Immunhisztokémiai fenotípus molekuláris gyomorrák alapuló Sox2 és CDX2 megjósolni a betegség kimenetelével

Immunhisztokémiai fenotípus molekuláris gyomorrák alapuló Sox2 és CDX2 megjósolni a betegség kimenetelével katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa gyomorrák továbbra is komoly egészségügyi probléma az egész világon. A betegek számára rendkívül hasznos lenne a felfedezés új biomarker megjósolni eredmény pontosabban, és lehetővé teszi a jobb kezelés és nyomon követés döntéseket. Itt kihasználtuk, retrospektív, megfigyeléses vizsgálat, hogy értékelje a véleménynyilvánítás és prognosztikus transzkripciós faktorok Sox2 és CDX2 gyomorrákban. Katalógusa Methods katalógusa Sox2, CDX2, MUC5AC és MUC2 kifejezés értékelték 201 gyomor tumorok immunhisztokémiai . Sox2 és CDX2 kifejezés keresztezték a klinikopatológiai és nyomon követési adatok alapján határozza meg azok hatását a daganat viselkedését és eredményéről. Sőt, Sox2 katalógusa locus kópiaszám állapotát értékelték FISH (N = 21) és a kópiaszám variáció vizsgálat (N = 62). Katalógusa Eredmények katalógusa Sox2 fejeztük 52% a gyomor tumorok és szignifikánsan társított a férfi nem, T-stádium és N stádium. Sőt, Sox2 kifejezés megjósolta szegényebb betegek túlélése, valamint az együtt CDX2 meghatározott két molekuláris fenotípust Sox2 + CDX2 - versus Sox2 -CDX2 +, hogy előre a legrosszabb és a legjobb hosszú kifejezés a betegek kimenetelét. Ezek a profilok együtt klinikopatológiai paraméterek rétegződik a betegek prognózisát a bél és bővülő daganatok és az említett jelek nélkül vénás invázió. Végül Sox2
lokusz kópiaszám nyereséget találtak 93% A minták elérő amplifikációs küszöbérték 14%, és jelentősen tömörítő fehérje expresszióját.
Következtetések
Kimutattuk, az első alkalommal, hogy Sox2 kombinált a CDX2 expressziós profilja gyomorrákos betegek elkülönítésére különböző prognosztikai csoportok, kiegészítve a klinikopatológiai adatok. Mi tovább bizonyítják a molekuláris mechanizmust Sox2 kifejezés egy részét gyomorrák esetek. Katalógusa Kulcsszavak katalógusa Sox2 CDX2 gyomorrák prognózisa Survival Háttér katalógusa Gyomorrák egyik leggyakrabban diagnosztizált rákok és most a harmadik vezető oka rák összefüggő halálesetek a világon. [1] Laurén osztályozással gyomorrák két fő szövettani típusa: bél és diffúz [2]. Ismertetik különböző morfológiai, klinikai és epidemiológiai funkciók és úgy gondolják, hogy fejlesszék az aktiválása független molekuláris mechanizmusokat. Epidemiológiai adatok azt mutatják, hogy a legtöbb esetben, a gyomorrák nem merül fel de novo
a normál gyomornyálkahártya, hanem inkább eredménye egy többlépéses folyamat, az egymást követő genetikai és epigenetikai változások több gén. Ellentétben a diffúz típusú, amelyre hajlamosító elváltozások nem megalapozott, az egymást követő események vezető gyomorrák intesztinális típusú jól leírható. Szerint a Correa kaszkád, fejlődik, lépcsőzetes módon, általában által kezdeményezett gyulladásos folyamat által kiváltott Helicobacter pylori katalógusa, amely átmehet multifokális atrófiás gasztritisz, intesztinális metaplázia (IM), diszplázia, és végül adenocarcinoma [3].
