A expressão e significado clínico de miR-132 em câncer gástrico patients

a expressão clínica e significância de miR-132 em pacientes com câncer gástrico arte abstracta
Fundo e objetiva
miR-132 desempenha um papel na regulação da morfologia neuronal e excitabilidade celular. Pouco se sabe sobre os efeitos do miR-132 em câncer. O objetivo deste estudo é avaliar a expressão de miR-132 e sua relevância clínica em câncer gástrico.
Métodos
tecidos cancerosos e os correspondentes tecidos normais de 79 pacientes com câncer gástrico foram examinados para a expressão de miR-132 utilizando PCR quantitativa e a associação entre os níveis de expressão de miR-132 e fatores clínico-patológicos e prognóstico foi analisada.
resultados Online em 79 amostras clínicas de pacientes com câncer gástrico, miR-132 níveis de expressão em tecidos de câncer foram significativamente maiores do que aqueles em os tecidos normais correspondentes (P
= 0,001). maiores níveis de expressão de miR-132 foram associados com maior frequência metástases em linfonodos (P
= 0,033), êmbolos tumorais mais linfático (P
= 0,007), e estágio mais avançado (P
= 0,016). Além disso, a expressão de miR-132 foi um fator prognóstico independente para a sobrevida global (P
= 0,020).
Conclusão
miR-132 pode servir como um fator prognóstico eficiente para pacientes com câncer gástrico.
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Palavras-chave
gástrica cancer Prognosis marcadores biológicos Introdução
Embora a incidência de câncer gástrico foi substancialmente decrescente há várias décadas, ainda é o quarto câncer mais comum ea segunda causa mais frequente de morte por câncer [1, 2]. Um múltiplo de genes parecem contribuir para o comportamento biológico maligna do cancro gástrico [3, 4]. É muito importante para identificar os factores de prognóstico, a fim de maximizar o efeito terapêutico e minimizar os efeitos adversos no tratamento de doentes com cancro.
MicroRNAs são uma classe de pequenos RNAs não codificantes endógenos que funcionam como reguladores de genes, regulando ARN mensageiro tradução e degradação [5]. MicroRNAs desempenham um papel crucial na regulação das funções normais, tais como a proliferação, a diferenciação e a apoptose. Além disso, a desregulação dos miRNAs contribuir para a carcinogênese e progressão do câncer [6, 7]. Como membro da família miRNAs, miR-132 desempenha um papel importante na inflamação, angiogênese e desenvolvimento neural [8-10]. Recentemente, alguns estudos mostraram que a desregulação de miR-132 foi relacionada com uma variedade de tumores humanos, tais como cancro do pulmão de não pequenas células, osteossarcoma, cancro da mama, carcinoma hepatocelular, cancro da próstata, e cancro do pâncreas [11-16]. No entanto, não há relatos sobre a expressão e significado clínico de miR-132 em câncer gástrico.
Neste estudo, a expressão de miR-132 em pacientes com câncer gástrico foi examinada e foi analisada a associação entre o miR-132 e os parâmetros clínico . Além disso, avaliou-se a expressão de algumas proteínas envolvidas no controlo do ciclo celular (p21, p53), a proliferação e a diferenciação tecidual (c-myc). proteínas p21 e p53 são os produtos de genes supressores de tumores, os quais são activados pela modulação da proliferação celular através do controlo do checkpoint paragem em G1 do ciclo celular [17, 18]. proteína c-myc é um tipo de fator de transcrição.
