fenótipos moleculares de imuno-histoquímica de câncer gástrico com base em SOX2 e CDX2 prever o resultado do paciente

fenótipos moleculares de imuno-histoquímica de câncer gástrico com base em SOX2 e CDX2 prever o resultado paciente da arte abstracta
Fundo
O câncer gástrico continua a ser um grave problema de saúde em todo o mundo. Os pacientes beneficiariam muito a descoberta de novos biomarcadores que predizem desfecho mais precisão e permitir um melhor tratamento e as decisões de acompanhamento. Aqui, usamos um estudo retrospectivo observacional para avaliar a expressão e valor prognóstico de fatores de transcrição SOX2 e CDX2 no câncer gástrico.
Métodos
SOX2, CDX2, MUC5AC e expressão MUC2 foram avaliadas em 201 tumores gástricos por imuno-histoquímica . SOX2 e expressão CDX2 foram cruzados com dados clínico-patológicos e de acompanhamento para determinar seu impacto no comportamento do tumor e resultado. Além disso, SOX2
lócus cópia estatuto número foi avaliado por FISH (N = 21) e Copiar número de variação Assay (N = 62).
Resultados
SOX2 foi expressa em 52% dos tumores gástricos e foi significativamente associado ao sexo masculino, estágio T e estágio N. Além disso, a expressão SOX2 previu pior sobrevida do paciente, ea combinação com CDX2 definidos dois fenótipos moleculares, SOX2 + CDX2 - contra SOX2 -CDX2 +, que prever o pior eo melhor longa evolução dos pacientes prazo. Estes perfis combinados com os parâmetros clínico estratificar o prognóstico de pacientes com tumores intestinais e em expansão e naqueles sem sinais de invasão venosa. Finalmente, SOX2
número de cópias lócus ganhos foram encontrados em 93% das amostras que atingiram o limite de amplificação em 14% e significativamente associar-se com a expressão da proteína.
Conclusões
Nós mostramos, pela primeira vez, que SOX2 combinado com perfil de expressão CDX2 no câncer gástrico segregar pacientes em diferentes grupos prognósticos, complementando as informações clínico-patológico. Demonstramos ainda um mecanismo molecular para a expressão SOX2 em um subconjunto de casos de câncer gástrico.
Palavras-chave
SOX2 CDX2 gástrica câncer de prognóstico de sobrevivência fundo
O câncer gástrico é um dos cânceres mais comumente diagnosticados e agora a terceira principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. classificação Laurén divide câncer gástrico em dois tipos histológicos principais: intestinal e difuso [2]. Elas apresentam características morfológicas, clínicas e epidemiológicas distintas e são pensados ​​para desenvolver a partir da ativação de mecanismos moleculares independentes. Dados epidemiológicos mostram que, na maioria dos casos, o cancro gástrico não surge de novo
do epitélio gástrico normal, mas sim resulta de um processo de múltiplos passos, por meio de sucessivas alterações genéticas e epigenética em múltiplos genes. Contrariamente ao tipo difuso, para os quais predispõem lesões não estão bem estabelecidos, a sucessão de acontecimentos que levam ao cancro gástrico do tipo intestinal está bem descrita. De acordo com a cascata do Correa, que se desenvolve de forma gradual, geralmente iniciada por um processo inflamatório desencadeado pelo Helicobacter pylori
, que pode progredir para multifocais gastrite atrófica, metaplasia intestinal (MI), displasia e, finalmente, adenocarcinoma [3].
Mesmo que tenha havido um declínio constante na incidência de câncer gástrico globalmente, a expansão e o envelhecimento da população do mundo prevê um aumento no número de casos e, apesar de os últimos desenvolvimentos no diagnóstico e tratamento, o prognóstico da gástricas pacientes com câncer restos pobre. Isto traduz-se numa taxa de sobrevivência de 5 anos de não mais do que 25%, na Europa [4]. A maioria dos pacientes com câncer gástrico tem doença avançada no momento do diagnóstico, para quem a única opção de cura depende de remoção cirúrgica completa do tumor, com extensa dissecção dos linfonodos que podem ser complementados pela administração de quimioterapia neoadjuvante ou adjuvante [5]. A sobrevivência fator prognóstico de influência mais importante, bem como a escolha do tratamento é o estágio TNM. No entanto, uma camada adicional de complexidade resulta da observação de que os pacientes com o mesmo estadiamento frequentemente mostram uma evolução clínica diferente, destacando a heterogeneidade do cancro gástrico [6]. Isto sugere que únicas propriedades biológicas intrínsecas desses tumores podem afetar significativamente o seu potencial agressivo. Portanto, ainda há uma necessidade premente para descobrir biomarcadores de prognóstico adicionais para prever o resultado com mais precisão e, como resultado, para ajudar a tomar decisões de tratamento bem informadas no que diz respeito à terapia. Como tumores que são mais diferenciadas geralmente se comportam de uma forma menos agressiva, questionamos a relevância de dois marcadores de diferenciação, SOX2 e CDX2, para o comportamento biológico dos cancros gástricos. Estes marcadores são diferencialmente expressos ao longo da cadeia de eventos que levam ao câncer gástrico e estão intimamente associados com gástrica e intestinal diferenciação, respectivamente [7].