Annak ellenére, hogy már folyamatosan csökken a gyomorrák előfordulása világszerte, bővítése és az öregedés a világ népességének előrejelzése növekedése az esetek számát, és annak ellenére, hogy a legújabb fejlesztéseket a diagnózis és a kezelés, a gyomorrák prognózisa betegek maradványait szegény. Ez több, az 5 éves túlélési arány nem több, mint 25%, Európában [4]. A legtöbb gyomorrákos betegek előrehaladott betegség diagnosztizálására, akik számára az egyetlen lehetőség a gyógyulás támaszkodik teljes sebészi eltávolítása a daganat, kiterjedt nyirokcsomó-eltávolítás lehet egészíteni a beadása neoadjuváns vagy adjuváns kemoterápia [5]. A legfontosabb prognosztikai tényező, amely befolyásolja a túlélést, valamint a kezelés választás a TNM. Azonban egy további réteg komplexitás ered a megfigyelés, hogy a betegek az azonos staging gyakran mutatnak különböző klinikai evolúció, kiemelve a heterogenitás gyomorrák [6]. Ez arra utal, hogy az egyedülálló belső biológiai tulajdonságait a daganatok jelentős mértékben befolyásolhatja az agresszív lehetséges. Ezért még mindig sürgető szükség, hogy felfedezzék a további prognosztikus biomarkerek megjósolni eredményét pontosabban, és ennek eredményeként, hogy segítsen, hogy jobban informált a terápiás döntések tekintetében a terápiára. Mint a tumorok, amelyek jobban differenciált általában viselkednek egy kevésbé agresszív módon, mi megkérdőjelezték a jelentősége a két differenciálódási markerek, Sox2 és CDX2, a biológiai viselkedését gyomor rák. Ezek a jelzők egymástól eltérő módon fejeződnek a lánc az eseményeket, amelyek a gyomorrák és szorosan összefüggő gyomor- és bélrendszeri differenciálódás, illetve [7].
CDX2 egy bél-specifikus homeobox transzkripciós faktor, amelynek a funkció biztosítja a fejlesztése és karbantartása bél differenciálódás a bélben és a méhen kívüli területek, amelyek már jól megalapozott volt állatmodellekben [8, 9]. Széles körben ismert, hogy a CDX2 expresszálódik emberi intestinalis metaplázia a gyomor és a nyelőcső [10]. Bebizonyosodott, hogy is kifejezni dysplasia megerősítve ezzel szerepét biomarkere progresszió preneoplasztikus szakaszában gyomor carcinogenesis [11]. Katalógusa Sox2 tagja a SOX (SRY kapcsolatos HMG Box) család a transzkripciós faktorok által kódolt egy erősen konzervált, egyetlen exon gén. Sox2 játszik különböző szerepeket egész fejlődés és a sejtdifferenciálódást, első orchestrating az emlős embriogenezis [12], és később hozzájárul a normális morfogenezis és a homeosztázis az előbél-eredetű hámban a nyelőcső, a tüdő és trachea [13]. A felnőttkorban, Sox2 expresszálódik a különböző szövetekben, nevezetesen a laphám bélés a nyelőcső és a mirigyes hámszövet a gyomor. Bebizonyosodott, hogy egerekben, hogy Sox2 expresszió hozzájárul az összes sejtvonal normálisan megtalálható a gyomorban, ami arra utal, fontos hozzájárulást gyomor differenciálódását [14]. Ezen túlmenően, abnormális expressziója Sox2 figyelték meg tumorok az agy, az emlő, a tüdő és a nyelőcső [15-17]. Azonban a gyomorrák összefüggésben szerepe továbbra is rejtélyes és további tisztázásra szorul [18-20]. Továbbá milyen kölcsönhatásban áll CDX2 marad feltáratlan.
