Immunohistokemiallinen molekyyli fenotyyppejä mahasyövän perustuu Sox2 ja CDX2 ennustaa potilaiden hoitotuloksiin

Immunohistokemiallinen molekyyli fenotyyppejä mahasyövän perustuu Sox2 ja CDX2 ennustaa potilaiden hoitotuloksiin
tiivistelmä
tausta
Mahasyöpää edelleen vakava terveysongelma maailmanlaajuisesti. Potilaat hyötyisi suuresti löytämään uusia biomarkkereita, jotka ennustavat tulos tarkemmin ja mahdollistaa tehokkaamman hoidon ja seurannan päätöksiä. Tässä käytimme retrospektiivinen, havainnointitutkimuksen arvioida ilmaisun ja ennusteen arvioinnissa transkriptiofaktoreiden Sox2 ja CDX2 mahasyövän. Tool Menetelmät
Sox2, CDX2, MUC5AC ja MUC2 ilmaisun arvioitiin 201 mahalaukun kasvaimet immunohistokemiallisesti . Sox2 ja CDX2 ilme oli risteytettiin kliinis ja seurantatietoja määrittää niiden vaikutus kasvaimen käyttäytymisen ja lopputuloksen. Lisäksi Sox2
locus kopioluku tila arvioitiin FISH (N = 21) ja Kopioi numero vaihtelu Pitoisuus (N = 62).
Tulokset
Sox2 ilmaistiin 52% mahalaukun kasvaimet ja oli merkitsevästi liittyvä miessukupuoli, T vaihe ja N vaiheessa. Lisäksi Sox2 ilmaisu ennustaa huonompi potilaan selviytymistä, ja yhdessä CDX2 määritelty kaksi molekyyli fenotyyppiä, Sox2 + CDX2 - versus Sox2 -CDX2 +, jotka ennustavat huonoin ja paras pitkän termi potilaiden lopputulokseen. Nämä profiilit yhdistetään kliinis parametrien osittaa ennusteen potilaiden suoliston ja laajentamalla kasvaimia ja niissä ilman merkkejä laskimoiden hyökkäystä. Lopuksi Sox2
locus kopiomäärä voitot todettiin 93% näytteistä saavuttaa vahvistus kynnys 14% ja merkittävästi liittämällä proteiinin ilmentymisen.
Johtopäätökset
Osoitimme, ensimmäistä kertaa, että Sox2 yhdistettynä jossa CDX2 mentymisprofiili mahasyövän eristää potilaita eri ennustetekijöiden ryhmiin, täydentävät kliinis tiedot. Olemme lisäksi osoittaa molekyylimekanismiksi Sox2 ilmentymisen osajoukko mahalaukun syöpätapausta.
Avainsanat
Sox2 CDX2 Mahasyöpää ennuste Survival tausta
Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmin diagnosoitu syöpien ja nyt kolmanneksi yleisin syy syöpään liittyvistä kuolemantapauksista maailmassa [1]. Laurén luokitus jakaa mahasyövän kahteen pääosaan histologisia tyyppejä: suoliston ja hajanainen [2]. He esittävät erillisiä morfologiset, kliinisiä ja epidemiologisia ominaisuuksia ja uskotaan kehittyä aktivoitumisesta riippumattomien molekyylitason mekanismeja. Epidemiologiset tiedot osoittavat, että useimmissa tapauksissa, mahalaukun syöpä ei synny de novo
normaalista mahalaukun epiteelin, vaan johtuu monivaiheinen prosessi, peräkkäisillä geneettisiä ja epigeneettisiä muutoksia useiden geenien. Toisin kuin hajanainen tyyppi, jolle altistavia vauriot eivät ole vakiintunut, peräkkäin johtavien tapahtumien mahasyövän suolen tyyppiä on kuvattu hyvin. Mukaan Correa n kaskadi, se kehittää vaiheittain, yleensä vireille tulehduksellinen prosessi laukaisee Helicobacter pylori
, joka voi johtaa Multifokaalisen atrofinen gastriitti, suoliston metaplasiaa (IM), dysplasia ja lopulta adenokarsinooma [3].
