Overexpressie van Snail is geassocieerd met lymfeknoop metastase en slechte prognose bij patiënten met maagkanker

Overexpressie van Snail wordt geassocieerd met lymfeklier uitzaaiingen en een slechte prognose bij patiënten met maagkanker
Abstracte achtergrond
-mesenchymale transitie (EMT) speelt een belangrijke rol in de progressie van de tumor en invasie. Snail is een bekende regulator van EMT in diverse kwaadaardige tumoren. Deze studie onderzocht de rol van Snail bij maagkanker.
Methods
We onderzocht de effecten van het zwijgen opgelegd of overexpressie van de slak met behulp van Lenti-virale constructen bij maagkanker cellen. Immunohistochemische analyse van weefsel microarrays van 314 patiënten met gastrisch adenocarcinoom (GC) werd toegepast om de slak clinicopathologische en prognostische betekenis te bepalen. Differentiële genexpressie in 45 GC exemplaren met Snail overexpressie werd onderzocht met behulp van cDNA microarray-analyse.
Resultaten
Silencing van Snail door shRNA verminderde invasie en migratie in GC cellijnen. Omgekeerd, Slak overexpressie verhoogde invasie en migratie van maagkanker cellen, in lijn met de toegenomen VEGF en MMP11. Slak overexpressie (≥75% positief nucleaire kleuring) werd ook significant geassocieerd met tumorprogressie (P Restaurant < 0,001), lymfkliermetastasen (P
= 0,002), lymfovasculaire invasie (P
= 0,002), en perineurale invasie (P
= 0,002) in de 314 GC patiënten, en met een kortere overleving (P
= 0,023). cDNA microarray-analyse toonde 213 differentieel tot expressie van genen in GC weefsels met Slak overexpressie, met inbegrip van genen betrokken bij metastase en invasie.
Conclusie
Snail aanzienlijke invloed op invasieve /trekkende vermogen van GC's, en kan ook gebruikt worden als een voorspellende biomarker voor prognose of agressiviteit van GC.
Sleutelwoorden
Maag Darmkanker Snail lymfekliermetastasen Survival Achtergrond
-mesenchymale transitie (EMT), een ontwikkelingsstoornis proces waarbij epitheliale cellen te verminderen intercellulaire adhesie en het verwerven van myofibroblastische features, is cruciaal voor tumor progressie [1-3]. Tijdens EMT significante veranderingen optreden, waaronder downregulatie van epitheliale merkers zoals E-cadherine, translocatie van β-catenine (dwz dissociatie van membraneuze β-catenine en translocatie in het nucleaire compartiment) en opregulatie van mesenchymale merkers zoals vimentine en N -cadherin [3-6]. EMT wordt veroorzaakt door onderdrukking van E-cadherine expressie door EMT toezichthouders zoals Slak, Slug, en Twist. The Snail familie van zinkvinger transcriptie repressoren verdringt direct E-cadherine in vitro en in vivo

via een interactie tussen de COOH-terminale gebied en de 5 '- CACCTG-3 ' sequentie in de E-cadherine-promoter [7-9]. Slak is belangrijk verluidt in verschillende carcinomen, met inbegrip van niet-kleincellige carcinomen, ovariële carcinomen, carcinomen urothelial en hepatocellulair carcinoom [10-13]. Studies hebben ook gebruikt immunohistochemische analyses om de klinische betekenis van Snail overexpressie in adenocarcinoom van de maag (GC) [14, 15] tonen. Er zijn echter enkele rapporten over de rol van Snail in GC clinicopathologische, prognostische, en functioneel in vitro
analyseert evenals genexpressie resultaten. Daarom geëvalueerd effect Slak op invasiviteit /vermogen tot migratie in maagkanker cellijnen en ook de mogelijkheid onderzocht van Snail wordt gebruikt als een voorspellende marker voor het evalueren slechte prognose of tumor agressiviteit GC patiënten. We evalueerden ook de genexpressie patroon in 45 GC weefsels met Slak overexpressie, met behulp van cDNA microarrays.
