Sovraespressione di lumaca è associata con metastasi linfonodali e la scarsa prognosi nei pazienti con cancro gastrico

Sovraespressione di lumaca è associata con metastasi linfonodali e prognosi infausta in pazienti con cancro gastrico
transizione epitelio-mesenchimale astratta
sfondo
(EMT) svolge un ruolo significativo nella progressione tumorale e l'invasione. Lumaca è un regolatore noto di EMT in vari tumori maligni. Questo studio ha esaminato il ruolo della Lumaca di cancro gastrico.
Metodi
abbiamo esaminato gli effetti di tacere o di sovraespresso Lumaca usando costrutti lenti-virale in cellule di cancro gastrico. analisi immunoistochimica dei microarray di tessuto da 314 pazienti con adenocarcinoma gastrico (GC) è stata utilizzata per determinare il significato clinicopatologica e prognostico di lumaca. l'espressione genica differenziale in 45 campioni GC con la lumaca sovraespressione è stata studiata utilizzando l'analisi cDNA microarray.
Risultati
silenziamento di lumaca da shRNA diminuito invasione e la migrazione in linee cellulari GC. Al contrario, Lumaca sovraespressione aumentato l'invasione e la migrazione delle cellule di cancro gastrico, in linea con l'aumento VEGF e MMP11. sovraespressione Lumaca (colorazione nucleare ≥75% positivo) è stato anche significativamente associato con la progressione del tumore (P
< 0,001), metastasi linfonodali (P
= 0,002), invasione linfovascolare (P
= 0,002), e l'invasione perineurale (P
= 0,002) nei 314 pazienti GC, e con una minore sopravvivenza (p = 0,023
). analisi cDNA microarray ha rivelato 213 geni differenzialmente espressi nei tessuti GC con la lumaca sovraespressione, compresi i geni legati alla metastasi e l'invasione.
Conclusione
Lumaca influenza in modo significativo l'invasività /capacità migratoria di GC, e può essere utilizzato anche come un biomarcatore predittivo per la prognosi o aggressività del GC.
Parole
stomaco Adenocarcinoma Lumaca metastasi linfonodali sopravvivenza Sfondo
transizione epitelio-mesenchimale (EMT), un processo di sviluppo in cui le cellule epiteliali ridurre l'adesione intercellulare e acquisiscono caratteristiche miofibroblastici, è fondamentale per tumore progressione [1-3]. Durante EMT, significativi cambiamenti si verificano, tra cui down-regulation di marcatori epiteliali come la E-caderina, la traslocazione di β-catenina (vale a dire, la dissociazione di membranosa β-catenina e traslocazione nel vano nucleare), e aumenta i marcatori mesenchimali quali vimentina e N -cadherin [3-6]. EMT è indotta dalla repressione di espressione E-caderina da parte dei regolatori EMT come la Chiocciola, Lumaca, e Twist. La famiglia lumaca di zinco-finger repressori trascrizionali reprime direttamente E-caderina in vitro e in vivo
zona Via un'interazione tra loro regione COOH-terminale ed il 5 '- CACCTG-3 ' sequenza nel promotore E-caderina [7-9]. Snail è riferito importante in molti carcinomi, tra cui non a piccole cellule del polmone carcinomi, carcinomi ovarici, carcinomi uroteliali e carcinoma epatocellulare [10-13]. Gli studi hanno anche utilizzato immunoistochimica analisi per mostrare il significato clinico di lumaca sovraespressione di adenocarcinoma gastrico (GC) [14, 15]. Tuttavia, alcune relazioni sui ruoli di lumaca in GC hanno incluso clinicopatologica, prognostico e funzionale in vitro
analisi, nonché i risultati di espressione genica. Abbiamo quindi valutato l'effetto di lumaca sulla invasività capacità /migratoria nelle linee di cellule di cancro gastrico, e anche studiato la possibilità di lumaca essere utilizzato come marker predittivo per la valutazione prognosi infausta o aggressività del tumore nei pazienti GC. Abbiamo anche valutato il pattern di espressione genica in 45 tessuti GC con la lumaca sovraespressione, utilizzando cDNA microarrays
