Immunhistokjemiske molekylære fenotyper av magekreft basert på SOX2 og CDX2 forutsi pasientens utfall

Immunhistokjemiske molekylære fenotyper av magekreft basert på SOX2 og CDX2 forutsi pasientens utfall
Abstract
Bakgrunn
Magekreft er fortsatt et alvorlig helseproblem over hele verden. Pasienter vil ha stor nytte av oppdagelsen av nye biomarkører som forutsier utfallet mer nøyaktig og gi bedre behandling og oppfølging beslutninger. Her brukte vi en retrospektiv, observasjonsstudie for å vurdere uttrykk og prognostisk verdi av transkripsjonsfaktorer SOX2 og CDX2 i magekreft.
Metoder
SOX2, CDX2, MUC5AC og MUC2 uttrykk ble vurdert i 201 mage svulster ved immunhistokjemi . SOX2 og CDX2 uttrykk ble krysset med clinicopathological og oppfølgingsdata for å fastslå deres innvirkning på tumor atferd og utfall. Videre SOX2
locus kopiere nummer status ble vurdert ved FISH (N = 21) og Kopier nummer Variasjon analysen (N = 62).
Resultater
SOX2 ble uttrykt i 52% av mage svulster og var signifikant forbundet med mannlig kjønn, T scenen og N scenen. Videre spådde SOX2 uttrykk dårligere pasient overlevelse, og kombinasjonen med CDX2 definert to molekylære fenotyper, SOX2 + CDX2 - versus SOX2 -CDX2 +, som spår det verste og det beste lang- begrepet pasientenes utfall. Disse profilene kombinert med clinicopathological parametere stratify prognosen for pasienter med tarm og voksende svulster og i de uten tegn på vene invasjon. Til slutt ble SOX2
locus kopitall gevinster som finnes i 93% av prøvene som når forsterkning terskel i 14% og betydelig assosiere med protein uttrykk.
Konklusjoner
Vi viste for første gang, at SOX2 kombinert med CDX2 uttrykk profil i magekreft skille pasienter i ulike prognostiske grupper, utfyller den clinicopathological informasjon. Vi viser videre en molekylær mekanisme for SOX2 uttrykk i en undergruppe av mage krefttilfeller.
Nøkkelord
SOX2 CDX2 Magekreft Prognose Survival Bakgrunn
Magekreft er en av de mest diagnostisert kreft, og nå den tredje største årsaken av kreftrelaterte dødsfall i verden [1]. Laurén klassifiseringen deler magekreft i to hoved histologiske typer: intestinal og diffuse [2]. De presenterer forskjellige morfologiske, kliniske og epidemiologiske funksjoner og er tenkt å utvikle seg fra aktivering av uavhengige molekylære mekanismer. Epidemiologiske data viser at i de fleste tilfeller ikke magekreft ikke oppstår de novo
fra den normale gastriske epitel, men snarere et resultat av en flertrinns prosess, gjennom suksessive genetiske og epigenetiske endringer i multiple gener. I motsetning til den diffuse typen, som predisponerer lesjoner ikke er godt etablert, blir rekken av hendelser som fører til magekreft av tarmtypen godt beskrevet. Ifølge Correas kaskade, utvikler det trinnvis, vanligvis initiert av en inflammatorisk prosess utløst av Helicobacter pylori
, som kan utvikle seg til multifokal atrofisk gastritt, intestinal metaplasi (IM), dysplasi og til slutt adenokarsinom [3].
