Immunohistokemiske molekylære fænotyper af mavekræft baseret på SOX2 og CDX2 forudsige patientens resultat

Immunohistokemiske molekylære fænotyper af mavekræft baseret på SOX2 og CDX2 forudsige patientens udfald
Abstract
Baggrund
mavekræft fortsat et alvorligt sundhedsproblem i hele verden. Patienter vil få stor gavn af opdagelsen af ​​nye biomarkører, der forudsiger resultatet mere præcist og muliggøre en bedre behandling og opfølgning beslutninger. Her brugte vi en retrospektiv, observationsstudie at vurdere udtryk og prognostiske værdi af transskription faktorer SOX2 og CDX2 i mavekræft.
Metoder
SOX2, CDX2, MUC5AC og MUC2 udtryk blev vurderet i 201 gastriske tumorer ved immunhistokemi . SOX2 og CDX2 udtryk blev krydset med klinisk-patologiske og opfølgende data til at bestemme deres indvirkning på tumor adfærd og resultat. Desuden Sox2
locus kopi nummer status blev vurderet ved FISH (N = 21) og Copy Number Variation Assay (N = 62).
Resultater
SOX2 blev udtrykt i 52% af de gastriske tumorer og var signifikant forbundet med mandligt køn, T scenen og N stadium. Desuden SOX2 udtryk forudsagde dårligere patient overlevelse, og kombinationen med CDX2 defineret to molekylære fænotyper, Sox2 + CDX2 - versus SOX2 -CDX2 +, der forudsiger det værste og det bedste lang langsigtede patienternes resultat. Disse profiler kombineret med klinisk-patologiske parametre stratificere prognosen for patienter med intestinale og ekspanderende tumorer og patienter uden tegn på venøs invasion. Endelig blev SOX2
locus kopital gevinster fundet i 93% af prøverne nåede forstærkningen tærskel i 14% og væsentligt at associere med proteinekspression.
Konklusioner
vi viste for første gang, at SOX2 kombineret med CDX2 udtryk profil i mavekræft adskille patienter i forskellige prognostiske grupper, supplerer klinisk-patologisk information. Vi demonstrerer endvidere en molekylær mekanisme for SOX2 ekspression i en delmængde af gastriske cancertilfælde.
Nøgleord
SOX2 CDX2 Gastrisk kræftprognose Survival Baggrund
mavekræft er en af ​​de mest almindeligt diagnosticeret kræft og nu den tredje hyppigste årsag af kræft-relaterede dødsfald i verden [1]. Lauren klassifikation inddeler mavekræft i to hovedkategorier histologiske typer: tarm og diffus [2]. De præsenterer forskellige morfologiske, kliniske og epidemiologiske funktioner og menes at udvikle sig fra aktiveringen af ​​uafhængige molekylære mekanismer. Epidemiologiske data viser, at i de fleste tilfælde har mavekræft ikke opstå de novo
fra den normale gastriske epitel, men snarere skyldes en flertrinsproces, gennem successive genetiske og epigenetiske ændringer i multiple gener. I modsætning til den diffuse type, for hvilke prædisponerende læsioner ikke er veletablerede, er rækken af ​​begivenheder, der fører til gastrisk kræft i tarm typen velbeskrevet. Ifølge Correa s kaskade, det udvikler sig på en trinvis måde, sædvanligvis indledes af en inflammatorisk proces udløst af Helicobacter pylori
, som kan udvikle sig til multifokale atrofisk gastritis, intestinal metaplasi (IM), dysplasi og endelig adenocarcinom [3].