. Metodi
shRNA silenziamento lentivirus-mediata e la sovraespressione di lumaca in cellule di cancro gastrico
linee di cellule di cancro gastrico umani SNU216 e SNU484 sono stati ottenuti da Corea Cell Line Bank (KCLB) e sono state autenticate dal profilo del DNA. Queste cellule coltivate in terreno RPMI1640 con siero fetale bovino 10% (FBS), 100 U /ml di penicillina, e 100 mg /ml di streptomicina (Hyclone, Ogden, UT). Tutte le cellule sono state mantenute a 37 ° C in 5% CO 2. Lentivirali basati su RNA atterramento e sovraespressione sono stati utilizzati per mettere a tacere e la sovraespressione di lumaca. Lentivirus che esprimono o non bersaglio o lumaca
-targeted shRNAs sono stati utilizzati per mettere a tacere; un PLKO vettori lentivirali mira Lumaca
o un vettore PLKO vuoto sono stati utilizzati per la sovraespressione della Lumaca nella SNU216 e SNU484 cellule. scorte lentivirus sono state prodotte utilizzando il mix del packaging lentivirale Virapower ™ utilizzando la linea cellulare 293FT secondo il protocollo del produttore (Invitrogen, Carlsbad, CA). SNU216 e SNU484 cellule cresciute al 50% di confluenza sono state incubate per 24 h in una diluizione 1: 1 di virus: media con 5 mg /ml Polybrene. Dopo un periodo di recupero di 24 ore in completa media senza virus, linee cellulari stabili policlonali sono stati selezionati e mantenuti in supporti contenenti 5 mg /ml puromicina. Silenziamento o sovraespressione di lumaca è stata determinata mediante RT-PCR e western blotting. Real tempo di analisi RT-PCR di VEGF
, MMP11
, e Lumaca
in cellule di cancro gastrico
RNA cellulare totale è stato estratto utilizzando il metodo TRIzol (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Per l'analisi RT-PCR, 2-ug aliquote di RNA sono stati sottoposti a sintesi del DNA con 200 U di MMLV trascrittasi inversa e 0,5 mg di oligo (dT) Primer -15 (Promega, Madison, WI, USA). Quantitativa real-time PCR è stata eseguita con il sistema Rotor-Gene ™ (QIAGEN, Hilden, Germania) utilizzando AccuPower 2 × Greenstar qPCR Master Mix (Bioneer, Daejeon, Corea). cDNA in 1 ml di miscela di reazione è stato amplificato con 0,5 U di polimerasi GoTaq DNA (Promega) e 10 pmol ognuno dei seguenti primer senso e antisenso: GAPDH
5 '- TCCATGACAACTTTGGTATCG-3 ', 5 '- TGTAGCCAAATTCGTTGTCA-3 '; Lumaca
5 '- CTTCCTCTCCATACCTG-3 ', 5 '- CATAGTTAGTCACACCTCGT-3 '; VEGF
5 '- TTGCTGCTCTACCTCCACCA-3 ', 5 '- GCACACAGGATGGCTTGAA-3 '; MMP11
5 '- CTTGGCTGCTGTTGTGTGCT-3 ', 5-AGGTATGGAGCGATGTGACG-3 '. Il profilo cicli termici era: denaturazione per 30 s a 95 ° C, annealing per 30 s a 52 ° C (a seconda delle primer utilizzati), e l'estensione per 30 s a 72 ° C. Per la valutazione semi-quantitativa dei livelli di espressione, 30 cicli sono stati utilizzati per ciascuna reazione PCR. I prodotti di PCR erano di dimensioni frazionata su 1.0% etidio bromuro gel /agarosio e quantificati con transilluminazione UV. Il ciclo soglia (CT) è definito come il numero di cicli frazionata in cui la fluorescenza supera una soglia fissa sopra basale. espressione genica relativa è stata quantificata utilizzando il valore medio CT per ogni campione triplicato meno il valore media CT triplicato per GAPDH
. Le differenze tra il controllo (vuoto vettoriale) e gruppi di esperimento (infettati con il lentivirus) sono stati calcolati utilizzando la formula 2 - ([△ CT Lenti] - [△ controllo CT]) ed espresso come variazione volte espressione in base alle il metodo comparativo ciclo soglia (2- △△ CT) [16].