vaikka on ollut jatkuva väheneminen mahasyövän esiintyvyys maailmanlaajuisesti, laajentamista ja ikääntyminen maailman väestöstä ennustaa kasvu tapausten määrä ja huolimatta viimeisimmästä kehityksestä diagnosoinnissa ja hoidossa, ennuste mahasyöpäpotilaista jäännökset huono. Tämä merkitsee 5 vuoden pysyvyys on enintään 25%, Euroopassa [4]. Useimmat mahasyöpäpotilaista on edennyt tauti diagnoosin joille ainoa vaihtoehto parannuskeinoa tukeutuu täydellinen kirurginen poisto kasvain, joilla on laaja imusolmuke leikkelyn voidaan täydentää antamalla neoadjuvant tai adjuvanttihoitoa [5]. Tärkein ennustetekijä vaikuttavat selviytymisen sekä hoidon valinta on TNM vaiheessa. Kuitenkin lisäkerros monimutkaisuus johtuu havainto, että potilaat, joilla on sama lavastus on usein erilainen kliininen kehitys, korostaen heterogeenisyys mahasyövän [6]. Tämä viittaa siihen, että ainutlaatuinen sisäisten biologisten ominaisuuksien näistä kasvaimista saattavat vaikuttaa merkittävästi niiden aggressiivista potentiaalia. Siksi on edelleen olemassa pakottava tarve löytää uusia prognostisia biomarkkerit ennustaa lopputulosta tarkemmin ja sen seurauksena, auttaa tehdä parempia hoitopäätöksiä suhteen hoidon. Koska kasvaimet, joiden enemmän eriytetty yleensä käyttäytyvät vähemmän aggressiivista tavalla, me kyseenalaiseksi merkitystä kahden erilaistumisen markkereita, Sox2 ja CDX2, biologisen käyttäytymisen mahasyövistä. Näitä markkereita ilmentyvät eri ketjussa tapahtumia, jotka johtavat syöpään ja liittyvät läheisesti mahalaukun ja suoliston erilaistumista, vastaavasti [7].
CDX2 on suoli-spesifinen homeobox transkriptiotekijä, jonka toiminta takaa kehittäminen ja ylläpito suoliston eriyttäminen suolistossa ja kohdunulkoinen sivustoja, joka oli hyvin vakiintunut eläinmalleissa [8, 9]. On yleisesti tunnettua, että CDX2 ilmentyy ihmisen suoliston metaplasia mahalaukun ja ruokatorven [10]. Sen osoitettiin myös ilmaistava dysplasia mikä vahvistaa rooliaan biomarkkeri progression esineoplastiset vaiheissa mahasyövän [11].
Sox2 on jäsenenä SOX (SRY liittyvä HMG Box) perheen transkriptiotekijöitä , koodaa erittäin hyvin säilynyt, yhden eksonin geeni. Sox2: lla erilaisia ​​rooleja koko kehityksen ja solujen erilaistumista, ensimmäinen orchestrating nisäkkään sikiönkehityksen [12], ja myöhemmin edistää normaalia morfogeneesiä ja homeostaasin foregut johdettu epiteelin ja ruokatorven, keuhkojen ja henkitorven [13]. Aikuisiässä, Sox2 ilmentyy erilaisissa kudoksissa, nimittäin levyepiteeli vuori ruokatorven ja rauhasepiteelin vatsaan. On osoitettu, hiirillä, jotka Sox2 ilmentyminen edistää kaikkien solulinjojen yleensä löytyy vatsassa, mikä viittaa tärkeä merkitys mahalaukun erilaistumista [14]. Lisäksi, epänormaali ilmentyminen Sox2 on havaittu kasvaimia aivoissa, rinta-, keuhko- ja ruokatorven [15-17]. Kuitenkin mahasyövän yhteydessä sen rooli on edelleen hämmentävä ja on selkeytettävä [18-20]. Lisäksi sen vuorovaikutus CDX2 edelleen tutkimatta.
Tavoitteenamme oli analysoida kliinistä merkitystä Sox2 ja CDX2 ilmaisun mahasyövässä biologiassa. Saadut tulokset osoittavat, että niiden ekspressio primäärikasvaimissa on merkitystä prognostinen arvo mahasyöpäpotilaista.