Selv om der har været et støt fald i gastrisk kræfttilfælde globalt, udvidelse og ældning af verdens befolkning forventer en stigning i antallet af sager, og trods den seneste udvikling i diagnose og behandling, er prognosen for mavekræft patienter rester dårlig. Dette udmønter sig i en 5-års overlevelsesraten for ikke mere end 25%, i Europa [4]. De fleste gastrisk kræftpatienter har avancerede sygdom på diagnosetidspunktet for hvem den eneste mulighed for helbredelse er afhængig af fuldstændig kirurgisk fjernelse af tumoren, med omfattende lymfeknude dissektion, som kan suppleres med administration af neoadjuverende eller adjuverende kemoterapi [5]. Den vigtigste prognostiske faktor, der påvirker overlevelse samt behandling valg er TNM fase. Men et ekstra lag af kompleksitet stammer fra den observation, at patienter med den samme iscenesættelse viser ofte en anden klinisk udvikling, fremhæver heterogenitet af gastrisk kræft [6]. Dette antyder, at unikke iboende biologiske egenskaber af disse tumorer væsentligt kan påvirke deres aggressive potentiale. Derfor er der stadig et presserende behov for at opdage yderligere prognostiske biomarkører til at forudsige udfaldet mere præcist og som et resultat, at hjælpe med at gøre bedre informerede beslutninger behandling med hensyn til behandling. Som tumorer, der er mere differentierede generelt opføre sig på en mindre aggressiv måde, vi spørgsmålstegn ved relevansen af ​​to differentiering markører, SOX2 og CDX2, for den biologiske opførsel af gastrisk kræft. Disse markører udtrykkes forskelligt langs kæden af ​​begivenheder, der fører til gastrisk cancer og er tæt forbundet med gastrisk og intestinal differentiering henholdsvis [7].
CDX2 er en tarm-specifik homeobox transkriptionsfaktor, hvis funktion sikrer udvikling og vedligeholdelse af tarm differentiering i tarmen og ektopiske steder, som var godt etableret i dyremodeller [8, 9]. Det er almindeligt kendt, at CDX2 udtrykkes i human intestinal metaplasi af maven og spiserøret [10]. Det viste sig at være også til udtryk i dysplasi dermed styrke sin rolle som en biomarkør for progression i de præneoplastiske stadier af gastrisk carcinogenese [11].
SOX2 er medlem af SOX (SRY-beslægtet HMG Box) familie af transkriptionsfaktorer , der kodes af en stærkt bevaret, enkelt exon gen. SOX2 spiller forskellige roller i hele udviklingen og celledifferentiering første orkestrere det mammale embryogenese [12], og senere bidrager til den normale morfogenese og homeostase af fortarm-afledte epiteler af spiserøret, lunge og luftrør [13]. I voksenalderen, er SOX2 udtrykkes i en række væv, nemlig i pladeepitelet foring spiserør og kirtelepitel af maven. Det er blevet vist, i mus, at Sox2 ekspression bidrager til alle cellelinier, som normalt findes i maven, hvilket tyder et vigtigt bidrag til gastrisk differentiering [14]. Desuden har abnorm ekspression af SOX2 blevet observeret i tumorer i hjernen, bryst-, lunge- og spiserøret [15-17]. Men i mavens kræft kontekst, dens rolle forbliver gådefuldt og kræver yderligere afklaring [18-20]. Desuden dens samspil med CDX2 forbliver uudforsket.
Vores mål var at analysere den kliniske relevans af SOX2 og CDX2 udtryk i mavekræft biologi. De opnåede resultater viser, at deres udtryk i de primære tumorer har en relevant prognostisk værdi for mavecancerpatienter.
Metoder
Humane væv og DNA prøver
To hundrede og ét tilfælde af formalin-fikseret paraffinindlejret (FFPE ) prøver fra patienter med gastrisk adenocarcinom undergår kirurgi på Centro Hospitalar S. João, Porto, Portugal mellem 1988 og 2010 blev undersøgt. Sager udvalgte var dem med tilgængelige paraffinindlejret materiale, klinisk-patologisk og opfølgende data indhentet fra Patologi og kirurgiske afdelinger i Centro Hospitalar S. João. Fra disse blev syvogtresindstyve prøver tilvejebragt som et væv microarray (TMA), med 2 replikat kerner af hver prøve, fra tumoren og Tissue Biobank af samme Pathology Department. Tumor genomisk DNA (gDNA) blev opnået fra 62 sager optaget på TMA. gDNA blev også udvundet af FFPE prøver af to normale gastrisk slimhinderne ved hjælp af Genomisk DNA Purification Kit (Citomed, Lissabon, Portugal), og anvendt som kontroller. Alle prøver fra biobanken blev opnået med informeret samtykke fra patienterne. Brugen af ​​retrospektive prøver hvorfra informerede ikke kan opnås samtykke er godkendt til forskningsundersøgelser af den portugisiske lov. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Centro Hospitalar S. João.