Western blotting
cellule sono state raccolte e interrotti nel tampone di lisi (1% Triton X-100, 1mM EGTA, 1mM EDTA, 10mm Tris-HCl, pH 7.4 e inibitori della proteasi). detriti cellulari è stato rimosso per centrifugazione a 10.000 xg
per 10 min a 4 ° C. I supernatanti risultanti sono stati risolti su 12% SDS-PAGE in condizioni riducenti denaturati e trasferiti su membrane di nitrocellulosa. Le membrane sono state bloccate con 5% non grasso latte essiccato a temperatura ambiente per 30 min e incubate con anticorpi primari. Le membrane sono state lavate e incubate con rafano anticorpo secondario coniugato con perossidasi. Il segnale è stato visualizzato utilizzando un chemiluminescenza (Amersham, Buckinghamshire, Regno Unito). Migrazione
cellulare e saggio di invasione Matrigel
cellule di cancro gastrico sono state raccolte con 0,05% tripsina contenente 0,02% EDTA (Sigma-Aldrich), e sospeso in RPMI ad una concentrazione di 3 × 10 3 cellule /pozzetto. I filtri a membrana (dimensione dei pori: 8 micron) in monouso camere di chemiotassi da 96 pozzetti (Neuro Probe, Gaithersburg, MD) sono stati pre-rivestite per 4 h con 5 mg /ml fibronectina a temperatura ambiente. Aliquote (50 ul /pozzetto) della sospensione cellulare sono stati caricati nelle camere superiori e 1% FBS è stato caricato nella camera inferiore. Dopo 24 h di incubazione, le cellule non migrano sono stati rimossi dalla camera superiore con un tampone di cotone; cellule presenti sulla superficie inferiore dell'inserto sono state colorate con Hoechst33342 (Sigma-Aldrich). cellule invasive sono state contate sotto un microscopio a fluorescenza a × 10 ingrandimenti.
Per il saggio di invasione Matrigel, 3 × 104 cellule /pozzetto sono state seminate nella camera superiore, che è stato rivestito con Matrigel (5 mg /ml in mezzo freddo, BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA), e 1% FBS o controllo del veicolo senza siero mezzo contenente è stato aggiunto alla camera inferiore. Dopo 24 h di incubazione, non migrante cellule sono state rimosse dalla camera superiore con un tampone di cotone, e cellule presenti sulla superficie inferiore dell'inserto erano macchiati con Hoechst33342 (Sigma-Aldrich). cellule invasive sono state poi contate al microscopio a fluorescenza a × 10 ingrandimenti.
microarrays del tessuto, immunoistochimica, e l'interpretazione dei risultati
A Arrayer tessuto semi-automatica (Beecher Instruments, WI, USA) è stato utilizzato per costruire i microarray di tessuti . Abbiamo ottenuto 3 nuclei di tessuto, ogni 0,6 mm di diametro, da blocchi tumorali prelevati da pazienti GC. Cores non sono stati raccolti dal frontale più invasivo o aree centrali dei tumori. I vetrini sono stati cotti a 60 ° C per 30 min, deparaffinizzati con xilene, e quindi reidratata. Le sezioni sono state successivamente immersi in tampone citrato antigene recupero, scaldati per il recupero dell'antigene, trattato con perossido di idrogeno al 3% in metanolo per estinguere attività perossidasica endogena, e poi incubate con 1% di albumina di siero bovino di bloccare legame non specifico. Da allora in poi, le sezioni sono state incubate con coniglio anti-lumaca (Abcam, UK) notte a 4 ° C. siero di coniglio normale è stato utilizzato come controllo negativo. Dopo il lavaggio, sezioni di tessuto sono stati trattati con l'anticorpo secondario, di contrasto con ematossilina, disidratate e montate. Almeno 500 cellule tumorali sono state contate. La percentuale di cellule con lumaca + nuclei stata espressa in relazione al numero totale di cellule tumorali contate. espressione nucleare di lumaca è stata classificata classificando il grado di colorazione nucleare positivo ≤50%, 50-75%, o ≥75%.
