarzinom des Magens (GC) Gewebeproben und Kaplan-Meir Plots des Gesamtüberlebens von 314 GC-Patienten. Schnecke wurde in den Kernen von GC-Zellen (Darm-Typ (A) und diffusen Typ (Siegelring) Zellen (B)), die in Gewebearray Proben meist ausgedrückt. Einige reaktive Fibroblasten zeigten auch Snail Kernexpression (Vergrößerung: × 400). C. Kaplan-Meier-Analyse der Gesamtüberlebenszeit von GC Patienten basierend auf Snail Ausdruck. Eine lineare Beziehung zwischen dem Anstieg der Schnecke Kernexpression und kürzere Überleben wurde unter GC-Patienten (P
= 0,023) gesehen. Log-Rank-Test wurde verwendet, um P
Werte berechnen.
Tabelle 1 Beziehung zwischen Snail-Expression und klinisch-pathologischen Eigenschaften bei 314 Patienten mit Magenkrebs
Anzahl der Patienten
(N = 314)

Snail Positivität
pValue
< 75%
≥75%
Alter (Jahre)
58,5 ± 10,6
59,1 ± 11,9
0.695
Sex
Male
218
143
75
0.996
Weiblich
96
63
33
Tumorgröße
≤4.0 cm
192
135
57
0,028
> 4,0 cm
122
71
Ort 51
Obere /Mitte
167
112
55
0.561
Lower
147
94
53
Invasion Tiefe
T1
160
127
33
< 0,001
T2
41
26
15
T3
68
33
35
T4
43
19
24
Gross Typ
Erhöhte
77
51
26
< 0,001
Wohnung /depressiv
131
105
26
Aushub
106
50
56
histologischen Typ
Intestinale
182
123
59
0.609
Diffuse 122
76
46
Mixed 10
7
3
perineurale Invasion
Negative
202
150
52
< 0,001
Positive
111
55
56
lymphovascular Embolien
Negative
193
139
54
0.002
Positive
120
66
54
Lymphknotenmetastase
N0, N1
270
186
84
0.002
N2, N3
44
20
24
Tabelle 2 multivariaten Analyse mit Cox-Regressionsmodell in 314 Magenkrebs
Variablen
B
SE
HR (95% CI)
P
Alter (≤59 im Vergleich zu > 59)
-0,438
0.264
0,645 (0,385-1,082)
0.097
Geschlecht (männlich im Vergleich zu weiblichen)
-0,037
0.267
0,963 (0,571-1,626)
0.889
Site (obere und mittlere im Vergleich zu niedriger)
0,635
0.264
1,887 (1,126 -3,164)
0,016
Lauren (Darm-vs diffuse)
-0,537
0.263
0,585 (0,349-0,978)
0,041
Schnecke (≥75% im Vergleich zu < 75 %)
-0,528
0.248
0,590 (0,363-0,958)
0,033
Hinweis: B, Koeffizient; HR, Hazard Ratio; CI, Konfidenzintervall.
Identifizierung von Genexpressionsmustern basiert auf Snail Expression cDNA-Microarrays mit
cDNA-Microarrays verwendet wurden Genexpressionsprofile von 45 GC-Proben zu vergleichen. Wir identifizierten 213 Genen, die differentiell in signifikanten Mengen exprimiert wurden (P
< 0,05) zwischen GC Proben mit höheren (≥75%) und geringere Mengen (< 75%) der Snail-Expression (Tabelle 3). Von diesen 213 Gene wurden 82 nach oben reguliert und 131 wurden in den GC-Proben mit einem höheren Niveau (≥75%) der Schnecke Ausdruck herunter reguliert. Wir verwendeten hierarchischen Clustering-Analyse der 213 Gene und 45 GC Proben zu bewerten; wachten Clustering-Analyse ergab Muster für Proben mit höheren und niedrigeren Niveaus der Expression Snail geclustert in zwei verschiedene Gruppen, mit Ausnahme einer Probe mit einem höheren Snail-Expression (Abbildung 3). Um die biologischen Funktionen beteiligt bei der Unterscheidung Gene zu untersuchen, führten wir eine GO Kategorie Analyse. und ECM Proteinregulierung (P
< 0,028, Tabelle 4); Eleven-Gene wurden mit Regulierung Krebszellen ECM Adhäsion (0,021 P
<) zugeordnet ist. Die meisten wurden in Krebs in Verbindung gebracht. ONECUT1
, ADAMTS
, IFNAR2
, MSR1
und SORL1
Migration oder Metastasierung beeinflussen, ein Prozess, der Bindung von Tumorzellen an der Basalmembran, den Abbau von lokalen Bindegewebe umfasst, und Eindringen und die Migration von Tumorzellen durch Stroma [21-25] .Tabelle 3 Gene differentiell in GC Proben mit einem höheren Snail Ausdruck ausgedrückt
PROBE_ID
SYMBOL
NAMEN