Pacientes e métodos
câncer gástrico humano e foram obtidos de 79 pacientes submetidos a gastrectomia no Departamento de câncer de estômago e de tecidos moles sarcomas, Fudan University Cancer Shanghai tecidos normais correspondentes center, entre janeiro de 2007 e dezembro de 2009. a gastrectomia parcial foi realizada em 36 pacientes, e gastrectomia total foi realizada em outros 43 pacientes. Pelo menos 4 cm margens de ressecção do tumor bruto foram garantidos para todos os pacientes. Um total de 71 pacientes receberam quimioterapia adjuvante. Após a ressecção, os espécimes foram imediatamente congeladas em azoto líquido e depois armazenado em frigorífico a -80 °. Os critérios de inclusão para este estudo foram adenocarcinoma e os dados patológica completa; Os critérios de exclusão foram terapia neoadjuvante, disseminação peritoneal e metástases à distância. Os dados foram obtidos a partir de seus relatórios operacionais e patológicos, e dados de acompanhamento foram obtidos por telefone ambulatório e banco de dados clínica. O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes, e este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Shanghai Cancer Center da Universidade de Fudan. Extração
RNA e quantitativa PCR em tempo real
O RNA total a partir de tecido foi extraído com o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Os ensaios quantitativos de PCR em tempo real (qRT-PCR) foram realizados para detectar a expressão endógena de miR-132 de acordo com o método de Applied Biosystems. Resumidamente, o ADNc foi transcrito reversamente a partir de amostras de ARN total utilizando um iniciador específico haste-laçada-miARN a partir dos Ensaios Taqman microRNA e reagentes do TaqMan ® MicroRNA Transcrição Reversa kit (ABI, Forest City, CA, EUA). Em seguida, os produtos de PCR foram amplificados a partir de amostras de cDNA utilizando TaqMan Ensaios microRNA em conjunto com o TaqMan® Universal PCR Master Mix e a quantidade de produto de PCR foram monitorizados utilizando Applied Biosystems 7900 Sequence Detection System. RNA nuclear pequeno U6 foi usada como um controlo interno. A quantidade relativa de miR-132 foi calculada usando (-Delta deltaC (t)) Método 2 [19].
Coloração imuno-histoquímica
p21, p53 e c-myc foram detectadas pelo método de imuno-histoquímica. Todos os anticorpos primários e anticorpos monoclonais de ratinho foram adquiridos da Dako (Hamburgo. Alemanha). coloração imuno-histoquímica foi realizada pelo método de melhorar o sistema polímero marcado (ELPS). Após incubação durante a noite a 4 ° C com anti-p21, p53, e o anticorpo de c-myc, as secções foram tratadas de acordo com métodos de imunoperoxidase, utilizando um padrão de biotina estreptavidina peroxidase complexo kit (Kit LSAB + /HRP; Dako). A reacção de peroxidase foi em seguida desenvolvida com diaminobenzidina (Dako). secções de controlo negativo foram submetidos ao mesmo procedimento, excepto que o primeiro anticorpo foi substituído por solução salina de tampão fosfato (PBS) [20].
pontuação coloração imuno-histoquímica
Todos os cortes foram avaliados por dois patologistas sem conhecimento do resultado clínico. A percentagem de células e as intensidades de coloração imuno-reactivo foram avaliados em cada amostra. A percentagem de células imunorreactivas foi graduada numa escala de 0 a 4: sem coloração é pontuada como 0, 1-10% de células coradas pontuado como 1, 11-50%, como 2, 51-80%, como 3, e 81- 100% como 4. As intensidades de coloração foram graduadas de 0 a 3: 0 é definido como negativo, como um fraco, moderado como 2, 3 e tão forte, respectivamente. Os dados brutos foram convertidos para o marcador imuno-histoquímico (IHS), multiplicando as pontuações quantidade e intensidade. Em última análise, os casos tiveram uma pontuação inferior a 1 foram considerados como negativos, e ≥ 1 foi considerado positivo [20].