CDX2 é um fator de transcrição homeobox específicas do intestino cuja função assegura o desenvolvimento e manutenção de diferenciação intestinal no intestino e locais ectópicos, que foi bem estabelecida em modelos animais [8, 9]. É amplamente conhecido que CDX2 é expresso em metaplasia intestinal humano do estômago e do esófago [10]. Foi demonstrado que ser também expressa em displasia reforçando, assim, o seu papel como um biomarcador da progressão nas fases pré-neoplásicas da carcinogénese gástrica [11].
SOX2 é um membro da SOX (SRY-relacionada HMG Box) da família de factores de transcrição , codificada por um gene altamente conservado exão, único. SOX2 desempenha diversos papéis ao longo do desenvolvimento e diferenciação celular, em primeiro lugar orquestrar a embriogénese de mamífero [12], e depois contribuir para a morfogénese normal e homeostase do epitélio derivado do intestino anterior do esófago, do pulmão e da traqueia [13]. Na idade adulta, SOX2 é expresso numa variedade de tecidos, nomeadamente no epitélio escamoso que revestem o esófago e do epitélio glandular do estômago. Demonstrou-se, em ratos, que a expressão Sox2 contribui para todas as linhagens de células normalmente encontradas no estômago, o que sugere uma contribuição importante para a diferenciação gástrica [14]. Além disso, a expressão anormal de SOX2 foi observada nos tumores do cérebro, da mama, do pulmão e do esófago [15-17]. No entanto, no contexto do cancro gástrico, o seu papel permanece intrigante e necessita de mais esclarecimentos [18-20]. Além disso, sua interação com CDX2 permanece inexplorado.
Nosso objetivo foi analisar a relevância clínica da SOX2 e CDX2 expressão na biologia do câncer gástrico. Os resultados obtidos mostram que a sua expressão nos tumores primários tem um valor prognóstico relevante para pacientes com câncer gástrico.
Métodos
tecidos humanos e DNA amostras
Duzentos e um casos de fixado em formol embebido em parafina (FFPE ) amostras de pacientes com adenocarcinoma gástrico submetidos a cirurgia no Centro Hospitalar S. João, Porto, Portugal, entre 1988 e 2010 foram estudados. Casos selecionados foram aqueles com material incluído em parafina disponíveis, aspectos clínicos e dados de acompanhamento obtidos a partir da Patologia e departamentos cirúrgicos de Centro Hospitalar S. João. Desses, sessenta e sete amostras foram fornecidas como um tissue microarray (TMA), com 2 núcleos réplica de cada amostra, a partir do tumor e dos tecidos Biobank do mesmo Departamento de Patologia. ADN genómico de tumor (ADNg) foi obtido a partir de 62 casos incluídos na TMA. gDNA também foi extraído de amostras de FFPE de dois mucosas gástricas normais usando o Genomic DNA Purification Kit (Citomed, Lisboa, Portugal), e utilizados como controle. Todas as amostras de BioBank foram obtidos com o consentimento informado do paciente. O uso de amostras retrospectivas a partir do qual o consentimento informado não pode ser obtido é autorizado para estudos de investigação por lei Português. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Centro Hospitalar S. João.