Immunhistokemi
FFPE vævssnit med 4 um fra kirurgiske prøver og TMA blev udsat for immunhistokemi for SOX2, CDX2, MUC5AC og MUC2 efter standardmetoder. Kort fortalt, efter deparaffination og rehydrering, blev antigen-genvinding udført i en IHC-Tek epitopgenfinding Steamer Set (IHC World, Woodstock, MD, USA), i 40 minutter med 10 mM citratbuffer, pH 6,0 (CDX2) eller 10 mM, pH 8,0 EDTA (SOX2). Desialylering blev udført i MUC2 detektion, med 0,1 U /ml neuraminidase fra Clostridium perfringes
typen VI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i natriumacetatpuffer pH 5,5 i 2 timer ved 37 ° C. Endogen peroxidase blev blokeret med 3% hydrogenperoxid i methanol i 10 min. Inkubation med primære antistoffer til CDX2 (01:50 fortynding, CDX2-88 klon, Biogenex, San Ramon, CA, USA), MUC5AC (1:10 fortynding, CLH2 klon) og MUC2 (1:10 fortynding, PMH1 klon) blev udført natten over ved 4 ° C. Snit blev derefter inkuberet med et biotin-mærket kanin-anti-muse-sekundært antistof, efterfulgt af avidin /biotin-peroxidase detection system (Vectastain ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). For SOX2 farvning, blev inkubation med det primære antistof (1:50 fortynding SP76 klon, Cell Marque, havkvabbe, CA, USA) udført i 1 time ved stuetemperatur, og detektion blev udført ved hjælp af Dako REAL ™ Envision ™ Detection System Peroxidase /DAB + (DAKO, Glostrup, Danmark) ifølge producentens instruktioner. Påvisning af udtryk blev udført med 3,3'-diaminobenzidin (DAB) (Sigma, St. Louis, MO, USA) vævssnit blev modfarvet med Gills hæmatoxylin (Leica Microsystems, Amersham, Bucks, UK), dehydreret, præciseret og monteret. Normal maveslimhinden blev anvendt som en positiv kontrol for SOX2 og MUC5AC ekspression og normal colon mucosa blev anvendt som en positiv kontrol for CDX2 og MUC2 ekspression. Tilfælde blev betragtet som positive, når mere end 5% af cellerne blev farvet med hvert antistof med konsensus af tre observatører (VC, LD og RA).
Fluorescens in situ
hybridisering (FISH)
FISH blev anvendt til at vurdere SOX2
amplifikation status i 21 prøver under anvendelse af en 2-farve-assay som beskrevet af Bass et al
[17]. En probe der spænder over locus 3q26.33 (BAC klon CTD-2348H10) blev anvendt til bestemmelse SOX2
kopiantal og blev sammenlignet med en reference-probe hybridiserer til 3p22.3-3p22.2 (BAC klon RP11-286G5), købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Målet probe blev mærket med digoxigenin (DIG-11-UTP, Roche, Mannheim, Tyskland) og detekteret med et anti-digoxigenin-fluorescein-antistof (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland), og henvisningen proben blev mærket med biotin (BioPrime® DNA-mærkning System, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og detekteres med en CY 3-Avidin antistof (Jackson Immunoresearch Lab, West Grove, USA).