Selv om det har vært en jevn nedgang i magekreftforekomst globalt, utvidelse og aldring av verdens befolkning prognoser en økning i antall saker og, til tross for den siste utviklingen i diagnose og behandling, prognose av magekreftpasienter restene dårlig. Dette oversettes til en 5-års overlevelse på ikke mer enn 25%, i Europa [4]. De fleste magekreftpasienter har avansert sykdom ved diagnose for hvem det eneste alternativet for helbredelse er avhengig av komplett kirurgisk fjerning av svulsten, med omfattende lymfeknute disseksjon som kan suppleres med administrasjon av neoadjuvant eller adjuvant kjemoterapi [5]. Den viktigste faktor som påvirker prognostiske overlevelse så vel som behandling valg er TNM stadium. Men et ekstra lag av kompleksitet stammer fra den observasjon at pasienter med samme oppsetningen viser ofte en annen klinisk utvikling, fremhever heterogenitet av magekreft [6]. Dette tyder på at unike iboende biologiske egenskapene til disse svulstene kan ha betydelig innvirkning deres aggressive potensial. Derfor er det fortsatt et stort behov for å oppdage flere prognostiske biomarkører for å forutsi utfallet mer presist, og som et resultat, for å gjøre bedre informerte beslutninger behandling med hensyn til behandling. Som svulster som er mer differensiert generelt oppføre seg på en mindre aggressiv måte, spurte vi relevansen av to differensiering markører, SOX2 og CDX2, for det biologiske oppførsel av magekreft. Disse markørene er uttrykt forskjellig langs kjeden av hendelser som fører til magekreft og er nært forbundet med mage og tarm differensiering, henholdsvis [7].
CDX2 er en tarmspesifikk homeobox transkripsjonsfaktor hvis funksjon sørger for utvikling og vedlikehold av intestinal differensiering i tarmen og ektopisk, som var godt etablert i dyremodeller [8, 9]. Det er allment kjent at CDX2 uttrykkes i human intestinal metaplasi i magesekken og spiserøret [10]. Det ble vist til å være også til uttrykk i dysplasi dermed forsterke sin rolle som en biomarkør for progresjon i preneoplastiske stadier av magekreftutvikling [11].
SOX2 er medlem av SOX (SRY-relaterte HMG Box) familie av transkripsjonsfaktorer , kodet for av en sterkt konservert, enkelt ekson-genet. SOX2 spiller forskjellige roller i hele utvikling og celledifferensiering, første dirigere pattedyr embryogenese [12], og senere bidrar til normal morfogenese og homeostase av den forutgående-avledet epitel av spiserør, lunge og luftrøret [13]. I voksen alder, blir SOX2 uttrykkes i en rekke forskjellige vev, nemlig i plateepitel langs spiserør og kjertel epitelet i magen. Det har vist seg, i mus, som Sox2 uttrykk bidrar til alle celle linjene som normalt finnes i magesekken, noe som antyder en viktig bidrag for gastrisk differensiering [14]. I tillegg har unormal ekspresjon av SOX2 blitt observert i tumorer i hjerne, bryst, lunge og spiserør [15-17]. Men i magekreft sammenheng, forblir dens rolle forvirrende og trenger ytterligere avklaring [18-20]. Videre sitt samspill med CDX2 forblir uutforsket.
Vårt mål var å analysere den kliniske relevansen av SOX2 og CDX2 uttrykk i magekreft biologi. Resultatene viser at deres uttrykk i de primære svulster har en relevant prognostisk verdi for mage kreftpasienter.
Metoder
menneskelig vev og DNA prøver
To hundre og ett tilfelle av formalinfiksert parafin-embedded (FFPE ) prøver fra pasienter med adenokarsinom i ventrikkel gjennomgår kirurgi ved Centro Hospitalar S. João, Porto, Portugal mellom 1988 og 2010 ble studert. Tilfeller utvalgte var de med tilgjengelige parafin-embedded materiale, clinicopathological og oppfølgingsdata innhentet fra patologi og kirurgiske avdelinger av Centro Hospitalar S. João. Fra dem, ble seksti syv prøvene gitt som et vev microarray (TMA), med 2 replikere kjerner av hver prøve fra svulsten og Tissue Biobank av den samme Pathology Department. Tumor genomisk DNA (gDNA) ble hentet fra 62 tilfeller med på TMA. gDNA ble også hentet fra FFPE prøver av to normale mage mucosas bruker Genomisk DNA Purification Kit (Citomed, Lisboa, Portugal), og brukes som kontroller. Alle prøver fra biobank ble oppnådd med informert samtykke fra pasientene. Bruk av retrospektive prøver som informert samtykke ikke kan innhentes er autorisert for forskningsstudier av den portugisiske lov. Denne studien ble godkjent av etisk komité av Centro Hospitalar S. João.