Menetelmät
Ihmiskudokset ja DNA-näytteitä
Kaksisataa ja yksi tapauksissa formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE ) näytteet mahalaukun adenokarsinoomaa sairastavien potilaiden leikkaukseen Centro Hospitalar S. João, Porton vuosien 1988 ja 2010 tutkittiin. Tapaukset valitaan olivat ne, joilla on käytettävissä parafinoidut materiaalia, kliinis ja seuranta saadut tiedot patologian ja kirurgiset osastot Centro Hospitalar S. João. Noista, kuusikymmentäseitsemän näytteet tarjotaan kudos microarray (TMA), jossa on 2 rinnakkaista ydintä kunkin näytteen, kasvain ja Tissue Biopankkiverkosto saman patologian osaston. Kasvaimen genominen DNA (gDNA) saatiin 62 tapauksissa mukana TMA. gDNA myös uutettu FFPE näytteistä kaksi normaalia mahalaukun mucosas käyttäen Genominen DNA Purification Kit (Citomed, Lissabon, Portugali), ja käytettiin kontrolleina. Kaikki näytteet Biopankkiverkosto saatiin tietoisen suostumuksen potilailta. Käyttö retrospektiivinen näytteitä, joista suostumus ei voida saada lupa soveltaa tutkimuksia Portugalin lakia. Tutkimus hyväksyi eettinen komitea Centro Hospitalar S. João.
Immunohistokemia
FFPE kudosleikkeiden kanssa 4 pm kirurgisista näytteistä ja TMA altistettiin immunohistokemiaallisesti Sox2, CDX2, MUC5AC ja MUC2, seuraavan standardin menetelmiä. Lyhyesti, sen jälkeen, kun parafiini ja nesteytys, antigeeni haku suoritettiin IHC-Tek Epitooppi Retrieval höyrystin Set (IHC World, Woodstock, MD, USA), 40 minuutin ajan 10 mM sitraattipuskurilla, pH 6,0 (CDX2) tai 10 mM, pH 8.0 EDTA (Sox2). Desialyloinnin suoritettiin MUC2 havaitsemiseksi, 0,1 U /ml neuraminidaasi peräisin Clostridium perfringens
tyyppi VI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) natrium- asetaattipuskuria, pH 5,5 2 h 37 ° C: ssa. Endogeeninen peroksidaasi estettiin 3% vetyperoksidia metanolissa 10 min. Inkuboinnin primaarisilla vasta-aineilla ja CDX2 (1:50 laimennos, CDX2-88 klooni, Biogenex, San Ramon, CA, USA), MUC5AC (1:10 laimennos, CLH2 klooni) ja MUC2 (1:10 laimennos, PMH1 klooni) suoritettiin yön yli 4 ° C: ssa. Sitten leikkeitä inkuboitiin biotiinilla leimatun kanin anti-hiiri-vasta-aineella, jonka jälkeen avidiini /biotiini-peroksidaasi-tunnistusjärjestelmä (Vectastain ABC-kitti, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Sillä Sox2 värjäystä inkuboimalla primaarisen vasta-aineen (1:50 laimennos, SP76-klooni, Cell Marque, Rockling, CA, USA) suoritettiin 1 tunti huoneenlämpötilassa, ja havaitseminen suoritettiin käyttäen Dako REAL ™ Envision ™ Detection System Peroxidase /DAB + (DAKO, Glostrup, Tanska) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Detection ilmaisun suoritettiin 3,3'-diaminobentsidiini (DAB) (Sigma, St. Louis, MO, USA) kudosleikkeiden vastavärjättiin Gillin hematoksyliinillä (Leica Microsystems, Amersham, Bucks, UK), kuivattu, selkeytettävä ja asennettu. Normaali mahan limakalvon käytettiin positiivisena kontrollina Sox2 ja MUC5AC: n ekspressio, ja on normaalia koolonin limakalvoa käytettiin positiivisena kontrollina CDX2 ja MUC2 ilmaisun. Tapauksissa pidettiin positiivisina, kun yli 5% soluista värjättiin vasta-aineen kukin konsensus kolme tarkkailijaa (VC, LD ja RA).
Fluoresenssi in situ
hybridisaatio (FISH) B-FISH käytettiin arvioida Sox2
vahvistus tilaansa 21 näytettä, käyttäen 2-väri määrityksessä kuvanneet Bass et al
[17]. Koetin ulottuen lokuksen 3q26.33 (BAC klooni CTD-2348H10) käytettiin määrittämään Sox2
kopioiden määrä ja verrattiin viittauksella koetin hybridisoituu 3p22.3-3p22.2 (BAC klooni RP11-286G5), ostettu Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Tavoite koetin leimattiin digoksigeniini (DIG-11-UTP, Roche, Mannheim, Saksa) ja havaittiin anti-digoksigeniiniperoksidaasia fluoreseiini-ainetta (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Saksa) ja viite koetin leimattiin biotiinilla (BioPrime® DNA merkintäjärjestelmä, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja tunnistettiin CY 3-Avidin vasta-aineella (Jackson Immuno- Lab, West Grove, USA).
