fenotipi molecolari immunoistochimica di cancro gastrico in base SOX2 e CDX2 prevedono outcome

paziente immunoistochimica fenotipi molecolari del cancro gastrico in base SOX2 e CDX2 preannunciare l'outcome del paziente
Abstract
sfondo
cancro gastrico rimane un serio problema di salute in tutto il mondo. I pazienti sarebbe di grande beneficio dalla scoperta di nuovi biomarcatori in grado di predire il risultato più accurato e consentire un migliore trattamento e le decisioni di follow-up. Qui, abbiamo usato una retrospettiva, studio osservazionale per valutare l'espressione e valore prognostico dei fattori di trascrizione SOX2 e CDX2 nel cancro gastrico.
Metodi
SOX2, CDX2, MUC5AC ed espressione MUC2 sono state valutate in 201 tumori gastrici immunoistochimica . SOX2 ed espressione CDX2 sono stati incrociati con i dati clinico-patologici e di follow-up per determinare il loro impatto sul comportamento del tumore e l'esito. Inoltre, SOX2
locus Stato copia numero è stata valutata mediante FISH (N = 21) e Copy Number Variation Assay (N = 62).
Risultati
SOX2 si esprimeva nel 52% dei tumori gastrici ed era significativamente associato con il sesso maschile, stadio T e la fase N. Inoltre, l'espressione SOX2 predetto la sopravvivenza del paziente più poveri, e la combinazione con CDX2 definito due fenotipi molecolari, SOX2 + CDX2 - contro SOX2 -CDX2 +, che prevedere il peggio e il meglio lungo outcome dei pazienti termine. Questi profili combinati con i parametri clinico-patologici stratificare la prognosi dei pazienti con tumori intestinali e in espansione e in quelli senza segni di invasione venosa. Infine, SOX2
numero di locus copia guadagni sono stati trovati nel 93% dei campioni che raggiungono la soglia di amplificazione nel 14% e in maniera significativa associazione con l'espressione della proteina.
Conclusioni
Ci ha mostrato, per la prima volta, che SOX2 combinati con profilo di espressione CDX2 nel carcinoma gastrico segregare i pazienti in diversi gruppi prognostici, integrando le informazioni clinicopatologici. Dimostriamo inoltre un meccanismo molecolare per l'espressione SOX2 in un sottogruppo di casi di cancro gastrico.
Parole
SOX2 CDX2 cancro gastrico Prognosi Sopravvivenza Sfondo
cancro gastrico è uno dei tumori più comunemente diagnosticato e ora la terza causa di decessi correlati al cancro in tutto il mondo [1]. classificazione Laurén divide cancro gastrico in due principali tipi istologici: intestinale e diffusa [2]. Essi presentano caratteristiche morfologiche, clinici ed epidemiologici distinte e sono pensati per sviluppare dalla attivazione dei meccanismi molecolari indipendenti. I dati epidemiologici mostra che, nella maggior parte dei casi, il cancro gastrico non si pone de novo
dal normale epitelio gastrico, ma piuttosto il risultato di un processo a più fasi, attraverso successive alterazioni genetiche ed epigenetiche in più geni. Contrariamente al tipo diffuso, per cui le lesioni predisponenti non sono ben stabiliti, la successione degli eventi che portano al cancro gastrico di tipo intestinale è ben descritto. Secondo la cascata del Correa, si sviluppa in modo graduale, di solito avviato da un processo infiammatorio innescato da Helicobacter pylori
, che può progredire a multifocali gastrite atrofica, metaplasia intestinale (IM), displasia e, infine, adenocarcinoma [3].