Immunohistochemistry
FFPE- vevssnitt med 4 mikrometer fra kirurgiske prøver og TMA ble utsatt for immunhistokjemi for SOX2, CDX2, MUC5AC og MUC2 etter standard metoder. I korthet, etter deparaffination og rehydratisering, ble antigen gjenfinning utført i et IHC-Tek Epitop Retrieval damp Set (IHC World, Woodstock, MD, USA), i 40 minutter med 10 mM citratbuffer, pH 6,0 (CDX2) eller 10 mM, pH 8,0 EDTA (SOX2). Desialylering ble utført for MUC2 deteksjon, med 0,1 U /ml av neuraminidase fra Clostridium perfringens
typen VI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i natrium-acetat-buffer pH 5,5 i 2 timer ved 37 ° C. Endogen peroksidase ble blokkert med 3% hydrogenperoksid i metanol i 10 min. Inkubasjon med primære antistoffer for CDX2 (1:50 fortynning, CDX2-88 klone, Biogenex, San Ramon, CA, USA), MUC5AC (1:10 fortynning, CLH2 klone) og MUC2 (1:10 fortynning, PMH1 klone) ble utført natten over, ved 4 ° C. Seksjonene ble deretter inkubert med en biotin-merket kanin-anti-muse-sekundært antistoff, etterfulgt av avidin /biotin-peroksidase deteksjonssystem (Vectastain ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). For SOX2 flekker, ble inkubasjon med det primære antistoff (1:50 fortynning, SP76 klone, Cell Marque, Rock, CA, USA) utført i 1 time ved romtemperatur og deteksjon ble gjort ved hjelp av Dako REAL ™ Envision ™ Detection System Peroxidase /DAB + (DAKO, Glostrup, Danmark) i henhold til produsentens instruksjoner. Påvisning av uttrykk ble utført med 3,3'-diaminobenzidin (DAB) (Sigma, St. Louis, MO, USA) vevssnitt ble kontra med Gills hematoksylin (Leica Microsystems, Amersham, Bucks, UK), dehydrert, avklart og montert. Normal gastrisk mukosa ble anvendt som en positiv kontroll for SOX2 og MUC5AC ekspresjon og normal tarmslimhinne ble anvendt som en positiv kontroll for CDX2 og MUC2 uttrykk. Tilfeller ble betraktet som positive når mer enn 5% av cellene ble farget med hvert antistoff med konsensus av tre observatører (VC, LD og RA).
Fluorescens In Situ
Hybridisering (FISH)
FISH ble brukt til å vurdere SOX2
forsterkning status i 21 prøvene ved anvendelse av en to-fargeanalyse som beskrevet av Bass et al product: [17]. En sonde som strekker seg over det geometriske sted 3q26.33 (BAC-klon CTD-2348H10) ble anvendt for å bestemme SOX2
kopitall, og ble sammenlignet med en referanse-probe som hybridiserer til 3p22.3-3p22.2 (BAC-klon RP11-286G5), kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Target-proben ble merket med digoksigenin (DIG-11-UTP, Roche, Mannheim, Tyskland) og påvist med et anti-digoksigenin-fluorescein-antistoffet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland) og referanse proben ble merket med biotin (BioPrime® DNA merking System, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og oppdaget med en CY 3-Avidin antistoff (Jackson Immunoresearch Lab, West Grove, USA).