Methods
shRNA-lentivirus-gemedieerde silencing en overexpressie van Snail bij maagkanker cellen
Human maagkanker cellijnen SNU216 en SNU484 werden verkregen uit Koreaanse Cell Line Bank (KCLB) en werden geverifieerd door DNA-profilering. Deze cellen gekweekt in RPMI1640-medium met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U /ml penicilline en 100 ug /ml streptomycine (Hyclone, Ogden, UT). Alle cellen werden bij 37 ° C in 5% CO 2 gehandhaafd. -Lentivirale gebaseerde RNA knock-down en overexpressie werden gebruikt voor zwijgen en overexpressie van Snail. Lentivirussen die ofwel niet-doelsoorten of Snail
-targeted shRNAs werden gebruikt voor het zwijgen op te leggen; een PLKO lentivirale vector targeting Slak golfreizen of een lege PLKO vector werden gebruikt voor overexpressie van Snail in de SNU216 en SNU484 cellen. Lentivirus voorraden werden gemaakt met de Virapower ™ lentivirale verpakkingsmix met de 293FT cellijn volgens het protocol van de fabrikant (Invitrogen, Carlsbad, CA). SNU216 en SNU484 cellen gekweekt tot 50% confluentie werden gedurende 24 uur in een 1: 1 verdunning van virus: medium met 5 ug /ml polybreen. Na een 24-uur herstelperiode in compleet medium zonder virus, werden polyklonale stabiele cellijnen geselecteerd en onderhouden in media die 5 ug /ml puromycine. Silencing of overexpressie van Snail werd bepaald door RT-PCR en western blotting.
Real-time RT-PCR-analyse van VEGF
, MMP11
en Slak
bij maagkanker cellen
Totaal cellulair RNA werd geëxtraheerd volgens de methode TRIzol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Voor RT-PCR-analyse werden 2 pg-hoeveelheden van RNA onderworpen aan cDNA-synthese met 200 U MMLV reverse transcriptase en 0,5 ug oligo (dT) primer -15 (Promega, Madison, WI, USA). Kwantitatieve real-time PCR werd uitgevoerd met de Rotor-Gene ™ -systeem (QIAGEN, Hilden, Duitsland) met behulp van AccuPower 2 × Greenstar qPCR Master Mix (Bioneer, Daejeon, Korea). cDNA in 1 pl van het reactiemengsel werd geamplificeerd met 0,5 U van GoTaq DNA polymerase (Promega) en 10 pmol elk van de volgende sense en antisense primers: GAPDH
5 - TCCATGACAACTTTGGTATCG-3 ', 5 '- TGTAGCCAAATTCGTTGTCA-3 '; Snail
5 '- CTTCCTCTCCATACCTG-3 ', 5 '- CATAGTTAGTCACACCTCGT-3 '; VEGF
5 '- TTGCTGCTCTACCTCCACCA-3 ', 5 '- GCACACAGGATGGCTTGAA-3 '; MMP11
5 '- CTTGGCTGCTGTTGTGTGCT-3 ', 5-AGGTATGGAGCGATGTGACG-3 '. De thermische cyclus was profiel: denaturatie gedurende 30 seconden bij 95 ° C, hybridisatie gedurende 30 seconden bij 52 ° C (afhankelijk van de gebruikte primers), en extensie gedurende 30 seconden bij 72 ° C. Voor semi-kwantitatieve evaluatie van expressieniveaus werden 30 cycli voor elke PCR-reactie. PCR-producten werden op grootte gefractioneerd op 1,0% ethidiumbromide /agarose gelen en gekwantificeerd onder UV-transilluminatie. De drempelcyclus (CT) wordt gedefinieerd als de fractionele aantal cycli waarbij de fluorescentie langs een vaste drempel boven de basislijn. Relatieve genexpressie werd gekwantificeerd met behulp van de gemiddelde CT-waarde voor elk drievoud monster minus de gemiddelde drievoud CT waarde voor GAPDH
. Verschillen tussen de controlegroep (lege vector) en experiment groepen (besmet met het lentivirus) werden berekend met de formule 2 - ([△ CT Lenti] - [△ CT control]) en uitgedrukt als een voudige verandering in expressie volgens de vergelijkende drempelcyclus methode (2- △△ CT) [16].