Anche se c'è stato un calo costante gastrica incidenza del cancro a livello mondiale, l'espansione e l'invecchiamento della popolazione mondiale prevede un aumento del numero dei casi e, nonostante gli ultimi sviluppi nella diagnosi e nel trattamento, la prognosi di gastrico pazienti oncologici resti povero. Questo si traduce in un tasso di sopravvivenza a 5 anni di non più del 25%, in Europa [4]. La maggior parte dei pazienti affetti da cancro gastrico hanno avanzato della malattia al momento della diagnosi, per i quali l'unica possibilità di cura si basa sulla completa rimozione chirurgica del tumore, con una vasta dissezione dei linfonodi che può essere completato con la somministrazione di neoadiuvante o chemioterapia adiuvante [5]. La sopravvivenza fattore prognostico che influenza più importante, così come la scelta di trattamento è la fase TNM. Tuttavia, un ulteriore livello di complessità deriva dall'osservazione che i pazienti con la stessa staging spesso mostrano una diversa evoluzione clinica, evidenziando l'eterogeneità del cancro gastrico [6]. Ciò suggerisce che uniche proprietà biologiche intrinseche di questi tumori possono avere un impatto significativo il loro potenziale aggressivo. Pertanto, vi è ancora una necessità urgente di scoprire ulteriori biomarcatori prognostici per predire l'esito più accurato e, di conseguenza, per contribuire a rendere le decisioni terapeutiche più informate rispetto alla terapia. Come i tumori che sono più differenziati in generale comportarsi in modo meno aggressivo, abbiamo interrogato la rilevanza di due marcatori di differenziazione, SOX2 e CDX2, per il comportamento biologico dei tumori gastrici. Questi marcatori sono espressi in modo differenziale lungo la catena di eventi che portano al cancro gastrico e sono strettamente connessi con rispettivamente gastrica e la differenziazione intestinale, [7].
CDX2 è un fattore di trascrizione homeobox specifici intestino la cui funzione garantisce lo sviluppo e il mantenimento di differenziazione intestinale nell'intestino e siti ectopiche, che è stato ben definito nei modelli animali [8, 9]. È ampiamente noto che CDX2 è espressa in metaplasia intestinale umana dello stomaco e dell'esofago [10]. E 'stato dimostrato essere espressa anche nella displasia rafforzando così il suo ruolo di biomarker di progressione nelle fasi preneoplastiche della cancerogenesi gastrica [11].
SOX2 è un membro del SOX (SRY legati HMG Box) famiglia di fattori di trascrizione , codificato da un gene singolo esone altamente conservata. SOX2 svolge ruoli diversi in tutto lo sviluppo e la differenziazione cellulare, prima orchestrando l'embriogenesi dei mammiferi [12], e poi contribuendo alla morfogenesi normale e omeostasi degli epiteli foregut di derivazione dell'esofago, del polmone e la trachea [13]. In adulta, SOX2 è espresso in una varietà di tessuti, in particolare nel epitelio squamoso rivestono l'esofago e l'epitelio ghiandolare dello stomaco. È stato dimostrato, nei topi, questa espressione Sox2 contribuisce a tutte le linee cellulari normalmente presenti nello stomaco, suggerendo un contributo importante per la differenziazione gastrica [14]. Inoltre, l'espressione anormale di SOX2 è stata osservata nei tumori del cervello, della mammella, del polmone e dell'esofago [15-17]. Tuttavia, nel contesto del cancro gastrico, il suo ruolo rimane sconcertante e ha bisogno di ulteriori chiarimenti [18-20]. Inoltre, la sua interazione con CDX2 rimane inesplorato.
Nostro scopo è stato quello di analizzare la rilevanza clinica di espressione di Sox2 e CDX2 nella biologia del cancro gastrico. I risultati ottenuti mostrano che la loro espressione nei tumori primari ha un valore prognostico rilevante per i pazienti di cancro gastrico.