Fire um slides fra hver gastrisk adenocarcinom prøve blev deparaffinised, rehydreret og anbringes i en forvarmet opløsning af NaSCN 1M ved 80 ° C i 10 min. Prøver blev fordøjet med 6mg /ml pepsin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i HCl 0,02N, pH 2 i 30 min ved 37 ° C. Probe blandingen i 50% formamid i 2 x SSC blev codenatured med kerne-DNA ved 94 ° C i 3 min. Hybridisering blev udført i 30 timer ved 37 ° C. Kerner blev modfarvet med DAPI-Vectashield monterings opløsning (Vector, Burlingame, USA). For hvert tilfælde blev et minimum på 67 celler analyseret i et fluorescensmikroskop (Zeiss Z1 Axio) og billeder blev erhvervet med 1000 × forstørrelse, ved hjælp af en Zeiss Axio cam MRM og Axiovision Rel. 4.8 software. Forholdet mellem antallet af SOX2 og reference- probesignaler blev beregnet for hver celle individuelt og gennemsnittet af forholdene blev bestemt i hvert tilfælde. Genamplifikation blev betragtet, når gennemsnittet var ≥2.
Copy Number variation (CNV) Assays
CNV assay blev udført under anvendelse af en specifik TaqMan® Copy Number Assay (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) efter producentens anvisninger. Kort fortalt blev multiplex PCR'er til SOX2
(mål) og RNase P
(endogen kontrol) udført på en ABI Prism7500 Hurtig Real-time PCR-system ved hjælp af softwaren v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA ). Tyve nanogram af gDNA og en ikke-template-kontrol blev analyseret i fire eksemplarer. Normale maveslimhinden prøver blev anvendt som kalibratorer. Kvantificering af SOX2
genkopital blev udført under anvendelse af ΔΔCt fremgangsmåden og dataanalyse blev udført ved CopyCaller software v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Genamplifikation blev defineret når genkopiantallet var 2 gange større end den for den normale gastriske mucosa. Fold stigning mellem 1,5 og 2 blev anset kopi nummer gevinst.
Statistisk analyse
chi-square test blev anvendt til at vurdere betydningen af ​​forskelle i klinisk-patologiske karakteristika på tværs af kategorier af SOX2 og CDX2 udtryk, undtagen med alderen, hvor betydningen af ​​forskelle i midler blev beregnet ved hjælp af T
-test. Patienternes samlede overlevelse blev beregnet ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden og betydningen af ​​forskelle mellem rå overlevelseskurver blev testet ved log-rank test. Cox proportionel risiko model blev brugt til at beregne univariate og multivariate hazard ratio. Median opfølgning tid til overlevende patienter var 62 måneder. Den 5- og 10-årige overlevelsesrate blev estimeret ved hjælp af liv-tabellen metode. Forskelle blev anset for statistisk signifikant, når P Salg værdier var < 0,05. Analyser blev udført ved hjælp af SPSS software v21.0 (Chicago, IL, USA) og Stata v11 (College Station, TX, USA).
Resultater
SOX2 udtryk i gastriske carcinomer
klinisk-patologisk funktioner i 201 mavekræft sager, såvel som udtrykket profiler af SOX2, CDX2, MUC2 og MUC5AC er opsummeret i tabel 1. Nuclear SOX2 ekspression blev fundet i 52% (104/201) af gastriske carcinomer og ekspressionen var heterogene mellem og inden tumorerne (figur 1A, B og C). I 13% (18/134) af det tilfælde SOX2 udtryk var højere ved den invasive front (figur 1D og E) (denne evaluering blev kun udføres i tilfælde ikke inkluderet i TMA, hvor denne vurdering ikke var muligt) .table 1 Sammenfatning af de klinisk-patologiske parametre for mavekræft efter ekspression af SOX2 og CDX2