Célunk az volt, hogy elemezze a klinikai jelentősége Sox2 és CDX2 kifejezés gyomorrákban biológia. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a kifejezést a primer tumor egy fontos prognosztikai értéke gyomorrákos betegek. Katalógusa módszerek katalógusa emberi szövetek és DNS-minták katalógusa Kétszáz és egy esetben a formalin-fixált, paraffinba ágyazott (FFPE ) származó minták betegek gyomor adenokarcinóma operálják Centro Hospitalar S. João, Porto, Portugália között 1988 és 2010-ben vizsgálták. Esetekben kiválasztott voltak a rendelkezésre álló paraffinba ágyazott anyag, klinikopatológiai és nyomon követése nyert adatokat a Patológiai és sebészeti osztály Centro Hospitalar S. João. Azoktól, hatvanhét mintákat rendelkezésre, mint egy szövet microarray (TMA), 2 párhuzamos magot minden minta, a tumor és Tissue Biobank azonos Patológiai Osztály. Tumor genomi DNS (gDNS) kapunk 62 esetben szerepelnek a TMA. gDNS is kivont FFPE minták két normál gyomor nyálkahártyák használatával genomiális DNS tisztító készletet (Citomed, Lisszabon, Portugália), és alkalmaztunk kontrollként. Minden mintát a biobank kaptunk beleegyezését a betegektől. Használata visszamenőleges mintát, amely tájékozott beleegyezés nem szerezhető engedélyezett kutatások szerint a portugál jog. Ez a tanulmány által jóváhagyott etikai bizottsága Centro Hospitalar S. João. Katalógusa immunhisztokémiai katalógusa FFPE szöveti metszeteken 4 um-sebészeti mintákban és TMA vetettük alá immunhisztokémiai Sox2, CDX2, MUC5AC és MUC2 követően szokásos módszerekkel. Röviden, miután paraffinmentesítésével és rehidratálás, antigén-visszanyerés végeztük IHC-Tek Epitóp visszakeresés pároló Set (IHC World, Woodstock, MD, USA), 40 percig 10 mM citrát pufferrel, pH = 6,0 (CDX2) vagy 10 mM, pH = 8.0 EDTA (Sox2). Desialylation végeztük MUC2 kimutatására, 0,1 U /mL neuraminidáz Clostridium perfringes
típusú vi (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) nátrium-acetát-pufferrel pH = 5,5 2 órán át 37 ° C-on. Az endogén peroxidáz blokkoltuk 3% -os hidrogén-peroxiddal metanolban 10 percig. Inkubációs primer antitestekkel CDX2 (1:50 hígítás, CDX2-88 klón BioGenex, San Ramon, CA, USA), MUC5AC (1:10 hígítás, CLH2 klón), és MUC2 (1:10 hígítás, PMH1 klón) végeztük éjszakán át, 4 ° C-on. A metszeteket azután inkubáljuk egy biotinnal jelzett nyúl anti-egér szekunder antitesttel, majd az avidin /biotin-peroxidáz detektáló rendszer (Vectastain ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). A Sox2 festés, inkubálás a primer antitesttel (1:50 hígítás, SP76 klón, Cell Marque, Rockling, CA, USA) végeztük 1 órán át szobahőmérsékleten, és detektálás alkalmazásával végeztük Dako REAL ™ Envision ™ Detection System Peroxidase /DAB + (DAKO, Glostrup, Dánia) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Kimutatása kifejezés végeztük 3,3'-diamino (DAB) (Sigma, St.. Louis, MO, USA) metszeteket kontrasztfestést Gill hematoxilinnel (Leica Microsystems, Amersham, Bucks, Egyesült Királyság), dehidratált, pontosítani és szerelt. Normál gyomornyálkahártya alkalmaztunk pozitív kontrollként az Sox2 és MUC5AC expresszió és normális vastagbél-nyálkahártya alkalmaztunk pozitív kontrollként az CDX2 és MUC2 kifejezést. Olyan esetek tekintettük pozitívnak, ha több, mint 5% -a a sejteket megfestettük mindegyik antitest konszenzus három megfigyelő (VC; LD és RA).
Fluoreszcens in situ
hibridizáció (FISH) katalógusa FISH használtunk értékelje Sox2
amplifikációs állapotát 21 minta, egy 2-színű assay által leírtak szerint Bass és munkatársai katalógusa [17]. Egy szonda spanning a locus 3q26.33 (BAC klón CTD-2348H10) használtuk annak meghatározására, Sox2
másolatok száma és összehasonlítottuk egy referencia szondával hibridizáló 3p22.3-3p22.2 (BAC klón RP11-286G5), megvásárolt Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). A megcélzott próbát digoxigenin (DIG-11-UTP, Roche, Mannheim, Németország), és detektáltuk egy anti-digoxigenin-fluoreszcein antitest (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Németország) és a referencia-próbát biotinnal (BioPrime® DNS jelölő rendszer, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), és detektáltuk egy CY 3-Avidin antitesttel (Jackson Immuno Lab, West Grove, USA).