Metodi
tessuti umani e il DNA dei campioni
Duecento e uno dei casi di fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE ) campioni di pazienti con adenocarcinoma gastrico sottoposti a chirurgia presso il Centro Hospitalar S. João, Porto, Portogallo tra il 1988 e il 2010 sono stati studiati. I casi selezionati sono stati quelli con materiale incluso in paraffina disponibili, clinicopatologica e dati di follow-up ottenuto dal Patologia e reparti di chirurgia di Centro Hospitalar S. João. Da quelli, sessantasette campioni sono stati forniti come un microarray tissutale (TMA), con 2 core copia di ogni campione, dal tumore e tessuto Biobanca dello stesso Dipartimento di Patologia. Tumore DNA genomico (gDNA) è stato ottenuto da 62 casi inclusi nel TMA. gDNA è stato anche estratto da campioni FFPE di due normali delle mucose gastriche utilizzando il DNA Purification Kit Genomic (Citomed, Lisbona, Portogallo), e utilizzati come controlli. Tutti i campioni della Biobanca sono stati ottenuti con il consenso informato del paziente. L'uso di campioni retrospettivi dai quali il consenso informato non può essere ottenuto è autorizzato per studi di ricerca da parte della legge portoghese. Questo studio è stato approvato dal comitato etico del Centro Hospitalar S. João.
Immunoistochimica
sezioni di tessuto FFPE con 4 micron da campioni chirurgici e TMA sono stati sottoposti a immunoistochimica SOX2, CDX2, MUC5AC e MUC2, seguendo metodologie standard. In breve, dopo deparaffinazione e reidratazione, il recupero dell'antigene è stata eseguita in un IHC-Tek smascheramento Vapore Set (IHC mondiale, Woodstock, MD, USA), per 40 minuti con 10 mM tampone citrato, pH 6,0 (CDX2) o 10 mm, pH 8.0 EDTA (SOX2). Desialylation è stata effettuata per il rilevamento MUC2, con 0,1 U /mL di neuraminidasi da Clostridium perfringes
tipo VI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in acetato di sodio tampone a pH 5,5 per 2 ore a 37 ° C. perossidasi endogena è stato bloccato con perossido di idrogeno al 3% in metanolo per 10 minuti. L'incubazione è stata effettuata con anticorpi primari per CDX2 (1:50 diluizione, CDX2-88 clone, i diversi, San Ramon, CA, USA), MUC5AC (diluizione 1:10, CLH2 clone) e MUC2 (diluizione 1:10, PMH1 clone) durante la notte, a 4 ° C. Le sezioni sono state poi incubate con un coniglio anticorpo secondario anti-topo biotina marcata, seguito dal avidina /biotina-perossidasi sistema di rilevazione (kit Vectastain ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Per SOX2 colorazione, incubazione con l'anticorpo primario (1:50 diluizione, SP76 clone, Cell Marque, motella, CA, USA) è stata eseguita per 1 ora a temperatura ambiente e la rilevazione è stata effettuata utilizzando il sistema di rilevamento Dako REALE ™ Envision ™ perossidasi /DAB + (DAKO, Glostrup, Danimarca) secondo le istruzioni del produttore. Rilevazione di espressione è stata eseguita con 3,3'-diaminobenzidina (DAB) (Sigma, St. Louis, MO, USA) sezioni di tessuto sono stati di contrasto con ematossilina di Gill (Leica Microsystems, Amersham, Bucks, UK), disidratati, chiarita e montato. mucosa gastrica normale è stato utilizzato come controllo positivo per SOX2 e di espressione MUC5AC e normale mucosa del colon è stato utilizzato come controllo positivo per CDX2 e di espressione MUC2. I casi sono stati considerati positivi quando più del 5% delle cellule sono state colorate con ogni anticorpo con il consenso di tre osservatori (VC; LD e RA).
Fluorescence In Situ
ibridazione (FISH)
FISH è stato utilizzato per valutare SOX2
stato di amplificazione a 21 campioni, usando un test a 2 colori come descritto da Bass et al
[17]. Una sonda che attraversa il 3q26.33 locus (BAC clone CTD-2348H10) è stato utilizzato per determinare SOX2
numero di copie ed è stato confrontato con un ibridazione sonda di riferimento per 3p22.3-3p22.2 (clone RP11-286G5 BAC), ha acquistato da Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). La sonda bersaglio è stato etichettato con digossigenina (DIG-11-UTP, Roche, Mannheim, Germania) e ha rilevato con un anticorpo anti-digossigenina-fluoresceina (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania) e la sonda di riferimento è stato etichettato con biotina (BioPrime® DNA Labeling System, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e rilevato con una CY anticorpo 3-avidina (Jackson ImmunoResearch Lab, West Grove, stati Uniti d'America).