Análise estatística
características dos pacientes e características clínico-patológicos foram analisados ​​utilizando os dois Student -tailed t
-teste para a variável contínua e χ 2 teste para variável categórica. As curvas de sobrevida global foram calculadas pelo método de Kaplan-Meier, e as diferenças entre as curvas de sobrevida foram examinados com o teste de longa-rank. Os fatores prognósticos independentes foram examinadas por análise de sobrevida multivariada Cox modelo de riscos proporcionais. O nível aceito de significância foi de P Art < 0,05. análises e gráficos estatísticos foram realizados com o pacote estatístico SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL) Resultados
características clínicopatológicos
Havia 62 homens e 17 mulheres. (3,6: 1), com uma média a idade de 58 anos. Houve 7 (8,9%) cancros gástricos precoces e 72 (91,1%) avançou cancros gástricos. De acordo com o tipo histológico, foram observados tumores bem diferenciados em 3 (3,8%) pacientes, moderadamente diferenciado em 11 (13,9%) pacientes e tumores pouco diferenciados em restantes 65 (82,3%) pacientes. Dos 79 pacientes, 25 (31,6%) tinham tumores localizados no terço superior, 15 (19,0%) tinham tumores no terço médio, 36 (45,6%) tinham tumores no terço inferior do estômago, e 3 (3,8%) tumores ocuparam dois terços ou mais do estômago. Metástase linfática foi observada em 57 pacientes, a taxa de metástases foi de 72,2%. A distribuição de estágio patológico foi a seguinte: 10 (12,6%) pacientes pertenciam à fase I, 24 (30,4%) II, e 45 (57%) III
A expressão e correlação de miR-132, p21, p53. , e c-myc
miR-132 em níveis de 79 canceroso (T) e correspondentes tecidos normais (N) foram examinadas por qRT-PCR. A maioria dos tecidos de tumor (57/79, 72%) apresentaram níveis elevados de miR-132 em comparação com os tecidos normais correspondentes, com um aumento médio de 2,3 vezes. miR-132 em níveis de tecidos cancerosos (média ± DP, 0,35 ± 0,58) foram significativamente mais elevados do que aqueles nos tecidos cancerosos correspondentes (média ± DP, 0,15 ± 0,35, P
< 0,05). As expressões de p21, p53 e c-myc foram examinados por coloração imuno-histoquímica. a expressão da p21 foi positiva em 64,6% de todos os tecidos com câncer gástrico. p21 foi observada coloração no núcleo de células de carcinoma. expressão da p53 foi positiva em 74,7% de todos os tecidos com câncer gástrico. p53 foi observada no núcleo de células de carcinoma. a expressão de c-myc era positivo em 44,3% de todos os tecidos de cancro gástrico. coloração de c-myc foi observada no citoplasma das células de carcinoma. expressão de miR-132 foi associada com a p53 e c-myc. Não houve correlação com p21. Além disso, p53expression foi associado com c-myc (Tabela 1) .table 1 resultados positivos de correlações entre marcadores biológicos
marcadores biológicos
Os coeficientes de correlação
(R)
P value

miR-132
P53
0.274
0.015
miR-132
c-myc
0.228
0.044
P53
c-myc
0.235
0.038
significado clínico de miR-132 em câncer gástrico
79 pacientes com câncer gástrico foram divididos em dois grupos, incluindo miR 21-grupo de alto expressão (T /N > 0,5, n = 33) e grupo de baixo expressão (T /N < 0,5, n = 46) de acordo com a ração média T /N de miR-132 de expressão. Foi analisada a correlação entre a expressão de miR-132 e os parâmetros patológicos. Os resultados mostraram que os pacientes com elevada expressão de miR-132 teve mais frequentes metástases em linfonodos (P
= 0,033), embolia mais linfática tumor (P
= 0,007), e estágio mais avançado (P = 0,016