Fire mikrometer lysbilder fra hver adenokarsinom i ventrikkel prøve ble deparaffinised, rehydrert og plassert i et forvarmet løsning av NaSCN 1M ved 80 ° C i 10 min. Prøvene ble spaltet med 6 mg /ml pepsin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i HCl 0,02 N, pH 2 i 30 minutter ved 37 ° C. Probe-blanding i 50% formamid i 2 x SSC ble codenatured med kjerne-DNA ved 94 ° C i 3 minutter. Hybridisering ble utført i 30 timer ved 37 ° C. Kjerner ble kontra med DAPI-Vectashield monteringsløsning (Vector, Burlingame, USA). For hvert tilfelle ble et minimum av 67 celler analysert i en fluorescens mikroskop (Zeiss Z1 Axio) og bildene ble kjøpt med en 1000 × forstørrelse, ved hjelp av en Zeiss Axio cam MRM og Axiovision Rel. 4.8 software. Forholdet mellom antall SOX2 og referansesondesignalene ble beregnet for hver celle individuelt og gjennomsnittet av forholdene ble bestemt for hvert tilfelle. Geneamplifikasjon ble ansett når den gjennomsnittlige var ≥2.
Kopier nummer variasjon (CNV) Analyser
CNV Analysen ble utført ved hjelp av en bestemt TaqMan® Kopier nummer analyse (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) etter produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble multipleks PCR for SOX2 product: (mål) og RNase P plakater (endogen kontroll) utført på en ABI Prism7500 Fast Real-time PCR system ved hjelp av programvaren v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA ). Tyve nanogram gDNA og en ikke-templat kontroll ble analysert i kvadruplikat. Normal mageslimhinnen prøver ble brukt som kalibratorer. Kvantifisering av SOX2
genkopitallet ble gjort ved hjelp av ΔΔCt metode og dataanalyse ble utført av CopyCaller programvare v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Genamplifikasjon ble definert når det genkopitallet var to ganger større enn den for normal gastrisk mucosa. Brett økning på mellom 1,5 og 2 ble ansett kopiantall gevinst.
Statistisk analyse
chi-kvadrat test ble brukt for å vurdere betydningen av forskjeller i clinicopathological kjennetegn på tvers av kategorier av SOX2 og CDX2 uttrykk, unntatt med alderen, der betydningen av forskjellene i midler ble beregnet ved hjelp av T
-test. Pasient total overlevelse ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og betydningen av forskjeller mellom rå overlevelseskurver ble testet av log-rank test. Cox-modellen ble brukt til å beregne univariate og multivariate hazard ratio. Median oppfølgingstid for overlevende pasienter var 62 måneder. 5- og 10-års overlevelse ble beregnet ved hjelp av liv-tabellen metoden. Forskjeller ble ansett som statistisk signifikant når de p
verdier var < 0,05. Analysene ble utført ved hjelp av SPSS programvare v21.0 (Chicago, IL, USA) og Stata v11 (College Station, TX, USA).
Resultater
SOX2 uttrykk i mage karsinom
Clinicopathological funksjonene i 201 magekreft tilfeller, så vel som ekspresjonsvektorer profiler av SOX2, CDX2, MUC2 og MUC5AC er oppsummert i tabell 1. Kjerne SOX2 ekspresjon ble funnet i 52% (104/201) av gastriske karsinomer og ekspresjon var heterogene mellom og innenfor de tumorer (figur 1A, B og C). I 13% (18/134) av tilfellene SOX2 uttrykk var høyere ved invasiv foran (figur 1D og E) (denne evalueringen ble bare utført i tilfeller som ikke er inkludert i TMA, hvor denne vurderingen ikke var mulig) .table 1 Sammendrag av clinicopathological parametere av magekreft i henhold til uttrykk av SOX2 og CDX2