Négy jim diákat egyes gyomor adenokarcinóma mintában deparaffinised, rehidratált és helyezzük előmelegített oldatát NaSCN 1M 80 ° C-on 10 percig. A mintákat emésztettünk 6 mg /ml pepszinnel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) HCI 0,02 n, pH = 2 30 percen át 37 ° C-on. Szonda keverék 50% formamid 2 × SSC-ben codenatured nukleáris DNS 94 ° C-on 3min. A hibridizáció végeztük 30h 37 ° C-on. A sejtmagokat ellenfestjük DAPI-Vectashield szerelési oldatot (Vector, Burlingame, USA). Minden egyes esetben, legalább 67 sejtet vizsgáltunk egy fluoreszcens mikroszkópban (Zeiss Z1 Axio) és kép szerzett egy 1000 × nagyítással, egy Zeiss Axio bütyök MRm és a Axiovision Rel. 4.8 szoftver. Az arány száma közötti Sox2 és a referencia szonda jelek számoltuk minden egyes sejt külön-külön, és az átlag az arányok meghatározzuk mindegyik esetben. A génamplifikáció tartották, amikor az átlagos volt ≥2.
Copy Number Variation (CNV) vizsgálatokban
CNV vizsgálatot végeztünk egy adott TaqMan® Copy Number Assay (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) követően a gyártó utasításait. Röviden, multiplex PCR-eket az Sox2 katalógusa (cél) és az RNáz P katalógusa (endogén kontroll) végeztük ABI Prism7500 gyors, valós idejű PCR-rendszer segítségével a szoftver v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA ). Húsz nanogramm gDNS és nem sablonként kontroll elemezték négyszeres. Normál gyomornyálkahártya mintákat használunk kalibrátorokat. Számszerűsítése Sox2 katalógusa gén kópiaszámának alkalmazásával végeztük ΔΔCt módszer és az adatok elemzést végeztünk a CopyCaller szoftver v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A génamplifikáció definiáltuk, amikor a gén kópiaszámának volt 2-szer nagyobb, mint a normál gyomor nyálkahártyáját. Szeres növekedést 1,5 és 2 ítélték kópiaszám nyereség.
Statisztikai analízis katalógusa A chi-négyzet próbát alkalmaztunk jelentőségének értékeléséhez különbségek klinikopatológiai jellemzők egész kategóriáit Sox2 és CDX2 kifejezés, kivéve az életkor, amikor a jelentőségét különbségek eszközök alkalmazásával számítottuk ki T
-teszt. A betegek teljes túlélés számoltuk a Kaplan-Meier módszerrel és jelentőségét különbségek nyers túlélési görbék vizsgálatára a log-rank teszt. Cox-féle arányos kockázati modell segítségével számítottuk egy- és többváltozós kockázati arányok. Medián követési idő a túlélő betegek 62 hónap. Az 5 és 10 éves túlélési arány alkalmazásával becsültük élet-táblázatos módszerrel. A különbségeket akkor tekintettük statisztikailag szignifikánsnak, ha a p
értékek < 0,05. Az analíziseket az SPSS szoftverrel v21.0 (Chicago, IL, USA) és Stata v11 (College Station, TX, USA). Katalógusa Eredmények katalógusa Sox2 kifejezés a gyomor carcinoma
Klinikopatológiai jellemzői a 201 gyomorrák esetek, valamint az expressziós profilok Sox2, CDX2, MUC2 és MUC5AC táblázatban foglaljuk össze 1. nukleáris Sox2 expressziót találtunk 52% (104/201) a gyomor karcinómák és az expresszió heterogén között és azokon belül a daganatok (ábra 1A, B és C). 13% (18/134) az esetek Sox2 expresszió nagyobb volt az invazív elülső (1D ábra és E) (ez az értékelés csak végre azokban az esetekben, amelyek nem tartoznak a TMA, ahol ez az értékelés nem volt lehetséges) .table 1 Összefoglalás a klinikopatológiai paraméterek gyomorrák szerint a kifejezés a Sox2 és CDX2 Matton Sox2 Matton CDX2