quattro micron diapositive da ogni campione adenocarcinoma gastrico sono stati deparaffinised, reidratate e posto in una soluzione pre-riscaldata NaSCN 1M a 80 ° C per 10 min. I campioni sono stati digeriti con 6mg /ml di pepsina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in HCl 0.02N, pH 2 per 30 minuti a 37 ° C. miscela di sonda nel 50% formammide in 2 × SSC stato codenatured con DNA nucleare a 94 ° C per 3 minuti. Ibridazione è stata effettuata per 30 ore a 37 ° C. I nuclei sono stati di contrasto con soluzione di montaggio DAPI-Vectashield (Vector, Burlingame, Stati Uniti d'America). Per ogni caso, un minimo di 67 cellule sono state analizzate in un microscopio a fluorescenza (Zeiss Z1 Axio) e le immagini sono state acquisite con un ingrandimento 1000 ×, utilizzando una camma MRm Zeiss Axio e AxioVision Rel. 4.8 software. Il rapporto tra il numero di SOX2 ei segnali della sonda di riferimento è stato calcolato per ogni cella singolarmente e la media dei rapporti è stata determinata per ciascun caso. amplificazione del gene è stato considerato quando la media era ≥2.
Copy Number Variation saggi (CNV)
Il saggio CNV è stata effettuata utilizzando una specifica TaqMan® Copy Number Assay (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) a seguito della le istruzioni del produttore. In breve, PCR multiplex per SOX2
(target) e RNasi P
(controllo endogeno) sono stati eseguiti su un sistema ABI Prism7500 rapido Real-time PCR utilizzando il software v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, Stati Uniti d'America ). Venti nanogrammi di gDNA e un controllo non-modello sono stati analizzati in quadruplicato. Le normali campioni di mucosa gastrica sono stati utilizzati come calibratori. La quantificazione di Sox2
numero di copie del gene è stata fatta usando il metodo ed i dati ΔΔCt analisi è stata svolta dal v2.0 software CopyCaller (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). amplificazione genica è stata definita quando il numero di copie del gene era 2 volte superiore a quella della mucosa gastrica. Piegare aumento tra 1,5 e 2 è stato considerato il numero di copie di guadagno.
Analisi statistica
Il test chi-quadrato è stato utilizzato per valutare la significatività delle differenze nelle caratteristiche clinico-patologici attraverso categorie di Sox2 e di espressione CDX2, tranne che con l'età, dove il significatività delle differenze di mezzi è stato calcolato utilizzando il T
-test. la sopravvivenza globale dei pazienti è stato calcolato utilizzando il metodo di Kaplan-Meier e il significato delle differenze tra le curve di sopravvivenza del greggio è stato testato da il log-rank test. Rischi proporzionali di Cox modello è stato utilizzato per calcolare gli hazard ratio univariata e multivariata. Il tempo di follow-up per i pazienti sopravvissuti è stato di 62 mesi. Il tasso di sopravvivenza a 5 e 10 anni è stato stimato utilizzando il metodo di vita-table. Le differenze sono state considerate statisticamente significativa quando i valori p
erano < 0.05. Le analisi sono state effettuate utilizzando il software SPSS v21.0 (Chicago, IL, USA) e Stata V11 (College Station, TX, USA).