analisi clinicopatologico e la sopravvivenza dei pazienti con cancro gastrico
Abbiamo studiato una coorte di 314 GC i pazienti che ogni subito una gastrostomia con linfoadenectomia a Pusan ​​National University Hospital (PNUH) tra il 2005 e il 2007. Il gruppo era composto di 218 uomini e 96 donne con un'età media di 58,3 anni (range, 25-83 anni). Standard fissati in formalina sezioni in paraffina sono stati ottenuti dal Dipartimento di Patologia, PNUH, e la Biobanca Nazionale della Corea, PNUH. Lo studio è stato approvato dal Institutional Review Board. Nessuno dei pazienti ha ricevuto radioterapia e /o chemioterapia preoperatoria. La chemioterapia adiuvante sulla base di 5-FU è stato somministrato a pazienti con stadi II, III e IV dopo resezione curativa. Abbiamo valutato diversi fattori clinico-patologici secondo il Rapporto coreana standardizzato Patologia per il cancro gastrico, la classificazione giapponese di gastrico Carcinoma (3 terza edizione inglese), e la Joint Committee on Cancer Staging Manual (7 ° edizione), che comprendono il sito del tumore, aspetto macroscopico e dimensioni, profondità di invasione, la classificazione istologica (vale a dire, intestinale o diffuso), e l'invasione linfovascolare [17-19]. esito clinico per ogni paziente è stato seguito dalla data di intervento chirurgico per la data del decesso o il 1 ° marzo 2012. periodi di follow-up variava da circa 1 a 81,5 mesi (media, 51.4 mesi). I casi persi al follow-up o di morte per qualsiasi causa diversa da cancro gastrico sono stati censurati dalle analisi tasso di sopravvivenza. caratteristiche clinico-patologici sono stati analizzati utilizzando t di Student
-test, il 2 di test χ , o il test esatto di Fisher per verificare le differenze di espressione Lumaca. trame di sopravvivenza cumulativi sono stati ottenuti utilizzando il metodo di Kaplan-Meier, e il significato è stato confrontato con il log-rank test. I fattori prognostici sono stati identificati con il metodo della regressione di Cox graduale (proporzionale modello di rischio), aggiustato per età dei pazienti, il sesso, sede del tumore, tipo morfologico (intestinale contro diffusa). La significatività statistica è stato fissato a P
< 0.05. calcoli statistici sono stati eseguiti con SPSS versione 10.0 per Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
analisi cDNA microarray di tessuti GC sulla base di lumaca sovraespressione
Un totale di 45 tessuti GC freschi sono stati ottenuti dal National biobanca di Corea, PNUH, e CNUH; l'approvazione è stata ottenuta dai loro pannelli revisione istituzionale. RNA totale è stato estratto dai tessuti freschi surgelati utilizzando un kit di isolamento Mirvana RNA (Ambion Inc., Austin, TX). Cinquecento nanogrammi di RNA totale è stato utilizzato per la sintesi di cDNA, seguita da un /fase di amplificazione etichettatura (in vitro
trascrizione) utilizzando il kit Illumina TotalPrep RNA Amplification (Ambion) per sintetizzare cRNA marcato con biotina. Le concentrazioni di cRNA sono stati misurati con il metodo RiboGreen (Quant-iT RiboGreen kit di analisi del RNA; Invitrogen-Molecular Probes, ON, Canada) utilizzando uno spettrofotometro victor3 (PerkinElmer, CT), e la qualità cRNA è stato determinato su un gel di agarosio 1%. Etichettato, materiale amplificato (1500 ng per array) è stato ibridato per Illumina HumanHT-12 BeadChips v4.0, secondo le istruzioni del produttore (Illumina, San Diego, CA). segnali di array sono stati sviluppati da streptavidina-Cy3. Gli array sono stati scansionati con un sistema Illumina iScan. I dati microarray sono stati normalizzati utilizzando il metodo di normalizzazione quantile nel software Illumina BeadStudio. Il livello di espressione di ogni gene è stato trasformato in un log di base 2 prima di ulteriori analisi. Excel è stata utilizzata principalmente per le analisi statistiche. differenze di espressione genica sono stati considerati statisticamente significativi se P
< 0,05; tutti i test sono stati 2-coda. analisi cluster sono state eseguite utilizzando cluster e TreeView [20]. Il programma di Gene Ontology (GO) (http:... //David ABCC ncifcrf gov /) è stato utilizzato per classificare i geni in sottogruppi in base alla funzione biologica. test esatto di Fisher è stata utilizzata per determinare se le proporzioni di geni in ogni categoria differivano dal gruppo. tessuti GC sono stati ulteriormente divisi in quelli con più elevate (≥75%) e inferiore (< 75%) i livelli di espressione lumaca; è stato identificato l'espressione genica differenziale tra i gruppi. dati microarray primarie sono disponibili in di NCBI GEO (Gene Expression Omnibus) di database (http:.....? //www NCBI nlm NIH gov /geo /interrogazione /ACC cgi acc = GSE38024).