SOX2
CDX2
Negativ
Positiv


Negativ
Positiv Vejviser N
%
N
%

p
N
%
N
%
p
Age, år1
Middelværdi ± SD
65,8 ± 12,7
63,4 ± 13,5
0,2
64.1 ± 13,6
65,2 ± 12,6
0,6
Median (Range)
69 (34- 85)
66,5 (24-89)
69 (24-89)
67 (36-89)
Sex1
Mand
52
41,9
72
58,1
0.02
75
60,5
49
39,5
0.1
Female
45
58,4
32
41,6
38
49,4
39
50,6
TNM stage2
I /II
35
54,7
29
45,3
0,09
26
40,6
38
59,4
0.002
III /IV
59
44,7
73
55,3
83
62,9
49
37,1
T stage3
T1 /T2
22
62,9
13
37,1
0.03
13
37,1
22
62,9
0,007
T3 /T4
75
45,5
90
54,5
99
60,0
66
40,0
N stage1
n0
28
62,2
17
37,8
0.03
20
44,4
25
55,6
0,07
N +
69
44,2
87
55,8
93
59,6
63
40,4
Margins4
R0
85
47,5
94
52,5
0.5
98
54,7
81
45,3
0,2
R1
11
55,0
9
45,0
14
70,0
6
30,0
Vaskulær invasion4
Negativ
39
55,7
31
44,3
0.1
37
52,9
33
47,1
0,5
Positiv
57
44,2
72
55,8
75
58,1
54
41,9
Láuren5
Intestinal
44
49,4
45
50,6
0,9
45
50,6
44
49,4
0,3
Diffus
20
48.8
21
51,2
26
63,4
15
36,6
Uklassificeret
31
46,3
36
53.7
40
59,7
27
40,3
Ming6
Ekspansiv
32
53,3
28
46,7
0,5
28
46,7
32
53,3
0.1
infiltrativ
60
45,8
71
54,2
81
61,8
50
38,2
Uklassificeret
2
66,7
1
33,3
1
33,3
2
66,7
SOX21
Negativ
58
59.8
39
40,2
0,3
Positiv
55
52,9
49
47,1
CDX21
Negativ
58
51,3
55
48,7
0,3
Positiv
39
44,3
49
55,7
MUC5AC1
Negativ
39
44,8
48
55,2
0,4 ​​
42
48,3
45
51,7
0.05
Positiv
58
51,3
55
48,7
70
61,9
43
38,1
MUC21
Negativ
69
48,6
73
51,4
0,9
84
52,2
58
40,8
0.1
Positiv
27
48,2
29
51,8
26
46,4
30
53,6
1N = 201; 2N = 196; 3N = 200; 4N = 199; 5N = 197; 6N = 194.
Figur 1 SOX2 proteinekspression i gastriske carcinomer, påvist ved immunhistokemi. (A) Meget forskellige SOX2 udtryk i gastriske tumorer. Inden for samme tumor stikprøve områder med høje niveauer af SOX2 observeret (B) i umiddelbar nærhed af områder med lavere ekspressionsniveauer af SOX2 (C). (D, E) SOX2 udtryk ved den invasive forsiden af ​​tumorer.
Dernæst vi vurderet, om SOX2 udtryk korreleret med klinisk-patologiske træk af tilfældene. Denne analyse viste, at SOX2 udtryk var signifikant associeret med mandlige køn (p
= 0,02), med højere T etape (p
= 0,03) og med tilstedeværelse af regionale lymfeknudemetastaser (N etape) (p
= 0,03). De andre klinisk-patologiske parametre, som omfattede alder, TNM stadie, tumor clearance ved resektion marginer (R kategori), vaskulær invasion, Lauren klassificering og Ming klassificering blev ikke signifikant associeret med SOX2 udtryk (tabel 1).
Da SOX2 er forbundet med gastrisk differentiering [14] studerede vi, om dette blev opretholdt i cancer, ved anvendelse MUC5AC som en gastrisk markør. Imidlertid blev ingen sammenhæng fundet mellem SOX2 og MUC5AC udtryk. Ligeledes blev der ikke omvendt association findes mellem SOX2 og CDX2 /MUC2 (anvendt som markører for intestinal differentiering). Notatet blev CDX2 udtryk signifikant associeret med en lavere TNM stadie (p
= 0,002) og med en lavere T fase (p
= 0,007). Selv ikke statistisk signifikant, var der en tendens til et omvendt forhold mellem CDX2 og MUC5AC (p =
0,05).