SOX2
CDX2
Negativ
Positiv
<.no> Negativ
Positiv
N
%
N
%

p
N
%
N
%
p
Age, år1
Mean ± SD
65,8 ± 12,7
63,4 ± 13,5
0,2
64,1 ± 13,6
65,2 ± 12,6
0,6
Median (Range)
69 (34- 85)
66,5 (24-89)
69 (24-89)
67 (36-89)
Sex1
Mann fra 52
41,9
72
58,1
0,02
75
60,5
49
39,5
0,1
Kvinne
45
58,4
32
41,6
38
49,4
39
50,6
TNM Stage2
I /II
35
54,7
29
45,3
0,09
26
40,6
38
59,4
0,002
III /IV
59
44,7
73
55,3
83
62,9
49
37,1
T stage3
T1 /T2
22
62,9
13
37,1
0,03
13
37,1
22
62,9
0,007
T3 /T4
75
45,5
90
54,5
99
60,0
66
40,0
N Trinn1
N0
28
62,2
17
37,8
0,03
20
44,4
25
55,6
0,07
N +
69
44,2
87
55,8
93
59,6
63
40,4
Margins4
R0 85
47,5
94
52,5
0,5
98
54,7
81
45,3
0,2
R1
11
55,0
9
45,0
14
70,0
6
30,0
Vaskulær invasion4
Negativ
39
55,7
31
44,3
0,1
37
52,9
33
47,1
0,5
Positive
57
44,2
72
55,8
75
58,1
54
41,9
Láuren5
Tarm
44
49,4
45
50,6
0,9
45
50,6
44
49,4
0,3
Diffuse
20
48,8
21
51,2
26
63,4
15
36,6
Unclassified
31
46,3
36
53,7
40
59,7
27
40,3
Ming6
Ekspansiv
32
53,3
28
46,7
0,5
28
46.7
32
53,3
0,1
infiltrerende
60
45,8
71
54,2
81
61,8
50
38,2
Unclassified
2
66,7
1 33,3
1 33,3
2
66,7
SOX21
Negativ
58
59.8
39
40,2
0,3
Positive
55
52,9
49
47,1
CDX21
Negativ
58
51.3
55
48,7
0,3
Positive
39
44,3
49
55,7
MUC5AC1
Negativ
39
44,8
48
55,2
0,4 ​​
42
48,3
45
51,7
0,05
Positive
58
51,3
55
48,7
70
61,9
43
38,1
MUC21
Negativ
69
48,6
73
51,4
0,9
84
52.2
58
40,8
0,1
Positive
27
48,2
29
51,8
26
46,4
30
53,6
1N = 201; 2N = 196; 3N = 200; 4 N = 199; 5N = 197; 6N = 194.
Figur 1 SOX2 protein uttrykk i mage karsinom, oppdaget av immunhistokjemi. (A) heterogenitet av SOX2 uttrykk i mage svulster. Innenfor den samme tumorprøve, er områder med høye nivåer av SOX2 observert (B) i umiddelbar nærhet til områder med lavere ekspresjonsnivåer av SOX2 (C). (D, E) SOX2 uttrykk ved invasiv forsiden av svulster.
Deretter vurderes vi enten SOX2 uttrykk korrelert med clinicopathological funksjoner i sakene. Denne analysen viste at SOX2 uttrykk var signifikant assosiert med mannlige kjønn (p
= 0,02), med høyere T scenen (p
= 0,03) og med tilstedeværelse av regionale lymfeknutemetastaser (N scenen) (p
= 0,03). De andre clinicopathological parametre, som inkluderte alder, TNM stadium, tumor klaring på reseksjonskanten (R kategori), vaskulær invasjon, Laurén klassifisering og Ming-klassifisering ble ikke signifikant assosiert med SOX2 uttrykk (tabell 1).
Siden SOX2 er forbundet med gastric differensiering [14] vi undersøkt om dette ble opprettholdt i kreft, ved hjelp MUC5AC som en gastric markør. Men ingen sammenheng ble funnet mellom SOX2 og MUC5AC uttrykk. Likeledes ble det ikke motsatt assosiasjon funnet mellom SOX2 og CDX2 /MUC2 (brukt som markører for tarm differensiering). Av notatet, ble CDX2 uttrykk signifikant assosiert med en lavere TNM stadium (p
= 0,002) og med en lavere T stadium (p
= 0,007). Videre, selv om ikke statistisk signifikant, var det en trend mot en invers sammenheng mellom CDX2 og MUC5AC (p =
0,05).