Western blotting
Cellen werden geoogst en verstoord lysisbuffer (1% Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 en proteaseremmers). Celafval werd verwijderd door centrifugatie bij 10.000 xg gedurende
10 min bij 4 ° C. De verkregen supernatanten werden gescheiden op een 12% SDS-PAGE onder reducerende omstandigheden gedenatureerd en overgebracht naar nitrocellulose membranen. De membranen werden geblokkeerd met 5% magere melkpoeder bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten en geïncubeerd met primaire antilichamen. De membranen werden gewassen en geïncubeerd met mierikswortel peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam. Het signaal werd zichtbaar gemaakt met behulp van een versterkte chemiluminescentie (Amersham, Buckinghamshire, UK).
Celmigratie Matrigel invasie assay
Maagkanker cellen werden geoogst met 0,05% trypsine bevattende 0,02% EDTA (Sigma-Aldrich), en gesuspendeerd in RPMI bij een concentratie van 3 x 10 3 cellen /putje. Membraanfilters (poriegrootte: 8 urn) in wegwerpbare 96 putjes chemotaxiskamers (Neuro Probe, Gaithersburg, MD) werden vooraf bekleed gedurende 4 uur bij 5 mg /ml fibronectine bij kamertemperatuur. Porties (50 pl /putje) van de celsuspensie werden in de bovenkamers en 1% FBS werd geladen in de onderste kamer. Na 24 uur incubatie werden de niet-migrerende cellen van de bovenste kamer met een wattenstaafje verwijderd; cellen aanwezig op het ondervlak van het insert werden gekleurd met Hoechst33342 (Sigma-Aldrich). Invasieve cellen werden geteld onder een fluorescentiemicroscoop bij 10 x vergroting.
Voor de Matrigel invasie assay, 3 x 104 cellen /putje gezaaid in de bovenste kamer, die werd bekleed met Matrigel (5 mg /ml in koud medium, BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA) en serumvrij medium dat 1% FBS of het voertuig is aan de onderste kamer toegevoegd. Na 24 uur incubatie werden de niet-migrerende cellen van de bovenste kamer met een wattenstaafje en de cellen aanwezig op het onderste vlak van het inzetstuk verwijderd werden gekleurd met Hoechst33342 (Sigma-Aldrich). Invasieve cellen werden daarna geteld onder een fluorescentiemicroscoop bij 10 x vergroting.
Tissue microarrays, immunohistochemie en interpretatie van de resultaten
A halfautomatisch tissue array-(Beecher Instruments, WI, USA) werd gebruikt om het weefsel microarrays construeren . We verkregen 3 weefselkernen, elk 0,6 mm in diameter, van tumormateriaal uit GC patiënten. Kernen werden niet verzameld uit de meer invasieve frontale of centrale gebieden van de tumoren. Glaasjes werden gebakken bij 60 ° C gedurende 30 min, paraffine ontdaan door xyleen, en vervolgens gerehydrateerd. De secties werden vervolgens ondergedompeld in citraatbuffer antigen herstel buffer, correct voor antigen retrieval, behandeld met 3% waterstofperoxide in methanol om endogene peroxidase activiteit te blussen en vervolgens geïncubeerd met 1% runderserumalbumine om niet-specifieke binding te blokkeren. Daarna werden de secties geïncubeerd met konijn anti-slak (Abcam, GB) overnacht bij 4 ° C. Normaal konijnenserum werd gebruikt als een negatieve controle. Na wassen, werden weefselcoupes behandeld met secundaire antilichamen, tegengekleurd met hematoxyline, gedehydrateerd en gemonteerd. Ten minste 500 tumorcellen werden geteld. Het percentage cellen met Snail + kernen werd uitgedrukt in verhouding tot het totale aantal tumorcellen geteld. Nucleaire expressie van Snail werd beoordeeld door het classificeren van de omvang van de positieve nucleaire kleuring als ≤50%, 50-75% of ≥75%.