Survival analyse
5-års overlevelsen, baseret på opfølgning af 199 patienter, var 35% (Yderligere fil 1: Figur S1). Vi næste observeret, at SOX2 ekspression i tumorerne var forbundet, i univariat analyse, med en samlet dårligere overlevelse (p
= 0,02), stratificere patienterne i to prognostiske grupper (figur 2A), med en overlevelse på 45 5-års % for patienter med SOX2- tumorer versus 26% for patienter med Sox2 + tumorer. Tværtimod CDX2 ekspression forbundet med en generelt forbedret overlevelse, selv om forskellen ikke nåede signifikans (data ikke vist). Figur 2 Kaplan-Meier-kurver, der viser sandsynligheden for samlet overlevelse for patienter med gastrisk cancer ifølge SOX2 ekspression (A) og i henhold til den molekylære fænotyper SOX2 - /CDX2 + og SOX2 + /CDX2 - (B).
Baseret på sammenslutningen af ​​SOX2 og CDX2 med værre og bedre overlevelse samt flere og mindre aggressive klinisk-patologiske træk, henholdsvis vi yderligere undersøgt patienternes udfald i henhold til de molekylære fænotyper defineret af begge proteiner. Fire grupper af patienter kan defineres (Yderligere fil 1: Figur S2), hvoraf den ene med den bedste overlevelse havde tumorer negative for SOX2 og positive for CDX2 (SOX2- /CDX2 +), mens overlevelsen var den laveste i patienter huser tumorer med den omvendte profil, positiv for SOX2 og negativ for CDX2 (SOX2 + /CDX2-) (p
= 0,01) (Ekstra fil 1: Figur S2 og figur 2B). Sagerne med udtryk for både SOX2 og CDX2 eller uden udtryk for enten markør udviste en lignende og mellemliggende overlevelse (Yderligere fil 1: Figur S2). Den SOX2- /CDX2 + og Sox2 + /CDX2- molekylære fænotyper, sammenlignet med SOX2 alene, forudser meget lignende overlevelsesrater ved 5-år (49% vs 26% og 45% vs 26%, henholdsvis). Men det forudsagte 10-års overlevelse baseret på SOX2 udtryk alene er 34% (SOX2-) vs 22% (SOX2 +) henviser til, at anvendelse af de molekylære fænotyper SOX2 /CDX2, bliver det 41% (SOX2- /CDX2 +) vs. 14% (SOX2 + /CDX2-).
Vi udforskes indvirkning på patienternes overlevelse af de molekylære fænotyper defineret af SOX2 + vs SOX2-, CDX2 + vs CDX2- og SOX2- /CDX2 yderligere + versus SOX2 + /CDX2- stratificeret efter klinisk-patologiske parametre. I dette tilfælde, plotte overlevelse i henhold til enten SOX2 eller CDX2 status alene givet betydelige prognostiske forskelle for det tidligere, i nogle af de parametre (tarm- og udvide-type tumorer), og ingen forskelle for CDX2 alene (Yderligere fil 1: Tal S3 og S4). Resultater fra Cox proportional model præsenteres i supplerende fil 1: Tabel S1. Endnu engang, anvendelsen af ​​den kombinerede ekspression af SOX2 og CDX2 raffinerede de tidligere resultater (figur 3). SOX2 + /CDX2 - profil forudsagde en betydeligt dårligere resultat af patienter med tarm (p
= 0,005) og udvide (p
= 0,002) tumorer, med hazard ratio på 3,18 og 4,84, henholdsvis , og af dem uden tegn på venøs invasion (p
= 0,009), præsentere en hazard ratio på 3,84. Selvom borderline ikke-signifikant, blev en lignende tendens i patienter uden lymfeknudemetastaser (p
= 0,08) (Figur 3). Hazard ratio og 95% konfidensintervaller for alle grupper er vist i detaljer i tabel 2 og forbliver signifikant efter justering for alder og køn i en multivariat analyse. Figur 3 Kaplan-Meier kurver viser sandsynligheden for samlet overlevelse for patienter med mavekræft i henhold til den molekylære fænotyper SOX2 - /CDX2 + og SOX2 + /CDX2 - stratificeret efter klinisk-patologiske parametre: Lauren klassifikation (A), Ming klassifikation (B) , venøs invasion (C) og lymfeknudemetastaser (D).