Imunohistoquímica
secções de tecido FFPE com 4 mm de espécimes cirúrgicos e TMA foram submetidos a imunohistoquímica para SOX2, CDX2, MUC5AC e MUC2, seguindo metodologias padrão. Resumidamente, após a desparafinagem e re-hidratação, a recuperação de antigénio foi realizado em um IHC-Tek Epitopo Recuperação navio Conjunto (IHC mundo, Woodstock, MD, EUA), durante 40 minutos, com tampão de 10 mM de citrato, pH 6,0 (CDX2) ou 10 mM, pH 8,0 EDTA (SOX2). Desialylation foi realizada para detecção MUC2, com 0,1 U /ml de neuraminidase do Clostridium perfringens
tipo VI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) em tampão de acetato de sódio a pH 5,5 durante 2 h a 37 ° C. A peroxidase endógena foi bloqueada com 3% de peróxido de hidrogénio em metanol durante 10 min. A incubação com os anticorpos primários para CDX2 (diluição 1:50, CDX2-88 clone, BioGenex, San Ramon, CA, EUA), de MUC5AC (diluição de 1:10, o clone CLH2) e MUC2 (diluição de 1:10, o clone PMH1) foi realizada durante a noite, a 4 ° C. As secções foram então incubadas com um anticorpo secundário anti-ratinho de coelho marcado com biotina, seguido por o sistema de detecção avidina /biotina-peroxidase (kit Vectastain ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). Para a coloração SOX2, a incubação com o anticorpo primário (diluição de 1:50, o clone SP76, Cell Marque, Rockling, CA, EUA) foi realizada durante 1 hora à temperatura ambiente e a detecção foi feita usando o Dako Envision REAL ™ ™ Sistema de detecção de peroxidase /DAB + (Dako, Glostrup, Dinamarca) de acordo com as instruções do fabricante. Detecção da expressão foi realizada com 3,3'-diaminobenzidina (DAB) (Sigma, St. Louis, MO, EUA) secções de tecido foram contrastadas com hematoxilina de Gill (Leica Microsystems, Amersham, Bucks, UK), desidratadas, clarificadas e montado. mucosa gástrica normal foi utilizado como um controlo positivo para a expressão SOX2 e MUC5AC e mucosa de cólon normal foi utilizado como um controlo positivo para a expressão e CDX2 MUC2. Capas foram consideradas positivas quando mais de 5% das células foram coradas com cada um dos anticorpos com o consenso de três observadores (VC; LD e RA).
Fluorescência in situ
fluorescente (FISH)
FISH foi usado para avaliar SOX2
estado de amplificação em 21 amostras, utilizando um ensaio de duas cores, como descrito por Bass et al
[17]. Uma sonda que mede o lócus 3q26.33 (clone BAC CTD-2348H10) foi utilizado para determinar SOX2
número de cópias e foi comparado com um hibridação sonda de referência para 3p22.3-3p22.2 (clone RP11-286G5 BAC), comprado da Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). A sonda do alvo foi marcada com digoxigenina (DIG-11-UTP, Roche, Mannheim, Alemanha) e detectada com um anticorpo anti-digoxigenina-fluoresceína (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) e a sonda de referência foi marcado com biotina (BioPrime® ADN rotulagem Sistema, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e detectada com um CY 3 anticorpo-avidina (Jackson Immunoresearch Lab, West Grove, EUA).
Quatro uM lâminas de cada amostra foram deparaffinised adenocarcinoma gástrico, reidratadas e colocadas numa solução pré-aquecida de NaSCN 1M a 80 ° C durante 10 min. As amostras foram digeridas com 6 mg /ml de pepsina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) em HCl 0,02N a pH 2 durante 30 min a 37 ° C. mistura de sonda, em 50% de formamida em 2 × SSC foi codenatured com ADN nuclear a 94 ° C durante 3 min. A hibridação foi realizada durante 30 horas a 37 ° C. Os núcleos foram contrastadas com DAPI solução de montagem Vectashield-(Vector, Burlingame, EUA). Para cada caso, um mínimo de 67 células foram analisadas num microscópio de fluorescência (Zeiss Z1 axio) e as imagens foram obtidas com uma ampliação de × 1000, utilizando um Zeiss MRM came axio e o Axiovision Rel. 4,8 software. A razão entre o número de SOX2 e os sinais da sonda de referência foi calculada para cada célula individual e a média dos índices foi determinada para cada caso. amplificação do gene foi considerada sempre que a média foi ≥2.