Negatív Matton Pozitív katalógusa
Negatív
Pozitív
N Matton% Matton N Matton% katalógusa
p Matton N Matton% Matton N Matton% Matton p Matton Age, years1
átlag ± SD katalógusa 65,8 ± 12,7 katalógusa 63,4 ± 13,5 katalógusa 0.2 katalógusa 64,1 ± 13,6 katalógusa 65,2 ± 12,6 katalógusa 0.6 katalógusa medián (tartomány) hotelben 69 (34- 85) hotelben 66,5 (24-89) hotelben 69 (24-89) hotelben 67 (36-89) hotelben Sex1 katalógusa Férfi katalógusa 52 katalógusa 41,9 katalógusa 72
58,1 katalógusa 0,02 katalógusa 75 katalógusa 60,5 katalógusa 49 katalógusa 39,5 katalógusa 0.1 fiatal női katalógusa 45 katalógusa 58,4 katalógusa 32 katalógusa 41,6 katalógusa 38 katalógusa 49,4 katalógusa 39 katalógusa 50,6 katalógusa TNM stage2 katalógusa I /II
35 katalógusa 54,7 katalógusa 29 katalógusa 45,3 katalógusa 0,09 katalógusa 26
40,6 katalógusa 38 katalógusa 59,4 katalógusa 0.002 katalógusa III /IV katalógusa 59 katalógusa 44,7 katalógusa 73 katalógusa 55,3 katalógusa 83 katalógusa 62,9 katalógusa 49
37,1 katalógusa T stage3 katalógusa T1 /T2 katalógusa 22 katalógusa 62,9 katalógusa 13
37,1 katalógusa 0,03 katalógusa 13
37,1 katalógusa 22 katalógusa 62,9
0,007 katalógusa T3 /T4
75 katalógusa 45,5 katalógusa 90 katalógusa 54,5 katalógusa 99 katalógusa 60,0 katalógusa 66 katalógusa 40,0 katalógusa N stage1 katalógusa N0 katalógusa 28
62,2 katalógusa 17 katalógusa 37,8 katalógusa 0,03 katalógusa 20 katalógusa 44,4 katalógusa 25 katalógusa 55,6 katalógusa 0,07 katalógusa N + katalógusa 69
44,2 katalógusa 87 katalógusa 55,8 katalógusa 93 katalógusa 59,6 katalógusa 63 katalógusa 40,4 katalógusa Margins4 katalógusa R0 katalógusa 85 katalógusa 47,5 katalógusa 94 katalógusa 52,5
0,5 katalógusa 98 katalógusa 54,7 katalógusa 81 katalógusa 45,3 katalógusa 0.2 katalógusa R1 katalógusa 11
55,0 katalógusa 9 katalógusa 45,0 katalógusa 14
70,0 katalógusa 6 katalógusa 30,0 katalógusa Érrendszeri invasion4 katalógusa Negatív katalógusa 39 katalógusa 55,7 katalógusa 31 katalógusa 44,3 katalógusa 0.1 katalógusa 37 katalógusa 52,9 katalógusa 33 katalógusa 47,1 katalógusa 0.5 katalógusa Pozitív katalógusa 57 katalógusa 44,2 katalógusa 72 katalógusa 55,8 katalógusa 75 katalógusa 58,1 katalógusa 54 katalógusa 41,9 katalógusa Láuren5
Bél
44 katalógusa 49,4 katalógusa 45 katalógusa 50,6 katalógusa 0.9 katalógusa 45 katalógusa 50,6 katalógusa 44 katalógusa 49,4 katalógusa 0.3 katalógusa Diffúz katalógusa 20 katalógusa 48,8 katalógusa 21 katalógusa 51,2 katalógusa 26 katalógusa 63,4 katalógusa 15 katalógusa 36,6 katalógusa Unclassified katalógusa 31 katalógusa 46,3 katalógusa 36 katalógusa 53,7
40 katalógusa 59,7 katalógusa 27 katalógusa 40,3 katalógusa Ming6 katalógusa Kiterjedt katalógusa 32 katalógusa 53,3 katalógusa 28
46,7 katalógusa 0.5 katalógusa 28 katalógusa 46,7 katalógusa 32 katalógusa 53,3 katalógusa 0.1 katalógusa infiltratív katalógusa 60 katalógusa 45,8 katalógusa 71 katalógusa 54,2 katalógusa 81 katalógusa 61,8 katalógusa 50 katalógusa 38,2
Unclassified katalógusa 2

• Glutation-S-transzferáz-gén GSTM1, gén-gén kölcsönhatás, és a gyomorrák érzékenység: bizonyíték egy frissített meta-analysis
• A friss levegőt: a minőség-javulás összehasonlító tanulmány a levegő-keringető technika versus hagyományos módszer, hogy megakadályozzák orrüregi dréncső dysfunction