Survival analyse
5-års overlevelse, basert på oppfølging av 199 pasienter, var 35% (tilleggsfiler 1: Figur S1). Vi neste observert at SOX2 uttrykk i svulstene ble forbundet, i univariat analyse, med en samlet dårligere overlevelse (p
= 0,02), stratifisering pasientene inn i to prognostiske grupper (figur 2A), med en 5-års overlevelse på 45 % for pasienter med SOX2- tumorer versus 26% for pasienter med SOX2 + svulster. Tvert imot, CDX2 uttrykk forbundet med en samlet forbedret overlevelse, selv om forskjellen ikke nådde signifikans (data ikke vist). Figur 2 Kaplan-Meier-kurver som viser sannsynligheten for total overlevelse for pasienter med magekreft ifølge SOX2 uttrykket (A) og i henhold til den molekylære fenotyper SOX2 - /CDX2 + og SOX2 + /CDX2 - (B).
Basert på foreningen av SOX2 og CDX2 med verre og bedre overlevelse samt flere og mindre aggressive clinicopathological funksjoner, henholdsvis, vi videre undersøkt pasientenes utfall i henhold til de molekylære fenotyper definert av både proteiner. Fire grupper av pasienter kunne defineres (tilleggsfiler 1: Figur S2), hvorav den ene med den beste overlevelses hadde svulster negative for SOX2 og positive for CDX2 (SOX2- /CDX2 +), mens overlevelse var lavest hos pasienter som hadde svulster med motsatt profil, positivt for SOX2 og negative for CDX2 (SOX2 + /CDX2-) (p
= 0,01) (tilleggsfiler 1: Figur S2 og figur 2B). Sakene med uttrykk for både SOX2 og CDX2 eller uten uttrykk for enten markør viste en lignende og mellom overlevelse (tilleggsfiler 1: Figur S2). Den SOX2- /CDX2 + og SOX2 + /CDX2- molekylære fenotyper, sammenlignet med SOX2 alene, spår svært like overlevelsesraten ved 5 år (49% vs 26% og 45% vs 26%, henholdsvis). Men det spådd 10-års overlevelse basert på SOX2 uttrykk alene er 34% (SOX2-) vs 22% (SOX2 +), mens ved hjelp av SOX2 /CDX2 molekylære fenotyper, blir det 41% (SOX2- /CDX2 +) vs 14% (SOX2 + /CDX2-).
Vi ytterligere utforsket innvirkning på pasientenes overlevelse av de molekylære fenotyper definert av SOX2 + vs SOX2-, CDX2 + vs CDX2- og SOX2- /CDX2 + versus SOX2 + /CDX2- stratifisert etter clinicopathological parametere. I dette tilfellet plotting overlevelse ifølge enten SOX2 eller CDX2 status alene ga signifikante forskjeller prognostiske for det tidligere, i noen av parameterne (intestinal- og ekspanderende-type tumorer), og ingen forskjeller for CDX2 alene (Tilleggs fil 1: figurer S3 og S4). Resultater fra Cox proporsjonal modell er presentert i tilleggsfiler 1: Tabell S1. Nok en gang, ved bruk av den kombinerte ekspresjon av SOX2 og CDX2 raffinert de tidligere resultater (figur 3). SOX2 + /CDX2 - profil spådd et vesentlig dårligere resultat av pasienter med tarm (p
= 0,005) og ekspanderende (p
= 0,002) svulster, med fare forholdstall på 3,18 og 4,84, henholdsvis , og av dem uten tegn til venøs invasjon (p
= 0,009), presenterer et hasardratio på 3,84. Selv om grensen ikke-signifikant, ble en lignende tendens observert hos pasienter uten lymfeknutemetastaser (p
= 0,08) (figur 3). Hazard ratio og 95% konfidensintervall for alle grupper er presentert i detalj i tabell 2 og forblir signifikant etter justering for alder og kjønn i en multivariat analyse. Figur 3 Kaplan-Meier-kurver som viser sannsynligheten for total overlevelse for pasienter med magekreft i henhold til molekyl fenotyper SOX2 - /CDX2 + og SOX2 + /CDX2 - stratifisert i henhold til clinicopathological parametre: Laurén klassifisering (A), Ming klassifikasjon (B) , venøs invasjon (C) og lymfeknutemetastaser (D).