Neljä pm diat kustakin mahalaukun adenokarsinooman näytteestä deparaffinised, vedettömät ja sijoitetaan esilämmitettyyn liuokseen, jossa NaSCN 1M 80 ° C: ssa 10 min. Näytteet pilkottiin 6 mg /ml pepsiiniä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) HCl: 0,02 N, pH-arvoon 2 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Probe seos 50% formamidi 2 x SSC oli codenatured kanssa tuman DNA 94 ° C: ssa 3 min. Hybridisaatio suoritettiin 30 tuntia 37 ° C: ssa. Tumat vastavärjättiin DAPI-Vectashield asennusratkaisu (Vector, Burlingame, USA). Kullekin tapauksessa vähintään 67 solua analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla (Zeiss Z1 Axio) ja kuvat oli hankittu 1000-kertainen suurennus, käyttäen Zeiss Axio nokka MRM ja Axiovision Rel. 4.8 ohjelmisto. Välinen suhde määrää Sox2 ja viite koetin signaalit laskettiin jokaiselle solun erikseen ja suhteiden keskiarvo määritettiin kussakin tapauksessa. Geenin monistuminen pidettiin aina keskiarvo oli ≥2.
Kopioi numero vaihtelu (CNV) määritykset
CNV Määritys suoritettiin käyttämällä erityistä TaqMan® kopiomäärän määritys (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sen jälkeen, kun valmistajan ohjeita. Lyhyesti, multiplex PCR: ää varten Sox2
(kohde) ja RNAasi P
(endogeeninen kontrolli) tehtiin ABI Prism7500 Fast Reaaliaikainen PCR-järjestelmän avulla ohjelmisto v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA ). Kaksikymmentä nanogrammaa gDNA ja ei-mallin ohjaus analysoitiin neljänä kappaleena. Normaali mahan limakalvon näytteitä käytettiin kalibraattorit. Kvantifiointi Sox2
geenin kopioluku tehtiin käyttäen ΔΔCt menetelmää ja data-analyysin suoritti CopyCaller ohjelmisto v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Geenin monistuminen on määriteltävä aina, kun geenin kopioluku oli 2 kertaa suurempi kuin normaali mahan limakalvon. Kertaiseksi 1,5 2 katsottiin kopio vahvistuksenkertojan.
Tilastollinen analyysi
Khin neliö testiä käytettiin merkityksen arvioimiseksi erojen kliinis erityispiirteet eri puolilla luokat Sox2 ja CDX2 ilme, paitsi iän, jossa merkityksen erojen avulla laskettiin T
-testissä. Potilaiden eloonjäämiseen laskettiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmä ja merkitys eroista raakaa eloonjäämiskäyrien testattiin log-rank-testi. Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin laskemiseen yhden ja usean riskisuhteita. Mediaani seuranta-ajan elossa olevien potilaiden määrä oli 62 kuukautta. 5- ja 10-vuoden pysyvyys arvioitiin käyttäen elämän pöydän menetelmällä. Erot katsottiin tilastollinen merkittävä aina, kun p
arvot olivat < 0,05. Analyysit tehtiin SPSS ohjelmistoa v21.0 (Chicago, IL, USA) ja Stata v11 (College Station, TX, USA).