Risultati
espressione di Sox2 nel carcinomi gastrici
caratteristiche clinico-patologiche del carcinoma gastrico 201 casi, così come i profili di espressione di Sox2, CDX2, MUC2 e MUC5AC sono riassunti nella Tabella 1. espressione SOX2 nucleare è stata trovata nel 52% (104/201) dei carcinomi gastrici e l'espressione è stata eterogenea tra e all'interno dei tumori (Figura 1A, B e C). Nel 13% (18/134) dell'espressione casi SOX2 era superiore alla parte anteriore invasiva (Figura 1D e E) (questa valutazione è stata eseguita solo in casi non inclusi nella TMA, in cui tale valutazione non era possibile) .table 1 Sommario dei parametri clinico-patologici di cancro gastrico, secondo l'espressione di Sox2 e CDX2
SOX2
CDX2
negativo positivo



negativo positivo

N
%
N
%

p
N
%
N
%
p
Età, anni1
media ± SD
65,8 ± 12,7
63,4 ± 13,5
0,2
64,1 ± 13,6
65,2 ± 12,6
0,6
mediana (range)
69 (34- 85)
66,5 (24-89)
69 (24-89)
67 (36-89)
sex1
Maschio
52
41,9
72
58,1
0,02
75
60,5
49
39,5
0,1
femminile
45
58,4
32
41,6
38
49,4
39
50,6
TNM stage2
I /II
35
54,7
29
45,3
0,09
26
40,6
38
59,4
0.002
III /IV
59
44,7
73
55,3
83
62,9
49
37,1
T stage3
T1 /T2
22
62,9
13
37,1
0.03
13
37,1
22
62,9
0,007
T3 /T4
75
45,5
90
54,5
99
60,0
66
40,0
N stage1
N0
28
62,2
17
37,8
0.03
20
44,4
25
55,6
0,07
N +
69
44.2
87
55,8
93
59,6
63
40,4
Margins4
R0
85
47,5
94
52,5
0.5
98
54,7
81
45,3
0,2
R1
11
55,0
9
45,0
14
70,0
6
30,0
vascolare invasion4
negativo
39
55,7
31
44,3
0,1
37
52,9
33
47,1
0.5
positivo
57
44,2
72
55,8
75
58,1
54
41,9
Láuren5
intestinale
44
49,4
45
50,6
0.9
45
50,6
44
49,4
0,3
Diffuse
20
48.8
21
51,2
26
63,4
15
36,6
classificati 31
46,3
36
53,7
40
59,7
27
40,3
Ming6
espansivo
32
53,3
28
46,7
0.5
28
46,7
32
53,3
0,1
infiltrativa
60
45,8
71
54,2
81
61,8
50 | 38,2
Non classificati 2
66,7
1 33.3
1 33.3 2
66,7
Sox21
negativo
58
59,8
39
40,2
0,3
positivo
55
52,9
49
47,1
CDX21
negativo
58
51,3
55
48,7
0,3
positivo
39
44,3
49
55,7
MUC5AC1
negativo
39
44,8
48
55,2
0,4 ​​
42
48,3
45
51,7
0.05
positivo
58
51,3
55
48,7
70
61,9
43
38,1
MUC21
negativo 69
48,6
73
51,4
0.9
84
52,2
58
40,8
0,1
positivo
27
48,2
29
51,8
26
46,4
30
53,6
1N = 201; 2N = 196; 3N = 200; 4N = 199; 5N = 197; 6N = 194.
figura espressione della proteina 1 SOX2 in carcinomi gastrici, rilevata mediante immunoistochimica. (A) L'eterogeneità di espressione di Sox2 nei tumori gastrici. All'interno dello stesso campione di tumore, aree con alti livelli di SOX2 sono osservati (B) in prossimità di aree con bassi livelli di espressione di SOX2 (C). (D, E) espressione di Sox2 nella parte anteriore invasiva dei tumori.