Risultati
regolamento della migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico da Snail
RNA lentivirali basati knockdown e approcci iperespressione sono stati utilizzati per determinare il ruolo di lumaca in invasione e la migrazione delle linee di cellule di cancro gastrico. cellule SNU216 e SNU484 utilizzati in questo studio sono stabilite linee cellulari di adenocarcinoma gastrico da pazienti coreani. Queste cellule sono state infettate con un lentivirus che esprimono o non bersaglio o Lumaca
shRNAs -targeted per tacere. Un PLKO vettori lentivirali che aveva come obiettivo Lumaca
e un vettore PLKO vuoto sono stati usati per indurre Lumaca sovraespressione in SNU216 e SNU484 cellule. linee cellulari stabili policlonali sono stati selezionati con puromicina. Lumaca
espressione è stata determinata mediante RT-PCR e Western blotting; stabile Lumaca
atterramento (sh-lumaca) e linee cellulari sovraespressione della lumaca (OE-lumaca) sono stati ottenuti (Figura 1). Figura 1 Ruolo della Lumaca di invasione e la migrazione delle linee di cellule di cancro gastrico. cellule A. SNU216 (pannello superiore) e SNU484 (pannello inferiore) sono state infettate con lentivirus che esprimono sia non bersaglio shRNA (shNT
) o Lumaca
shRNA al giorno 0, e poi raccolto il giorno 7 dopo l'infezione. Lumaca
atterramento è stata determinata mediante RT-PCR e Western blotting; linee cellulari stabili sono stati generati per ciascuna delle linee cellulari (sh-chiocciola). Silenziamento di lumaca
in SNU216 e SNU484 cellule indotte diminuita la migrazione e l'invasione. cellule B. SNU216 (pannello superiore) e SNU484 (pannello inferiore) sono state infettate con lentivirus che esprimono sia un lentivirale PLKO vettore targeting Lumaca
o un vettore PLKO vuoto (EV) al giorno 0, e poi raccolte il giorno 7 dopo l'infezione . La sovraespressione di lumaca è stata determinata mediante RT-PCR e Western blotting; linea cellulare stabile è stato generato per ciascuna delle linee cellulari (O /E-lumaca). sovraespressione lumaca in cellule SNU216 e SNU484 indotto aumento della migrazione e l'invasione. C. Lumaca sovraespressione induce un aumento dell'espressione dell'mRNA di VEGF
e MMP11
in SNU216 e SNU484 cellule in tempo reale analisi RT-PCR. Pannello inferiore indica rappresentative figure RT-PCR per VEGF
, MMP11
, Chiocciola
, e GAPDH
. I dati mostrano la media ± SE di almeno 3 esperimenti indipendenti. * Indica P
< 0.05 da Student t-test
.