Clinicopathologische en overleving analyse van maagkankerpatiënten
We bestudeerden een cohort van 314 GC patiënten die elk onderging een gastrostomie met lymfeklierdissectie bij Pusan ​​National University Hospital (PNUH) tussen 2005 en 2007. De groep bestond uit 218 mannen en 96 vrouwen met een gemiddelde leeftijd van 58,3 jaar (range, 25-83 jaar). Standard-formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde secties werden verkregen van de afdeling Pathologie, PNUH, en de Nationale Biobank Korea, PNUH. De studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board. Geen van de patiënten preoperatief radiotherapie en /of chemotherapie. Adjuvante chemotherapie op basis van 5-FU werd toegediend aan patiënten met stadium II, III en IV na curatieve resectie. We onderzocht een aantal klinisch-pathologische factoren die volgens de Koreaanse Standardized Pathologie Rapport voor maagkanker, de Japanse classificatie van maagcarcinoom (3 rd Engels editie), en de gemengde commissie American on Cancer Staging Manual (7 e editie), met inbegrip van de tumor site, bruto uiterlijk en grootte, diepte van invasie, histologische classificatie (dat wil zeggen, intestinale of diffuse) en lymfovasculaire invasie [17-19]. Klinische resultaten voor elke patiënt werd gevolgd vanaf de datum van de operatie om de datum van overlijden of 1 maart 2012. Follow-up periode varieerde van ongeveer 1-81,5 maanden (gemiddeld 51,4 maanden). Cases lost to follow-up of overlijden door welke oorzaak dan maagkanker werden gecensureerd uit de overlevingskans analyse. Clinicopathologische eigenschappen werden geanalyseerd met Student's t-test
, de χ 2 test of Fisher's exact test om te testen op verschillen in Snail-expressie. Cumulatieve survival percelen werden verkregen met behulp van de Kaplan-Meier-methode, en het belang werd vergeleken met behulp van de log-rank test. Prognostische factoren werden geïdentificeerd met behulp van de Cox regressie stapsgewijze methode (proportionele hazard model), gecorrigeerd voor de patiënt leeftijd, geslacht, tumor, het type morfologische (darm versus diffuse). Statistische significantie werd vastgesteld op P Restaurant < 0,05. Statistische berekeningen werden uitgevoerd met SPSS voor Windows versie 10.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
CDNA microarray analyse van GC weefsels gebaseerd op slak overexpressie
totaal 45 GC verse weefsels werden verkregen van de National biobank van Korea, PNUH en CNUH; goedkeuring werd verkregen van de institutionele review boards. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit de vers ingevroren weefsel met een Mirvana RNA isolatie kit (Ambion Inc., Austin, TX). Vijfhonderd nanogram totaal RNA werd gebruikt voor cDNA-synthese, gevolgd door een amplificatie /labeling stap (in vitro transcriptie
) met de Illumina TotalPrep RNA Amplification kit (Ambion) te synthetiseren biotine-gelabelde cRNA. cRNA concentraties werden gemeten volgens de methode RiboGreen (Quant-iT RiboGreen RNA assay kit, Invitrogen-Molecular Probes, ON, Canada) met een Victor3 spectrofotometer (PerkinElmer, CT) en cRNA kwaliteit werd bepaald op een 1% agarosegel. Gelabeld geamplificeerd materiaal (1500 ng per array) werd gehybridiseerd aan Illumina HumanHT-12 BeadChips v4.0, volgens de instructies van de fabrikant (Illumina, San Diego, CA). Array signalen werden ontwikkeld door streptavidine-Cy3. Arrays werden gescand met een Illumina iScan systeem. De microarray gegevens werden genormaliseerd met behulp van de kwantiel normalisatiemethode in Illumina BeadStudio software. De expressie van elk gen werd getransformeerd in een logboek 2 basis voor verdere analyse. Excel werd voornamelijk gebruikt voor statistische analyse. Genexpressie verschillen werden als statistisch significant beschouwd als P Restaurant < 0,05; Alle testen waren 2-tailed. Cluster analyses werden uitgevoerd met cluster en Treeview [20]. Het programma-gen ontologie (GO) (http:... //David ABCC ncifcrf gov /) werd gebruikt om genen te categoriseren in subgroepen op basis van biologische functie. Fisher's exact test werd gebruikt om te bepalen of de verhoudingen van genen in elke categorie verschilden per groep. GC weefsels werden verder verdeeld in mensen met een hoger (≥75%) en lager (< 75%) niveaus van Snail meningsuiting; differentiële genexpressie tussen de groepen werd geïdentificeerd. Primaire microarray gegevens beschikbaar zijn in NCBI's GEO (Gene Expression Omnibus) database (http:.....? //Www NCBI NLM nih gov /geo /vraag /acc cgi acc = GSE38024).