). No entanto, não houve diferenças significativas sobre sexo, idade, tipo histológico, localização do tumor, tamanho do tumor, invasão nervoso e estágio T (Tabela 2). No sobrevivência global, os pacientes com a expressão elevada de miR-132 teve um prognóstico significativamente pior do que aqueles com miR-132 de expressão baixa (P = 0,000
) (Figura 1). A análise univariada de sobrevida global mostrou que a expressão relativa de miR-132, invasão nervosa, êmbolos tumorais linfático, e estágio patológico foram preditores de prognóstico. A análise multivariada, incluindo todos os fatores prognósticos significativos mencionados na análise univariada, foi realizada para determinar os fatores prognósticos independentes para câncer gástrico. A análise multivariada mostrou que o nível de expressão de miR-132 e estágio patológico foram fatores independentes de prognóstico (Tabela 3) .table 2 miR-132 de expressão e correlação clínica fatores
Variáveis ​​
alta expressão n = 33

expressão Baixa n = 46
P
Sexo
0,618
Masculino
25
37
Feminino
8
9
Idade
0,556 Art < 60
18
22
≥60
15
24
classificação histológica
0,412
mal -differentiated
28
36
5
7
bem diferenciado Moderadamente diferenciado 0 Sims 3
localização do tumor
0,467
terço superior
10
15
Oriente terceira
8
7
Lower terceiro
15
21
dois terço ou mais
0
3
tamanho do tumor (cm)
0,862 Art < 5
18
26 invasão
≥5
15
20
Nervoso
0,096
Sim
22
22
Sem
11
24
linfática êmbolos tumorais
0,005
Sim
26
22
Não
7
24
estágio T
0,070
T1, T2
6
17
T3, T4
nó 27
29
linfa metástase
0,033
Sim
28
29
Sem
5
17
estágio patológico
0,016
I
2
8
II
6
18
III
25
20
Figura 1 Comparação de sobrevivência de acordo com a expressão de miR-132. Houve diferenças significativas entre miR-132 alta expressão e miR-132 baixa expressão (P
= 0,000).
Tabela 3 A análise multivariada dos pacientes por modelo de Cox
Variável
χ2

P
vale
RR
95% CI
miR-132 expressão
5,447
0,020
2.414
1,152-5,059 invasão
Nervoso
1.918
0,166
1.890
0,768-4,655
êmbolos tumor linfático
0,173
0,677
0,838
0,366-1,923
estágio patológico
8.742
0,003
4.356
1,642-11,555
Discussão
A identificação de fatores prognósticos em câncer gástrico foi essencial para prever a sobrevida dos pacientes e determinar estratégias terapêuticas ideais . A profundidade de invasão e metástase ganglionar foram os fatores prognósticos mais importantes no câncer gástrico. Como resultado da variabilidade do prognóstico dentro mesmo estágio patológico de câncer gástrico, tem havido uma série de pesquisas para marcadores biológicos específicos para identificar pacientes com prognóstico [21-28]. Os marcadores biológicos, tais como microARN, c-Met, L1CAM, proteína lipase endotelial, número de cópia variável de DNA mitocondrial (mtDNA), TIMP3, HK6, e Ezrin têm sido estudados extensivamente. Como um romance biomarcador, o potencial dos miRNAs em predizer o prognóstico é cada vez mais estudado. miR-132 é um miARN altamente conservada transcrever a partir de uma região intergénica no cromossoma humano 17 por a proteína de ligação do factor de transcrição de cAMP elemento de resposta a [29]. A maioria dos relatórios de combates regulação miR-132 e funções biológicas emergiu dos estudos realizados no contexto neuronal. Além disso, o miR-132 também tem sido descrita num certo número de outras áreas, tais como a inflamação, a transformação das células e tumorigénese. miR-132 foi mostrada para ser regulada para cima ou para baixo-regulado em diferentes cancros humanos [16, 30, 31]. Alguns estudos mostraram que o miR-132 pode promover a proliferação de células [31]. No entanto, ainda há relatos de miR-132 em câncer gástrico.