Tabell 2 Cox modeller av overlevelse som en funksjon av de molekylære fenotyper (SOX2 + /CDX2- vs SOX2- /CDX2 +) for hver clinicopathological parameter
Parameter
Hazard ratio (95% CI)

Ujustert
P
Adjusteda
P

Generelt
1.95 (1.15 til 3.31)
0,01
1.90 (1.10 til 3.28)
0,02
Laurén klassifisering
Intestinal-type
3,18 (1,33 til 7,58)
0,009
2.93 (1.21 til 7.10)
0,02
Diffus-type
1,35 (0,35 til 5,17)
0,7
Unclassified
1,34 (0,60 til 3,02)
0,5
Ming klassifisering
Utvide
4,84 (1,64 til 14,29)
0,004
4,53 (1,29 til 15,85)
0,02
infiltrerende
1,13 (0,60 til 2,13)
0,7
Vaskulær invasjon
Negativ
3,84 (1,30 til 11,35)
0,02
3,82 (1,29 til 11,40)
0,02
Positive
1.10 (0.60- 2.02)
0,8
N scenen
N0
2,96 (0,82 til 10,65)
0,1
3,98 (0,72 til 21,83)
0,1
N +
1,29 ( 0,72 til 2,30)
0,4 ​​
forkortelse: CI
konfidensintervall
en Justert for alder og kjønn (multivariat analyse ved hjelp av Cox regresjonsmodellen)
SOX2 forsterkning
betraktning at genet.. forsterkning er en tumor-spesifikk hendelse i løpet av malign transformasjon, og det SOX2 locus blir underkastet denne endring i andre tumorer, nemlig av lungen og spiserør [17], hypotese vi at SOX2 amplifikasjon kan forklare dets ekspresjon og heterogenitet, både innenfor og mellom mage svulster. Støtte denne hypotesen, en undersøkelse utført på Oncomine database viste at SOX2 rangert blant de beste 10% gener med kopi nummer gevinster i magekreft (Tilleggs fil 1: Figur S5).
Basert på immunhistokjemi data, valgte vi 14 tilfeller med SOX2 uttrykk og 7 negative tilfeller å analysere ved to-farge FISH analysen. Vi har observert at SOX2 ble amplifisert i 14% (2/14) av tilfellene med ekspresjon og i ingen av tilfellene uten uttrykket (0/7). En representativ positiv tilfelle både for SOX2 ekspresjon og forsterkning er vist i figur 4A og B. En tilfelle med SOX2 uttrykk, men ingen forsterkning er vist i figur 4C og D. Videre er FISH-analyse viste nærvær av en høy grad av kopiantall vinning og heterogenitet innenfor tumorer, observert ikke bare med target-proben for SOX2
locus, men også med referansesonden, som ligger til den 3p arm (Tilleggs fil 1: Figur S6). Figur 4 Magekreft tilfeller med SOX2 proteinekspresjon (A og C) kan presentere med eller uten SOX2 forsterkning (B og henholdsvis D,) bestemmes av fisk. Grønn merket prober målrette SOX2
, mens røde merkede prober målrette 3p arm. Kjerner er farget med DAPI (blå). (E) sekstito gDNA magekreftprøver ble vurdert for SOX2 kopiantall status og sammenlignet med normal mageslimhinnen (kalibrator). (F) SOX2 kopiantall var signifikant assosiert med protein uttrykk, bestemmes av IHC (p
< 0,05).