Successivamente, abbiamo valutato se l'espressione SOX2 correlata con le caratteristiche clinico-patologici dei casi. Questa analisi ha rivelato che l'espressione SOX2 era significativamente associata con il sesso maschile (p
= 0.02), con fase di T superiore (p
= 0,03) e con la presenza di linfonodi regionali metastasi linfonodali (N stadio) (p
= 0.03). Gli altri parametri clinico-patologici, che comprendevano l'età, lo stadio TNM, la clearance del tumore a margini di resezione (categoria R), invasione vascolare, classificazione Lauren e classificazione Ming non sono risultati significativamente associati con l'espressione di Sox2 (Tabella 1). Dal momento che
SOX2 è associato differenziazione gastrica [14] abbiamo studiato se questa è stata mantenuta nel cancro, utilizzando MUC5AC come marcatore gastrica. Tuttavia, nessuna associazione è stata trovata tra SOX2 ed espressione MUC5AC. Allo stesso modo, nessuna associazione inversa è stata trovata tra SOX2 e CDX2 /MUC2 (utilizzati come marcatori di differenziazione intestinale). Da segnalare, espressione CDX2 era significativamente associato con uno stadio inferiore TNM (p
= 0,002) e con uno stadio inferiore T (p = 0,007
). Inoltre, anche se non statisticamente significativa, c'è stata una tendenza verso una relazione inversa tra CDX2 e MUC5AC (p =
0.05). L'analisi di sopravvivenza

La sopravvivenza a 5 anni, sulla base del follow-up di 199 pazienti, era del 35% (sui file 1: Figura S1). Abbiamo poi osservato che l'espressione SOX2 nei tumori è stata associata, in analisi univariata, con una sopravvivenza globale più poveri (p
= 0.02), stratificando i pazienti in due gruppi prognostici (Figura 2a), con una sopravvivenza a 5 anni del 45 % per i pazienti con tumori SOX2- contro il 26% per i pazienti con tumori SOX2 +. Al contrario, espressione CDX2 associata ad un miglioramento della sopravvivenza complessiva, anche se la differenza non significativa (dati non mostrati). Figura 2 curve di Kaplan-Meier che mostrano la probabilità di sopravvivenza globale per i pazienti con cancro gastrico in base alla espressione di Sox2 (A) e secondo il fenotipo molecolare SOX2 - /+ CDX2 e SOX2 + /CDX2 - (B). commercio basato sulla associazione di Sox2 e CDX2 con peggio e migliore sopravvivenza così come le caratteristiche più o meno aggressivi clinico-patologici, rispettivamente, abbiamo ulteriormente studiato outcome dei pazienti in base ai fenotipi molecolari definiti da entrambe le proteine. Quattro gruppi di pazienti potrebbero essere definiti (sui file 1: Figura S2) di cui quello con la migliore sopravvivenza avevano tumori negativi per SOX2 e positivi per CDX2 (SOX2- /CDX2 +), mentre la sopravvivenza è la più bassa in pazienti portatori di tumori con il profilo inverso, positivo per SOX2 e negativo per CDX2 (SOX2 + /CDX2-) (p = 0,01
) (file complementare 1: Figura S2 e Figura 2B). I casi con l'espressione di entrambi SOX2 e CDX2 o senza espressione di uno dei due marcatori hanno mostrato una sopravvivenza simile e intermedio (sui file 1: Figura S2). Il SOX2- /CDX2 + e SOX2 fenotipi molecolari + /CDX2-, rispetto alla sola SOX2, prevedono tassi di sopravvivenza molto simili a 5-anni (49% vs 26% e il 45% vs 26%, rispettivamente). Tuttavia, il tasso di sopravvivenza a 10 anni previsto sulla base di espressione di Sox2 solo è del 34% (SOX2-) vs 22% (SOX2 +), mentre, utilizzando i fenotipi molecolari SOX2 /CDX2, diventa 41% (SOX2- /CDX2 +) vs 14% (SOX2 + /CDX2-).
abbiamo esplorato ulteriormente l'impatto in termini di sopravvivenza dei fenotipi molecolari definite da SOX2 + vs SOX2-, CDX2 + vs CDX2- e SOX2- /CDX2 pazienti '+ contro + SOX2 /CDX2- stratificati in base ai parametri clinico-patologici. In questo caso, tracciando la sopravvivenza in base ad una SOX2 o lo stato CDX2 solo ceduto differenze prognostico significativo per l'ex, in alcuni dei parametri (tumori intestinal- e l'espansione di tipo) e nessuna differenza per CDX2 soli (sui file 1: figure S3 e S4). I risultati di Cox modello proporzionale sono presentati in file aggiuntive 1: Tabella S1. Ancora una volta, l'uso dell'espressione combinato di SOX2 e CDX2 raffinato i risultati precedenti (Figura 3). SOX2 + /CDX2 - profilo previsto un risultato significativamente peggiore dei pazienti con intestinali (p
= 0.005) e in espansione (p = 0,002)
tumori, con hazard ratio di 3.18, rispettivamente, e 4,84, , e di quelli senza segni di invasione venosa (p = 0.009
), presentando un rapporto di rischio di 3,84. Anche se borderline non significativa, una tendenza simile è stata osservata in pazienti senza metastasi linfonodali (p
= 0,08) (Figura 3). Gli hazard ratio e gli intervalli di confidenza al 95% per tutti i gruppi sono presentati in dettaglio nella tabella 2 e rimangono significative dopo aggiustamento per età e sesso, in un'analisi multivariata. Figura 3 curve di Kaplan-Meier che mostrano la probabilità di sopravvivenza globale per i pazienti con cancro gastrico in base al fenotipo molecolare SOX2 - /CDX2 + e SOX2 + /CDX2 - stratificati in base ai parametri clinico-patologici: classificazione Lauren (A), la classificazione Ming (B) , l'invasione venosa (C) e le metastasi linfonodali (D).