Tulokset
Sox2 ilmaisun mahakarsinoomat
kliinis piirteet 201 mahasyövän tapauksissa, samoin kuin ilmaisu profiilit Sox2, CDX2, MUC2 ja MUC5AC on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. Nuclear Sox2 ekspressio havaittiin 52% (104/201) ja mahakarsinoomat ja ekspressio oli heterogeeninen välillä ja niiden sisällä kasvaimia (kuvio 1A, B ja C). 13% (18/134) tapauksista Sox2 ilmaisu oli suurempi leviämisrintamassa (kuvio 1 D ja E) (tämä arviointi suoritettiin ainoastaan ​​tapauksissa, joita ei sisälly TMA, jossa tämä arviointi ei ollut mahdollista) .table 1 Yhteenveto n kliinis parametrien mahasyövän mukaan ilmaus Sox2 ja CDX2
Sox2
CDX2
Negative
Positiivinen


Negative
Positiivinen
N
%
N
%

p
N
%
N
%
p
Ikä, vuotta1
keskiarvona ± SD
65,8 ± 12,7
63,4 ± 13,5
0,2
64,1 ± 13,6
65,2 ± 12,6
0,6
mediaani (vaihteluväli)
69 (34- 85)
66,5 (24-89)
69 (24-89)
67 (36-89) B Sex1
Mies
52
41,9
72
58.1
0,02
75
60,5
49
39,5
0,1
Female
45
58,4
32
41,6
38
49,4
39
50,6
TNM stage2
I /II
35
54,7
29
45,3
0,09
26
40,6
38
59,4
0,002
III /IV
59
44,7
73
55,3
83
62,9
49
37,1
T stage3
T1 /T2
22
62,9
13
37,1
0,03
13
37,1
22
62,9
0,007
T3 /T4
75
45,5
90
54,5
99
60,0
66
40,0
N Stage1
N0
28
62,2
17
37,8
0,03
20
44,4
25
55,6
0,07
N +
69
44,2
87
55,8
93
59,6
63
40,4
Margins4
R0
85
47,5
94
52,5
0,5
98
54,7
81
45,3
0,2
R1
11
55,0
9
45,0
14
70.0
6
30,0
Vascular invasion4
Negative
39
55,7
31
44,3
0,1
37
52,9
33
47,1
0,5
Positiivinen
57
44,2
72
55,8
75
58,1
54
41,9
Láuren5
Suoliston
44
49,4
45
50,6
0,9
45
50,6
44
49,4
0,3
Diffuusi
20
48.8
21
51,2
26
63,4
15
36,6
Unclassified
31
46,3
36
53,7
40
59,7
27
40,3
Ming6
Laaja
32
53,3
28
46,7
0,5
28
46.7
32
53,3
0,1
Infiltrative
60
45,8
71
54,2
81
61,8
50
38,2
Luokittelematon
2
66,7
1
33,3
1
33,3
2
66,7
SOX21
Negative
58
59,8
39
40,2
0,3
Positiivinen
55
52,9
49
47,1
CDX21
Negative
58
51,3
55
48,7
0,3
Positiivinen
39
44,3
49
55,7
MUC5AC1
Negative
39
44,8
48
55,2
0,4 ​​
42
48,3
45
51,7
0,05
Positiivinen
58
51,3
55
48,7
70
61,9
43
38,1
MUC21
Negative
69
48,6
73
51,4
0,9
84
52,2
58
40,8
0,1
Positiivinen
27
48,2
29
51,8
26
46,4
30
53,6
1N = 201; 2N = 196; 3N = 200; 4N = 199; 5N = 197; 6 N = 194.
Kuvio 1 Sox2 proteiinin ilmentymistä mahakarsinoomat, havaitaan immunohistokemiallisesti. (A) heterogeenisyys Sox2 ilmaisun mahalaukun kasvaimet. Samassa kasvain näytteestä, alueet, joilla on korkea Sox2 havaitaan (B) lähellä ovat matalampia ekspressiotasot Sox2 (C). (D, E) Sox2 lauseke leviämisrintamassa kasvaimia.
Seuraavaksi arvioi Sox2 ilmaisu korreloi kliinis-tapauksista. Tämä analyysi paljasti, että Sox2 ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä miessukupuoli (p
= 0,02), korkeammat T vaiheessa (p
= 0,03) sekä läsnäolo alueellisten imusolmukemetastaaseja (N vaihe) (p
= 0,03). Toinen kliinis parametrit, jotka sisältyvät ikä, TNM vaiheessa kasvain välys resektio marginaalit (R luokka), verisuonten invaasio, Laurén luokittelu ja Ming luokittelu ei merkittävästi liittynyt Sox2 ilme (taulukko 1).