Å avklare hyppigheten av SOX2
locus kopitall endringer i magekreft, utførte vi en kopi -nummer PCR bruker gDNA fra 62 mage krefttilfeller, ved hjelp av en RNase P
sonde plassert i kromosom 14 som referanse. De fleste av prøvene (93%) viste en viss grad av SOX2
kopitall variasjon, som strekker seg fra 3 til 9 kopier (figur 4E). En betydelig positiv sammenheng mellom kopiantall gevinst og SOX2 uttrykk (p
< 0,05). Det ble observert (figur 4F)
Diskusjon
Magekreft er en sykdom med flere utfall som ikke kan forutses ved clinicopathological funksjoner alene [6]. Følgelig identifisering av molekylære biomarkører som kan tillate ytterligere utfall og stratifisering og behandling beslutninger er av avgjørende betydning.
I denne studien vi preget uttrykk for transkripsjonsfaktoren SOX2 i magekreft og relatert det med clinicopathological funksjoner og differensiering markører nemlig MUC5AC (gastric markør) og CDX2 og MUC2 (tarm markører). Dette førte til identifisering av to forskjellige prognostiske grupper, basert på SOX2 uttrykk, som kan bli ytterligere raffinert ved å ta hensyn til kombinert uttrykk med CDX2. Til slutt raknet vi heterogenitet SOX2
locus og kromosom 3 kopiantall i magekreft, noe som viser en sammenheng mellom økt kopiantall og SOX2 protein uttrykk., En nøkkel funn av denne studien var den observasjon at SOX2 uttrykk alene, og videreutviklet av kombinasjonen med CDX2, gjør at lagdelingen av pasienter i undergrupper med vesentlig forskjellige kliniske resultater. Videre, når vi kombinerte disse molekylære profiler med clinicopathological data, ble det klart at den SOX2 + /CDX2 - profil forbundet med en dårligere prognose, innen undergrupper av svulster som i alminnelighet har en bedre prognose: intestinal-typen , utvide-type og med ingen tegn til venøs invasjonen [21, 22]. Selv om det ikke er statistisk signifikant, ble den samme tendens ble observert for tumorer presentere uten lymfeknutemetastaser. Disse molekyl profilene tilsier en annen biologisk oppførsel av tumoren mest sannsynlig på grunn av sykdomsprogresjon eller behandling motstand og kan anvendes til å instruere mer effektiv behandling eller oppfølging planer.
Spesielt, som lymfeknutemetastase er en av de viktigste risiko faktorer for magekreft tilbakefall etter en R0 kirurgi, alle pasienter lymfeknutemetastaser får adjuvant behandling [23]. Men våre resultater viser at pasienter uten denne risikofaktoren, og dermed ikke behandles, presentere en påfallende verre utfall når svulsten presenterer med en SOX2 + /CDX2 - molekylær profil. Dette legger frem hypotesen om at innen N0 svulster, pasienter i denne molekylære gruppen vil trolig ha nytte av adjuvant behandling. Likevel, disse observasjonene krever validering i større kohorter, og det ville også være veldig lærerikt å legge klinisk informasjon om pasientbehandlingen.
SOX2 også fremstår som et potensielt mål for nye terapeutiske intervensjoner. Selv transkripsjonsfaktorer er ikke klassiske narkotika mål, tilnærminger til SOX2-rettet behandling er allerede ivaretatt i brystkreft. I en fersk undersøkelse, ble SOX2
genet selektivt målrettet hjelp sink-finger-basert kunstig transkripsjonsfaktorer tilnærming, noe som resulterer i sin svært spesifikke, potent og langvarig nedregulering, oversette til en svekket tumorigenicity, både in vitro
Figur S2. Figur S3. Tabell S1.

• Glutation S-transferase gen GSTM1, gen-gen interaksjon, og magekreft mottakelighet: bevis fra en oppdatert meta analysis
• Et pust av frisk luft: et kvalitets-forbedring studie som sammenligner en luft-sirkulerende teknikk versus konvensjonell teknikk for å hindre nesesonde dysfunksjon