Copy Number Variação Ensaios (CNV)
O ensaio CNV foi realizada utilizando um TaqMan® Copiar Número ensaio específico (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), seguindo o as instruções do fabricante. Resumidamente, PCR multiplex para
SOX2 (alvo) e Rnase P
(controle endógeno) foram realizadas num sistema ABI Prism7500 Fast-PCR em tempo real usando o software v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA ). Vinte nanogramas de ADNg e um controlo não-molde foram analisados ​​em quadruplicado. amostras de mucosa gástrica normal foram usados ​​como os calibradores. Quantificação de SOX2
número de cópias do gene foi realizado utilizando o método e análise de dados foi realizada por ΔΔCt v2.0 software CopyCaller (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). A amplificação do gene foi definida sempre que o número de cópias do gene foi duas vezes maior do que a da mucosa gástrica normal. Dobre aumento entre 1,5 e 2 foi considerado exemplar ganho número.
Análise estatística
O teste do qui-quadrado foi utilizado para avaliar a significância das diferenças nas características clínico-patológicas entre categorias de SOX2 e expressão CDX2, exceto com a idade, onde a significância das diferenças nas médias foi calculada usando a T
-teste. sobrevida global dos pacientes foi calculada pelo método de Kaplan-Meier e a significância das diferenças entre as curvas de sobrevida em bruto foi testado pelo teste de log-rank. Cox modelo de riscos proporcionais foi usado para calcular as taxas de risco uni e multivariada. Tempo médio de follow-up para os pacientes sobreviventes foi de 62 meses. A taxa de sobrevivência de 5 e 10 anos foi estimada utilizando o método de tabela de vida. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativa sempre que os valores de p foram
< 0,05. As análises foram realizadas usando SPSS v21.0 software (Chicago, IL, EUA) e Stata v11 (College Station, TX, EUA).
Resultados
expressão SOX2 em carcinomas gástricos
características clínicopatológicos do câncer gástrico 201 casos, bem como os perfis de SOX2, CDX2, MUC2 e MUC5AC expressão encontram-se resumidos na Tabela 1. SOX2 expressão nuclear foi encontrado em 52% (104/201) dos carcinomas gástricos e a expressão foi heterogénea entre e dentro dos tumores (Figura 1A, B e C). Em 13% (18/134) da expressão casos SOX2 foi maior na frente invasiva (Figura 1D e E) (esta avaliação foi realizada somente em casos não incluídos no TMA, em que esta avaliação não foi possível) .table 1 Resumo dos parâmetros clínico de câncer gástrico de acordo com a expressão de SOX2 e CDX2
SOX2
CDX2
negativo
positiva

Negative
positiva
N
%
N
%

p
N
%
N
%
p
Idade, years1
Média ± SD
65,8 ± 12,7
63,4 ± 13,5
0,2
64,1 ± 13,6
65,2 ± 12,6
0,6
mediana (intervalo)
69 (34- 85)
66,5 (24-89)
69 (24-89)
67 (36-89)
sex1
Masculino
52
41,9
72
58,1
0,02
75
60,5
49
39,5
0,1
Feminino
45
58,4
32
41,6
38
49,4
39
50,6
TNM stage2
I /II
35
54,7
29
45,3
0,09
26
40,6
38
59,4
0,002
III /IV
59
44,7
73
55,3
83
62,9
49
37,1
T stage3
T1 /T2
22
62,9
13
37,1
0,03
13
37,1
22
62,9
0,007
T3 /T4
75
45,5
90
54,5
99
60,0
66
40,0
N stage1
N0
28
62,2
17
37,8
0,03
20
44,4
25
55,6
0,07
N +
69
44,2
87
55,8
93
59,6
63
40,4
Margins4
R0
85
47,5
94
52,5
0,5
98
54,7
81
45,3
0,2
R1
11
55,0
9
45,0
14
70,0
6
30,0
Vascular invasion4
negativo
39
55,7
31
44,3
0,1
37
52,9
33
47,1
0,5
positiva
57
44,2
72
55,8
75
58,1
54
41,9
Láuren5
intestinal
44
49,4
45
50,6
0,9
45
50,6
44
49,4
0,3
difusa
20
48,8
21
51,2
26
63,4
15
36,6
Não classificados
31
46,3
36
53,7
40
59,7
27
40,3
Ming6
Expansivo
32
53,3
28
46,7
0,5
28
46,7
32
53,3
0,1
infiltrativa
60
45,8
71
54,2
81
61,8
50
38,2
Não classificados Página 2
66,7
1

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