Koska Sox2 liittyy mahalaukun eriyttäminen [14] olemme tutkineet, onko tämä ylläpidettiin syöpään käyttäen MUC5AC kuten mahalaukun merkki. Ei kuitenkaan assosioitunut Sox2 ja MUC5AC ilme. Samoin ei käänteinen assosioitunut Sox2 ja CDX2 /MUC2 (markkereina käytettyjen suoliston erilaistumisen). Huomattavaa on, että CDX2 ilmentyminen merkitsevästi liittyä pienempi TNM (p
= 0,002) ja alempi T vaiheessa (p
= 0,007). Lisäksi vaikka ei ole tilastollisesti merkitsevä, oli suuntaus käänteinen suhde CDX2 ja MUC5AC (p =
0,05).
Survival analyysi
5 vuoden kokonaiselinaika, joka perustuu seuranta 199 potilasta, oli 35% (Additional tiedosto 1: Kuva S1). Seuraavaksi me havaittu, että Sox2 ilmentyminen kasvaimissa liittyi vuonna yhden muuttujan analyysiin, jossa yleinen huonompi eloonjäämisen (p
= 0,02), kerrostetaan potilaat kahteen ennustetekijöitä ryhmään (kuvio 2A), jossa on 5-vuoden pysyvyys 45 % potilailla, joilla SOX2- kasvaimia vs. 26% potilailla, joilla Sox2 + kasvaimia. Päinvastoin, CDX2 ilmentyminen liittyy kokonaisuudessaan parantunut eloonjääminen, vaikka ero ei saavuttanut merkitsevyyttä (tuloksia ei ole esitetty). Kuvio 2 Kaplan-Meier käyrät osoittavat todennäköisyyden yleinen potilaiden elinaikaa mahalaukun syöpä mukaan Sox2 lauseke (A) mukaisesti ja molekyylitason fenotyypit Sox2 - /CDX2 + ja Sox2 + /CDX2 - (B).
Perustuen yhdistyksen Sox2 ja CDX2 kanssa huonompi ja parempi eloonjääminen sekä enemmän ja vähemmän aggressiivisia kliinis vastaavasti me edelleen tutkittiin potilaiden tuloksen mukaan molekyylitasolla fenotyypit määritelty molemmat proteiinit. Neljä potilasryhmissä voitaisiin määritellä (Additional tiedosto 1: Kuva S2), joista yksi parhaista selviytymisen oli kasvaimia negatiivisia Sox2 ja positiivisia CDX2 (SOX2- /CDX2 +), kun taas elinaika oli alhaisin potilailla kätkeminen kasvaimissa käänteinen profiilin, positiivinen Sox2 ja negatiivisia CDX2 (Sox2 + /CDX2-) (p
= 0,01) (Additional tiedosto 1: Kuva S2 ja kuvio 2B). Tapaukset, joissa ilmentyminen sekä Sox2 ja CDX2 tai ilman ilmentymistä joko merkki näytteillä samanlainen ja väli- eloonjäämisen (Additional tiedosto 1: Kuva S2). SOX2- /CDX2 + ja Sox2 + /CDX2- molekyyli fenotyyppejä verrattuna Sox2 yksin, ennustaa hyvin samanlainen eloonjäämisluvut 5-vuotta (49% vs 26% ja 45% vs 26%, tässä järjestyksessä). Kuitenkin ennustettu 10 vuoden pysyvyys perustuu Sox2 ilmaisu yksin on 34% (SOX2-) vs 22% (Sox2 +), kun taas käyttämällä Sox2 /CDX2 molekyyli fenotyyppejä, siitä tulee 41% (SOX2- /CDX2 +) vs 14% (Sox2 + /CDX2-).