Tabella 2 Cox proporzionale pericoli modelli di sopravvivenza in funzione dei fenotipi molecolari (SOX2 + /CDX2- vs SOX2- /CDX2 +) per ogni parametro clinicopatologica
Parametro
hazard ratio (95% CI)

Unadjusted
P
Adjusteda
P

Nel complesso
1,95 (1,15-3,31)
0,01
1,90 (1,10-3,28)
0,02
Laurén classificazione
intestinale-tipo
3,18 (1,33-7,58)
0,009
2,93 (1,21-7,10)
0,02
Diffuse-tipo
1,35 (0,35-5,17)
0,7
classificati
1,34 (0,60-3,02)
0.5
Ming classificazione
espansione
4,84 (1,64-14,29)
0,004
4.53 (1,29-15,85)
0,02
infiltrativa
1,13 (0,60-2,13)
0,7
vascolare invasione
negativa
3,84 (1,30-11,35)
0,02
3.82 (1,29-11,40)
0,02
positivo 1.10 (0.60- 2.02)
0,8
N stadio
N0
2,96 (0,82-10,65)
0,1
3,98 (0,72-21,83)
0,1
N +
1.29 ( 0,72-2,30)
0.4
Abbreviazione: CI
intervallo di confidenza impara una aggiustato per età e sesso (analisi multivariata utilizzando il modello di regressione di Cox) amplificazione
SOX2
Considerando che gene.. amplificazione è un evento specifico tumore durante la trasformazione maligna, e che locus SOX2 è sottoposto a questa alterazione in altri tumori, in particolare del polmone e l'esofago [17], abbiamo ipotizzato che l'amplificazione SOX2 potrebbe spiegare la sua espressione ed eterogeneità, sia all'interno e tra tumori gastrici. A supporto di questa ipotesi, un sondaggio effettuato sul database Oncomine ha mostrato che SOX2 classificata tra le prime 10% geni con aumenti del numero di copie di cancro gastrico (file aggiuntivo 1: Figura S5).
Sulla base dei dati di immunoistochimica, abbiamo selezionato 14 casi con espressione di Sox2 e 7 casi negativi per analizzare dal saggio FISH 2-colore. Abbiamo osservato che SOX2 è stato amplificato nel 14% (2/14) dei casi con l'espressione ed in nessuno dei casi senza espressione (0/7). Un caso positivo rappresentante sia per l'espressione SOX2 e l'amplificazione è mostrato in Figura 4A e B. Un caso con l'espressione SOX2 ma nessuna amplificazione è mostrato in Figura 4C e D. Inoltre, l'analisi FISH ha dimostrato la presenza di un elevato grado di numero di copie guadagno ed eterogeneità all'interno dei tumori, osservate non solo con la sonda obiettivo per SOX2
locus ma anche con la sonda di riferimento, che si trova al 3p braccio (sui file 1: Figura S6). Figura 4 casi di cancro gastrico con l'espressione della proteina Sox2 (A e C) possono presentarsi con o senza SOX2 amplificazione (B e D, rispettivamente) determinata dalla FISH. Verde con la scritta sonde bersaglio SOX2
, mentre le sonde rosse marcate di mira il braccio 3p. I nuclei sono colorati con DAPI (blu). campioni di cancro gastrico (E) Sessantadue gDNA sono stati valutati per SOX2 Stato copia numero e rispetto al normale mucosa gastrica (calibratore). (F) il numero SOX2 copia è stata significativamente associata con l'espressione della proteina, determinata da IHC (p
< 0,05).