Neste estudo, nós investigamos miR-132 expressão no câncer gástrico e determinou se pudesse prever os resultados dos pacientes. Descobrimos que a expressão de miR-132 era mais elevada em tecidos cancerosos em comparação com os tecidos normais correspondentes. A causa exacta da expressão elevada de miR-132 em cancro gástrico é desconhecido. Parque JK et ai. relatada [31] que a terbutalina B2AR agonista aumenta a expressão de miR-132. miR-132 foi transcricionalmente activado pelo CREB em neurónios [32]. antagonistas B2AR inibiu a activação da CREB [33]. Portanto, é possível que a simulação de B2AR aumentar a expressão de miR-132 a seguir à activação da CREB.
Os resultados mostraram que a elevada expressão de miR-132 em cancro gástrico estava significativamente correlacionada com características clinicopatológicas agressivos, tais como mais frequente metástases nos linfonodos, mais êmbolos tumor linfático, e estágio mais avançado. Estes resultados sugerem que a supra-regulação de miR-132 desempenhou um papel importante na progressão do cancro gástrico. Curiosamente, verificou-se que a expressão de miR-132 foi associada com a p53 e c-myc. Alguns estudos anteriores mostraram que algumas microARNs poderia mediar e regular a supressão do tumor exercida pela p53 ou c-myc [34, 35]. Jiang L et al. [34] verificaram que tem-miR-125a-3p pode induzir apoptose por meio da via da p53. Zhang, N. et al. [35] verificaram que o miR-150 pode promover a proliferação de células de cancro do pulmão por segmentação p53. Wang B et al. [36] descobriu que havia um ciclo de feedback negativo dupla entre miR-122 e c-myc em câncer hepatocelular. Li X, et al. [37] verificaram que c-Myc promovida a expressão de miR-23a maduro, miR24-2, e miR27a e posteriormente promovido a migração de células de carcinoma mamário e invasão. No entanto, a correlação exata entre miR-132 e p53, c-myc não é clara e continua a ser elucidado em estudos futuros. Nós investigamos a correlação de expressão de miR-132 com o prognóstico de pacientes com câncer gástrico, descobriu que pacientes com alta expressão de miR-132 teve sobrevida global mais pobres que as pessoas com baixa expressão de miR-132. Mais importante ainda, a análise multivariada revelou que a alta miR-132 expressão era indicador de prognóstico independente. Foi controvérsia se o miR-132 desempenhado mesmo valor prognóstico em diferentes tipos de tumores. Parker et al. relatada [38] que a elevada expressão de miR-132 foi associado com prognóstico pobre em doentes com glioblastoma multiforme primária. No entanto, Yang et al. [12] relataram que pacientes com osteossarcoma com baixa expressão de miR-132 teve sobrevida global e livre de doença mais pobres. Era possível que o miR-132 desempenhado diferentes funções em diferentes tumores. Wang et al. [39] verificaram que a sobre-expressão de miR-132 suprimida na proliferação celular in vitro e no crescimento do tumor in vivo. Li et al. [13] demonstraram que a sobre-expressão de miR-132 poderia inibir a proliferação de células de cancro da mama. Por outro lado, Park et al. [31] relataram que a sobre-expressão de miR-132 aumentou a proliferação de células de cancro pancreático.
Tomados em conjunto, o nosso estudo indicou que o miR-132 foi regulada positivamente em cancro gástrico e pode ser um biomarcador molecular independente para previsão do prognóstico de gástrica Câncer. Enquanto isso, como resultado de uma pesquisa de amostra pequeno, é necessário um grande estudo de caso para confirmar o valor prognóstico do miR-132 em câncer gástrico.
Declarações
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Abaixo estão os links aos arquivos submetidos originais dos autores para imagens. 13000_2014_947_MOESM1_ESM.tif Autores 'arquivo original para a figura 1 Conflito de interesses
Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Autores. "Contribuições
Concebido e desenhado os experimentos: XWL HMY HC YNW. Realizou os experimentos: XWL. Analisados ​​os dados: XWL HMY. Contribuíram reagentes /materiais /ferramentas de análise: HC YNW. Escreveu o jornal: XWL. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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