Me edelleen tutkineet vaikutusta potilaiden selviytymisen molekyyli fenotyyppien määritelty Sox2 + vs SOX2-, CDX2 + vs CDX2- ja SOX2- /CDX2 + versus Sox2 + /CDX2- ryhmiteltynä kliinis parametreja. Tällöin piirtämistä selviytymisen mukaan joko Sox2 tai CDX2 tila yksinään tuottivat merkittäviä ennustetekijöitä eroja entisen, joidenkin parametrien (intestinal- ja laajentamalla-tyypin kasvaimet) eikä erot CDX2 yksin (Additional tiedosto 1: Kuviot S3 ja S4). Tulokset Coxin suhteellisen malli esitetään Additional tiedosto 1: Taulukko S1. Jälleen kerran, käyttö yhdistettynä ekspression Sox2 ja CDX2 puhdistetut aiempia tuloksia (kuvio 3). Sox2 + /CDX2 - profiili ennusti huomattavasti huonompi tulos sairastavien potilaiden suoliston (p
= 0,005) ja laajentamalla (p
= 0,002) kasvaimet, joissa vaaraa suhteet 3,18 ja 4,84, vastaavasti , ja niistä ilman merkkejä laskimoiden invaasio (p
= 0,009), esittää riskisuhde 3,84. Vaikka rajatapaus ei-merkitsevä, vastaava suuntaus havaittiin potilailla, joilla ei imusolmukemetastaaseja (p
= 0,08) (kuva 3). Hazard suhde ja 95%: n luottamusväli kaikille ryhmille on esitetty yksityiskohtaisesti taulukossa 2 ja edelleen merkittäviä säätämisen jälkeen iän ja sukupuolen mukaan Monimuuttuja-analyysissä. Kuva 3 Kaplan-Meier käyrät osoittavat todennäköisyyden yleinen potilaiden elinaikaa mahasyövän mukaan molekyylitasolla fenotyypit Sox2 - /CDX2 + ja Sox2 + /CDX2 - ryhmiteltynä kliinis parametreja: Laurén luokitus (A), Ming luokittelu (B) laskimoiden invaasio (C) ja imusolmukemetastaaseja (D).
Taulukko 2 Coxin suhteellisen vaarat mallit selviytymisen funktiona molekyyli- fenotyypit (Sox2 + /CDX2- vs SOX2- /CDX2 +) kullekin kliinis parametrin
Parametri
Riskisuhde (95% CI)

Mukauttamaton
P
Adjusteda
P

Kaiken
1,95 (1,15-3,31) B 0,01
1,90 (1,10-3,28)
0.02
Laurén luokitus
Suoliston-tyyppinen
3,18 (1,33-7,58)
0.009
2,93 (1,21-7,10)
0,02
Diffuusi-tyyppi
1,35 (0,35-5,17) B 0.7
Unclassified
1,34 (0,60-3,02)
0.5
Ming luokittelu
Expanding
4,84 (1,64-14,29) B 0,004
4,53 (1,29-15,85) B 0.02
Infiltrative
1,13 (0,60-2,13)
0,7
Vascular invaasio
Negatiivinen
3,84 (1,30-11,35) B 0,02
3,82 (1,29-11,40)
0.02
Positiivinen
1,10 (0.60- 2.02)
0,8
N vaiheessa
N0
2,96 (0,82-10,65) B 0.1
3,98 (0,72-21,83) B 0,1
N +
1,29 ( 0,72-2,30) B 0,4
lyhenne: CI
luottamusväli.
oikaistu iän ja sukupuolen (Monimuuttuja-analyysi käyttäen Coxin regressiomallin).
Sox2 vahvistus
Koska geeni vahvistus on kasvain-spesifisen tapahtuman malignin transformaation aikana, ja että Sox2 lokus altistetaan tämä muutos muissa kasvaimissa, eli keuhkojen ja ruokatorven [17], me arveltu, että Sox2 vahvistus voisi selittää sen ilmentyminen ja heterogeenisyyden, sekä sisällä ja kesken mahalaukun kasvaimet. Tätä hypoteesia tukevat, tutkimus suoritetaan Oncomine tietokannasta osoitti, että Sox2 rankattu 10% geeneistä kopio määrä voittoja mahasyövässä (Additional tiedosto 1: Kuva S5).
Perusteella immunohistokemia tietojen valitsimme 14 tapausta, joissa Sox2 ilmaisun ja 7 negatiivisia tapauksia analysoida 2-väriä FISH määrityksessä. Havaitsimme, että Sox2 monistettiin 14% (2/14) tapauksista, joissa ilmaisun ja näistä tapauksista ilman lauseke (0/7). Edustava positiivinen asia niin Sox2 ilmaisun ja vahvistus on esitetty kuviossa 4A ja B. tapauksessa Sox2 ilme, mutta ei vahvistus on esitetty kuviossa 4C ja D. Lisäksi FISH-analyysi osoitti, että läsnä on korkea kopio vahvistuksenkertojan ja heterogeenisyys sisällä kasvaimia, havaittiin ei vain tavoite koetin Sox2
lokuksen mutta myös viittaus anturi, joka sijaitsee sen 3p varteen (Additional tiedosto 1: Kuva S6). Kuva 4 Mahasyöpää tapauksissa Sox2 proteiinin ilmentymisen (A ja C) voidaan esittää tai ilman Sox2 vahvistusta (B ja D, vastaavasti) määritettiin FISH. Green leimatut koettimet kohdistaa Sox2
, kun taas punainen leimattuja koettimia kohdistaa 3p käsivarteen. Tumat värjätään DAPI (sininen). (E) Kuusikymmentäkaksi gDNA mahasyövän näytteitä arvioitiin Sox2 kopiomäärä tila ja verrattuna normaaliin mahan limakalvon (kalibraattori). (F) Sox2 kopioluku oli merkitsevästi liittyy proteiinien ilmentyminen määritettynä IHC (p
< 0,05).