Per chiarire la frequenza di Sox2
numero di locus copia alterazioni nel cancro gastrico, abbiamo eseguito una copia -numero PCR usando gDNA da 62 casi di cancro gastrico, utilizzando un RNasi P
sonda si trova nel cromosoma 14 come riferimento. La maggior parte dei campioni (93%) presenta un certo grado di SOX2
copia numero della variazione va da 3 a 9 copie (figura 4E). Una significativa associazione positiva tra aumento di numero di copie e SOX2 espressione (p
< 0,05). È stato osservato (Figura 4F)
Discussione
cancro gastrico è una malattia con più risultati che non possono essere previsti con le sole caratteristiche clinico-patologiche [6]. Di conseguenza, l'identificazione di biomarcatori molecolari che possono consentire ulteriori decisioni all'esito di stratificazione e di trattamento è di importanza critica.
In questo studio abbiamo caratterizzato l'espressione del fattore di trascrizione SOX2 nel cancro gastrico e parenti con le caratteristiche clinico-patologici e marcatori di differenziazione e cioè MUC5AC (marcatore gastrico) e CDX2 e MUC2 (marcatori intestinali). Ciò ha portato all'identificazione di due differenti gruppi prognostici, sulla base di espressione SOX2, che potrebbe essere ulteriormente raffinato tenendo conto della espressione combinata con CDX2. Infine, abbiamo disfatto l'eterogeneità di Sox2
locus e cromosoma 3 numero di copie in cancro gastrico, che dimostra un'associazione tra l'aumento del numero di copie e l'espressione della proteina SOX2.
Uno dei principali risultati di questo studio era l'osservazione che espressione di Sox2 da solo, e ulteriormente affinato dalla combinazione con CDX2, permette la stratificazione dei pazienti in sottogruppi con significativamente diversi i risultati clinici. Inoltre, quando abbiamo combinato questi profili molecolari con i dati clinico-patologici, è diventato evidente che il SOX2 + /CDX2 - profilo associato con una prognosi peggiore, all'interno di sottoinsiemi di tumori che, in generale, hanno una prognosi migliore: intestinale-tipo , espandendo-tipo e senza segni di invasione venosa [21, 22]. Anche se non statisticamente significativa, la stessa tendenza è stata osservata per i tumori che presentano senza metastasi linfonodali. Questi profili molecolari indicano un comportamento biologico diverso del tumore probabilmente dovuto alla progressione della malattia o resistenza trattamento e possono essere utilizzati per istruire terapia più efficace o programmi follow-up.
Particolare, come metastasi linfonodali è uno dei rischio principale fattori per la ricorrenza del cancro gastrico, dopo un intervento chirurgico R0, tutti i pazienti che presentano metastasi linfonodali ricevono terapia adiuvante [23]. Tuttavia, i nostri risultati mostrano che i pazienti senza questo fattore di rischio, e quindi non trattata, presentano un risultato sorprendentemente peggio quando il tumore si presenta con un SOX2 + /CDX2 - profilo molecolare. Questo avanza l'ipotesi che, all'interno dei tumori N0, i pazienti all'interno di questo sottogruppo molecolare sarebbe probabilmente beneficiare di una terapia adiuvante. Tuttavia, queste osservazioni richiedono la convalida in coorti più grandi e sarebbe anche molto istruttiva per aggiungere informazioni cliniche per quanto riguarda il trattamento del paziente.
SOX2 emerge anche come un potenziale bersaglio per nuovi interventi terapeutici. Anche se i fattori di trascrizione non sono bersagli farmacologici classici, approcci alla terapia SOX2 mirata sono già state affrontate nel cancro al seno.

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