Per determinare i ruoli di lumaca in gastrica invasione delle cellule di cancro, abbiamo misurato chemiotattico l'invasione da parte delle cellule che utilizzano il sistema Transwell con filtri pre-rivestiti con Matrigel. Per misurare la migrazione delle cellule di cancro gastrico, abbiamo saggiato la migrazione delle cellule utilizzando un apparato camera di Boyden. Silenziamento di lumaca
da shRNA indotta diminuita migrazione e l'invasione delle cellule SNU216 e SNU484, come mostrato nella Figura 1A. In contrasto con la lumaca
risultati di silenziamento, sovraespressione di lumaca indusse aumentato la migrazione e l'invasione di SNU216 e SNU484 cellule, come mostrato in figura 1B. Sovraespressione di lumaca è stata anche associata ad un aumento VEGF e MMP11 (Figura 1C).
Effetto della lumaca sovraespressione su aggressività del tumore e la sopravvivenza del paziente GC
colorazione nucleare positivo per lumaca a livelli di ≤50%, 50-75%, e ≥75% è stata osservata nel 13,4% (42/314), 52,2% (164/314), e 34,4% (108/314), rispettivamente, 314 pazienti GC in analisi immunoistochimica. espressione Lumaca è stato osservato nel tipo intestinale e diffuso di GC (Figura 2A, B). sovraespressione Lumaca (≥75% positività) significativamente correlata con le dimensioni del tumore, il tipo lordo, profondità di invasione, l'invasione linfovascolare, invasione perineurale, e metastasi linfonodali (Tabella 1). sovraespressione lumaca è stata anche associata ad un aumento delle dimensioni del tumore (P = 0,028
) e scavato tipo lordo (P
< 0,001); e una maggiore invasività tumorale, cioè fase di T superiore (P
< 0,001) e la presenza di invasione perineurale (P
< 0,001) e linfovascolare tumorale emboli (P
= 0,002). Aumento metastasi linfonodali è stato anche legato alla Lumaca sovraespressione (P
= 0,002) .In secondo i dati di cui sopra mostrano la relazione positiva tra Lumaca sovraespressione e GC aggressività, Lumaca sovraespressione significativamente correlata con la sopravvivenza generale tra i pazienti CG (P
= 0,023) (Figura 2C). È stata osservata una relazione lineare tra una maggiore espressione nucleare di lumaca e la sopravvivenza ridotta (≤50%: 76,6 ± 2,7 mesi; 50-75%: 68,5 ± 2,0 mesi; ≥75%: 63,3 ± 2,8 mesi). sovraespressione Lumaca (≥75% di positività) è stato identificato come un predittore indipendente di prognosi sfavorevole in 314 pazienti con CG, aggiustato per l'età, il sesso, la classificazione istologica, e la posizione del tumore, utilizzando una regressione proporzionale modello di rischio di Cox (P = 0.033
; Tabella 2). Figura 2 espressione Lumaca di adenocarcinoma gastrico campioni di tessuto (GC) e le trame di Kaplan-Meir di sopravvivenza globale di 314 pazienti GC. Lumaca è stata per lo più espresso in nuclei di cellule GC (tipo intestinale (A), e il tipo di diffuso (anello con sigillo) cellule (B)) inclusi nei campioni di matrice di tessuto. Alcuni fibroblasti reattivi anche mostrato Lumaca espressione nucleare (ingrandimento: × 400). Analisi C. Kaplan-Meier di sopravvivenza globale dei pazienti GC sulla base di espressione Lumaca. Una relazione lineare tra aumento dell'espressione nucleare Lumaca e più breve sopravvivenza è stato osservato tra i pazienti CG (P = 0,023
). log-rank test è stato utilizzato per calcolare P valori
.
Tabella 1 Relazione tra espressione Lumaca e le caratteristiche clinico-patologici in 314 pazienti con cancro gastrico
Numero di pazienti (n = 314)

Lumaca positività
pvalue
< 75%
≥75%
Età (anni)
58,5 ± 10,6
59,1 ± 11,9
0,695
sesso maschile

218
143
75
0,996
femminile
96
63
33
Le dimensioni del tumore
≤4.0 cm
192
135
57
0,028
> 4,0 cm
122
71
51
Località
Alto /Medio
167
112
55
0,561
inferiore
147
94
53
profondità Invasion
T1
160
127
33
< 0.001
T2
41
26
15
T3
68
33
35
T4
43
19
24
tipo Gross
elevato
77
51
26
< 0.001
Appartamento /depresso
131
105
26
scavato
106
50

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