Resultaten
Regulering van migratie en invasie van maagkanker cellen door Snail
Lentivirale-gebaseerde RNA knockdown en overexpressie benaderingen werden gebruikt om de rol van Snail in invasie en migratie van maagkanker cellijnen te bepalen. SNU216 en SNU484 cellen die in deze studie worden vastgesteld adenocarcinoom cellijnen het Koreaans patiënten. Deze cellen werden geïnfecteerd met een lentivirus die ofwel niet-doelsoorten of Snail
-targeted shRNAs te zwijgen. Een PLKO lentivirale vector die gericht Slak Kopen en een lege PLKO vector werden gebruikt om Snail overexpressie te induceren in SNU216 en SNU484 cellen. Polyklonale stabiele cellijnen werden geselecteerd met puromycine. Slak
expressie werd bepaald door RT-PCR en Western blotting; stabiele Slak
knock-down (sh-Snail) en Slak overexpressie cellijnen (OE-Snail) werden verkregen (Figuur 1). Figuur 1 De rol van Snail in invasie en migratie van maagkanker cellijnen. A. SNU216 (bovenste paneel) en SNU484 (onderste paneel) cellen werden geïnfecteerd met lentivirussen die ofwel niet-doelwitorganismen shRNA (shNT
) of Snail
shRNA op dag 0, en vervolgens op dag 7 na infectie geoogst. Slak
knockdown werd bepaald door RT-PCR en Western blotting; stabiele cellijnen werden gegenereerd voor elk van de cellijnen (sh-Snail). Silencing van Snail
in SNU216 en SNU484 cellen geïnduceerde verminderde migratie en invasie. B. SNU216 (bovenste paneel) en SNU484 (onderste paneel) cellen werden geïnfecteerd met lentivirussen die ofwel een lentivirale vector PLKO gericht Slak
of een lege vector PLKO (EV) op dag 0, en vervolgens geoogst op dag 7 na infectie . De overexpressie van Snail werd bepaald door RT-PCR en Western blotting; stabiele cellijn werd gegenereerd voor elk van de cellijnen (O /E-slak). Slak overexpressie in SNU216 en SNU484 cellen geïnduceerde verhoogde migratie en invasie. C. Snail overexpressie geïnduceerde verhoogde mRNA expressie van VEGF Kopen en MMP11
in SNU216 en SNU484 cellen in real-time RT-PCR-analyse. Onderste paneel geeft representatieve RT-PCR cijfers van VEGF
, MMP11
, Slak
en GAPDH
. Gegevens tonen het gemiddelde ± SE van ten minste 3 onafhankelijke experimenten. * Geeft P Restaurant < 0.05 door Student's t-test
. Belgique Om Snail's rollen bepalen bij maagkanker cel invasie, gemeten we chemotactische invasie van de cellen met behulp van de Transwell systeem met filters pre-gecoat met Matrigel. Om migratie van maagkanker cellen te meten, getest we celmigratie met behulp van een Boyden kamer apparaat. Silencing van Snail
door shRNA geïnduceerde verminderde migratie en invasie van SNU216 en SNU484 cellen, zoals weergegeven in figuur 1A. In tegenstelling tot de slak
silencing resultaten overexpressie van Snail geïnduceerde verhoogde migratie en invasie van SNU216 en SNU484 cellen, zoals getoond in Figuur 1B. Overexpressie van Snail werd ook geassocieerd met een verhoogde VEGF en MMP11 (figuur 1C).