Tabel 2 Cox proportionel risiko modeller af overlevelse som funktion af de molekylære fænotyper (SOX2 + /CDX2- vs SOX2- /CDX2 +) for hver klinisk-patologisk parameter
Parameter
Hazard ratio (95% CI) Vejviser
der ikke justeres
P
Adjusteda
P

Samlet
1,95 (1,15-3,31)
0,01
1,90 (1,10-3,28)
0,02
Lauren klassifikation
Intestinal-typen
3,18 (1,33-7,58)
0,009
2,93 (1,21-7,10)
0,02
diffus-typen
1,35 (0,35-5,17)
0,7
Uklassificeret
1,34 (0,60-3,02)
0,5
Ming klassifikation
Udvidelse
4,84 (1,64-14,29)
0,004
4,53 (1,29-15,85)
0,02
infiltrativ
1,13 (0,60-2,13)
0.7
Vaskulær invasion
Negativ
3,84 (1,30-11,35)
0,02
3,82 (1,29-11,40)
0,02
Positiv
1,10 (0.60- 2.02)
0.8
N etape
n0
2,96 (0,82-10,65)
0,1
3,98 (0,72-21,83)
0,1
N +
1,29 ( 0,72-2,30)
0,4 ​​
Forkortelse: CI
konfidensinterval
en Justeret for alder og køn (Multivariate analyse ved hjælp af Cox-regressionsmodel)
SOX2 forstærkning
betragtning af, at genet.. amplifikation er et tumorspecifikt hændelse under malign transformation, og at SOX2 locus underkastes denne ændring i andre tumorer, nemlig af lungen og spiserøret [17], vi den hypotese, at SOX2 amplifikation kunne forklare dets ekspression og heterogenitet, både inden for og blandt gastriske tumorer. Støtte denne hypotese, en undersøgelse udført på Oncomine database viste, at SOX2 rangeret blandt de øverste 10% gener med kopi nummer gevinster i gastrisk cancer (Yderligere fil 1: Figur S5).
Baseret på immunhistokemiske data, valgte vi 14 sager med SOX2 udtryk og 7 negative sager for at analysere med 2-farve FISH-analysen. Vi observerede, at SOX2 blev forstærket i 14% (2/14) af tilfældene med udtryk og i ingen af ​​tilfældene uden udtryk (0/7). Et repræsentativt positivt tilfælde både SOX2 ekspression og amplifikation er vist i figur 4A og B. Et tilfælde med SOX2 ekspression men ingen amplifikation er vist i figur 4C og D. Desuden FISH-analyse viste tilstedeværelsen af ​​en høj grad af kopital gevinst og heterogenitet inden tumorer, observeret ikke kun med mål sonde til SOX2
locus, men også med henvisning sonde, placeret til 3p arm (Yderligere fil 1: Figur S6). Figur 4 mavekræft tilfælde med SOX2 proteinekspression (A og C) kan præsentere med eller uden SOX2 forstærkning (B og D) bestemmes ved FISH. Green mærkede prober målrette SOX2
, mens røde mærkede prober målrette 3p arm. Kerner farves med DAPI (blå). (E) Sixty-to gDNA gastrisk cancer prøver blev vurderet for SOX2 kopital status og sammenlignet med normal gastrisk mucosa (kalibrator). (F) SOX2 kopi nummer var signifikant associeret med protein-ekspression, bestemt af IHC (p
< 0,05).