in Proben mit einem höheren Niveau (≥75%) der Schnecke Ausdruck upregulated Gene (P
< 0,05)
ILMN_2374449
SPP1
Abgesonderte Phosphoprotein 1 | ILMN_2337923
TPD52L1
Tumor Protein D52-like 1
ILMN_1679838
WBP5
WW-Domäne bindendes Protein 5
ILMN_2078592
C6orf105
androgenabhängigem TFPI -regulierenden Protein
ILMN_1714383
TPD52L1
Tumor Protein D52-like 1
ILMN_1674817
C1orf115
Chromosome 1 offene Leserahmen 115
ILMN_1813561
SCIN
Scinderin
ILMN_1759818
SORL1
Sortilin-related receptor, L (DLR Klasse) A-Wiederholungen enthält
ILMN_1745686
MFHAS1
Bösartige fibröses Histiozytom amplifizierte Sequenz 1 | ILMN_2060115
SORL1
Sortilin-related receptor, L (DLR Klasse) A-Wiederholungen enthält
ILMN_2337263
PKIB
Proteinkinase (cAMP -abhängigen, katalytisch) Inhibitor beta
ILMN_2173835
FTHL3
Ferritin, schweres Polypeptid 1 Pseudogen 3
ILMN_1791057
IFNAR2
Interferon (alpha, beta und Omega) Rezeptor 2
ILMN_1807114
LOC255620
Ähnlich unc-93 Homolog B1 (C. elegans), transcript variant 1 (LOC255620), mRNA
ILMN_1669393
GGT1
Gammaglutamyltransferase 1 | ILMN_1685798
MAGEA6
Melanom-Antigen Familie A, 6
ILMN_3269395
GGT2
Gammaglutamyltransferase 2
ILMN_1669833
SH2B2
SH2B Adapterprotein 2
ILMN_3238534
LOC100133817
Hypothetische Protein LOC100133817
ILMN_2099315
TRPM8
transient receptor potential Kationenkanal, Unterfamilie M, Mitglied 8
ILMN_3298065
LOC729195
Ähnlich apikal frühen endosomalen Glykoprotein
ILMN_1717726
FLJ43752
Lange intergenic nicht-Protein-kodierende RNA 336
ILMN_1670452
ANKRD20A1
Ankyrin Repeat Domain 20 Familie, Mitglied A1
ILMN_3201060
LOC100132655
hypothetisches Protein LOC100132655
ILMN_3282829
LOC727913
Ähnlich iduronate 2-Sulfatase (Hunter-Syndrom)
ILMN_2339691
SYVN1
Synoviale Apoptose-Inhibitor 1 , synoviolin
ILMN_1785549
SLC30A2
Solute carrier family 30 (Zinktransporter), Mitglied 2
ILMN_3191898
LOC100129630
Hypothetische LOC100129630
ILMN_1704204
LOC642204
Ankyrin repeat domain-containing protein 26-like
ILMN_1682280
LOC647753
hypothetisches Protein LOC647753
ILMN_3201944
LOC646438
Hypothetische LOC646438
ILMN_2233314
SPANXA1
Sperm Protein mit dem Kern verbunden sind, X-chromosomale, ein Familienmitglied A1
ILMN_3305980
NS3BP
NS3BP
ILMN_1747850
CRIM2
Kielin /chordin-like protein
ILMN_1700590
LOC645590
ähnlich wie cAMP-abhängige Proteinkinase Typ I-beta regulatorische Untereinheit
ILMN_1766316
FLJ32679

Golgin ähnliche hypothetische Protein LOC440321
ILMN_1890741
Hs
0,552561
pankreatischen Insel cDNA-Klon hbt09690 3, mRNA-Sequenz
ILMN_3308255
MIR33A

MicroRNA 33a
ILMN_1815716
LMLN
Leishmanolysin-like (Metallpeptidase M8 Familie)
ILMN_1654945
Dnmt3a
DNA (Cytosin-5 -) - Methyltransferase 3 alpha
ILMN_2256050
SERPINA1
Serpin Peptidase-Inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, Antitrypsin), Mitglied 1 | ILMN_1759487
EGFLAM
EGF-like, Fibronektin Typ III und Laminin G-Domänen
ILMN_1760410
LOC653086
ähnlich wie bei RAN-binding protein 2-like 1 Isoform 2
ILMN_1668969
MIXL1
Mix gepaart artigen homeobox
ILMN_3279757
LOC100132532
hypothetisches Protein LOC100132532
ILMN_1715372
CAMKK1

Calcium /Calmodulin-abhängige Proteinkinase-Kinase 1, alpha
ILMN_1731370
Yang et al. Kim et al. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

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