Effect van Snail overexpressie op de tumor agressiviteit en GC overleving van patiënten
Positieve nucleaire kleuring voor de slak op een niveau van ≤50%, 50-75%, en ≥75% werd waargenomen bij 13,4% (42/314), 52,2% (164/314) en 34,4% (108/314) van respectievelijk de GC 314 patiënten immunohistochemische analyse. Slak expressie werd opgemerkt in darm- en diffuse type GC (Figuur 2A, B). Slak overexpressie (≥75% positiviteit) significant gecorreleerd met tumorgrootte grovere vorm, invasiediepte, lymfovasculaire invasie, perineurale invasie en lymfeklier (tabel 1). Slak overexpressie werd ook geassocieerd met een verhoogde grootte tumor (P
= 0,028) en opgegraven bruto type (P Restaurant < 0,001); en verhoogde tumor invasiviteit, d.w.z. hoger T-stadium (P
< 0,001) en de aanwezigheid van perineurale invasie (P
< 0,001) en lymfovasculaire tumor emboli (P
= 0,002). Verhoogde lymfeknoop metastase ook verband met Snail overexpressie (P = 0,002
) .In overeenstemming met de bovenstaande gegevens tonen duidelijk verband tussen overexpressie Slak en GC agressiviteit, Slak overexpressie significant gecorreleerd met de totale overleving bij GC patiënten (P
= 0,023) (figuur 2C). Een lineair verband waargenomen tussen de toegenomen nucleaire expressie van Snail en een kortere overleving (≤50%: 76,6 ± 2,7 maanden; 50-75%: 68,5 ± 2,0 maanden; ≥75%: 63,3 ± 2,8 maanden). Slak overexpressie (≥75% positiviteit) werd geïdentificeerd als een onafhankelijke voorspeller van slechte prognose bij 314 patiënten met GC, gecorrigeerd voor leeftijd, geslacht, histologische indeling, en tumor locatie, met behulp van een Cox regressie proportionele hazard model (P = 0,033
; Tabel 2). Figuur 2 Slak expressie in adenocarcinoom van de maag (GC) weefselmonsters en Kaplan-Meir percelen van de totale overleving van 314 GC patiënten. Slak was meestal uitgedrukt in kernen van GC cellen (intestinale type (A) en diffuse type (zegelring) cellen (B)) in weefselarray monsters. Sommige reactief fibroblasten toonde ook aan slak nucleaire expressie (vergroting: × 400). C. Kaplan-Meier-analyse van de totale overleving van patiënten op basis van GC Slak expressie. Een lineair verband tussen de toename van de slak nucleaire expressie en kortere overleving werd gezien bij GC patiënten (P
= 0,023). Log-rank test werd gebruikt om de P
waarden te berekenen.
Tabel 1 Verband tussen Snail expressie en clinicopathologische kenmerken bij 314 patiënten met maagkanker
Aantal patiënten (N = 314)

Snail Positiviteit
p-waarde
< 75%
≥75%
Leeftijd (jaar)
58,5 ± 10,6
59,1 ± 11,9
0,695
Sex
Man
218
143
75
0,996
Female
96
63
33
tumorgrootte
≤4.0 cm
192
135
57
0,028 Restaurant > 4,0 cm
122
71
51
Locatie
Upper /Midden
167
112
55
0,561
Neder
147
94
53
Invasion diepte
T1
160
127
33 Restaurant < 0.001
T2
41
26
15
T3
68
33
35
T4
43
19
24
Gross soort
Verhoogde
77
51
26 Restaurant < 0.001
Flat /depressief
131
105
26
Opgegraven
106
50
56
histologische soort
Intestinal
182
123
59
0,609
Zend
122
76
46
Mixed
10

• Airway cellulariteit, lipiden beladen macrofagen en microbiologie van maagsap en luchtwegen bij kinderen met reflux oesophagitis
• Prognostische betekenis van neutrofielen lymfocyten ratio en bloedplaatjes lymfocyten verhouding in gevorderde maagkanker patiënten behandeld met FOLFOX chemotherapy