At tydeliggøre hyppigheden af ​​SOX2
locus kopital ændringer i mavekræft, vi udførte en kopi -antal PCR ved hjælp gDNA fra 62 gastriske kræfttilfælde, ved hjælp af en RNAse P
sonde placeret i kromosom 14 som reference. Størstedelen af ​​prøverne (93%) præsenteret en vis SOX2
kopiantallet variation, der spænder fra 3 til 9 kopier (Figur 4E). En signifikant positiv sammenhæng mellem kopi nummer gevinst og SOX2 udtryk (p
< 0,05). Blev observeret (figur 4F)
Diskussion
Gastrisk kræft er en sygdom med flere resultater, der ikke kan forudsiges ved klinisk-patologiske træk alene [6]. Derfor identifikation af molekylære biomarkører, der kan give yderligere udfald lagdeling og behandling beslutninger er af afgørende betydning.
I denne undersøgelse vi karakteriseret udtryk for transskription faktor SOX2 i mavekræft og relaterede det med klinisk-patologiske funktioner og differentiering markører nemlig MUC5AC (gastrisk markør) og CDX2 og MUC2 (intestinale markører). Dette førte til identifikation af to forskellige prognostiske grupper, baseret på SOX2 udtryk, som kunne yderligere raffineres ved at tage hensyn til den kombinerede udtryk med CDX2. Endelig har vi unraveled heterogenitet SOX2
locus og kromosom 3 eksemplar nummer i gastrisk kræft, viser en sammenhæng mellem øget kopi nummer og SOX2 proteinekspression.
Et centralt resultat af denne undersøgelse var den iagttagelse, at SOX2 udtryk alene, og yderligere forfinet af kombinationen med CDX2, tillader lagdeling af patienter i undergrupper med markant forskellige kliniske resultater. Desuden, når vi kombinerede disse molekylære profiler med klinisk-patologiske data, blev det klart, at SOX2 + /CDX2 - profil forbundet med en dårligere prognose, inden delmængder af tumorer, der generelt har en bedre prognose: tarm-type , udvide-type og uden tegn på venøs invasion [21, 22]. Selvom det ikke er statistisk signifikant, blev den samme tendens observeret for tumorer frembyder uden lymfeknudemetastaser. Disse molekylære profiler indikerer en anden biologisk opførsel af tumoren mest sandsynligt skyldes sygdomsprogression eller behandling modstand og kan anvendes til at instruere mere effektiv terapi eller opfølgning tidsplaner.
Især som lymfeknudemetastaser er en af ​​de største risiko faktorer for gastrisk cancer tilbagefald, efter at en R0 kirurgi, alle patienter lymfeknudemetastaser modtager adjuverende behandling [23]. vores resultater viser dog, at patienter uden denne risikofaktor, og derfor ikke behandles, kendetegnet ved en kraftig dårligere resultat, når tumoren præsenterer med en SOX2 + /CDX2 - molekylær profil. Dette fremsætter den hypotese, at der inden N0 tumorer, patienter inden for dette molekylære undergruppe ville sandsynligvis drage fordel af adjuverende behandling. Ikke desto mindre er disse observationer kræver validering i større kohorter, og det ville også være meget informativ at tilføje klinisk information vedrørende patientbehandling.
SOX2 også fremstår som et potentielt mål for nye terapeutiske interventioner. Selvom transkriptionsfaktorer er ikke klassiske drug targets, tilgange til SOX2 målrettet terapi bliver allerede behandlet i brystkræft. I en nylig undersøgelse blev SOX2
gen selektivt målrettet hjælp zink-finger-baserede kunstige transkriptionsfaktorer tilgang, hvilket resulterer i meget specifikke, potent og langtidsholdbare nedregulering, omsætte til en svækket tumorgenicitet, både in vitro
Figur S3. Tabel S1.

• Glutathion S-transferase genet GSTM1, gen-gen-interaktion, og mavekræft modtagelighed: dokumentation fra en opdateret meta-analysis
• Et pust af frisk luft: en kvalitet forbedring undersøgelse, der sammenligner en luft-cirkulerende teknik versus konventionel teknik til at forhindre nasogastrisk rør dysfunction