Selventämiseksi taajuutta Sox2
lokuksen kopioluvun muutoksia mahasyövän, suoritimme kopio -numero PCR käyttäen gDNA 62 mahalaukun syöpätapausta, käyttäen RNaasi P
anturi sijaitsee kromosomissa 14 referenssinä. Suurin osa näytteistä (93%) esitetään jonkin verran Sox2
kopioluvun vaihtelua, vaihtelee 3-9 kopiota (kuvio 4E). Merkittävä välistä positiivista kopiomäärä vahvistuksen ja Sox2 ilme (s
< 0,05) havaittiin (kuvio 4F).
Keskustelu
Mahalaukun syöpä on sairaus, jossa on useita tuloksia, joita ei voi ennustaa kliinis-alone [6]. Tämän vuoksi tunnistaminen molekyyli biomarkkereita, jotka voivat antaa edelleen lopputulos kerrostuminen ja hoitopäätökset on ratkaisevan tärkeää.
Tässä tutkimuksessa ominaista ilmaisua transkriptiotekijän Sox2 mahasyövän ja liittyvät sen kliinis ja Differentiaatiomarkkerien nimittäin MUC5AC (mahalaukun markkeri) ja CDX2 ja MUC2 (suoliston markkereita). Tämä johti löydettiin kaksi eri prognoosi- ryhmää, joka perustuu Sox2 ilmaisun, joka voitaisiin edelleen tarkentaa ottamalla huomioon yhdistetyn ilmaisun kanssa CDX2. Lopuksi unraveled heterogeenisyys Sox2
lokuksen ja kromosomi 3 kopioluvun mahasyövän, mikä osoittaa yhdistyksen välillä lisääntynyt kopiomäärä ja Sox2 proteiinin ilmentymiseen.
Keskeinen löydös oli havainto, että Sox2 ilmaisua yksin, ja edelleen jalostaa niitä yhdessä CDX2, mahdollistaa kerrostuneisuus potilaiden alaryhmiä merkittävästi eri kliinisiä tuloksia. Lisäksi kun yhdistimme nämä molekyyliprofiilien kanssa kliinis tiedot, kävi ilmi, että Sox2 + /CDX2 - profiili liittyy huonompi ennuste kuluessa osajoukkoja kasvaimia, jotka yleensä on parempi ennuste: suoliston-tyyppinen , laajeneva-tyyppi ja ilman merkkejä laskimoiden invaasio [21, 22]. Vaikka ei ole tilastollisesti merkitsevä, sama suuntaus havaittiin kasvainten esittämiseen ilman imusolmukemetastaaseja. Nämä molekyyliprofiilien osoittavat eri biologisesta käyttäytymisestä kasvaimen todennäköisimmin sairauden etenemiseen tai hoitoon vastus ja sitä voidaan käyttää opettamaan tehokkaammin hoito tai seuranta aikatauluja.
Erityisesti koska imusolmuke etäpesäke on yksi tärkeimmistä riskin tekijöitä mahalaukun syövän uusiutumiseen, jälkeen R0 leikkauksen, kaikki potilailla imusolmukemetastaaseja saada tukihoitona [23]. Kuitenkin meidän tulokset osoittavat, että potilaat ilman tätä riskitekijä, ja siten ei hoideta, esittää silmiinpistävän huonompi tulos, kun kasvain esittelee kanssa Sox2 + /CDX2 - molekyyliprofiilin. Tämä esittää hypoteesin, että sisällä N0 kasvaimia, potilaita tässä molekyyli- alaryhmän todennäköisesti hyötyä adjuvanttihoito. Kuitenkin nämä havainnot edellyttävät validointi suuremmissa ikäluokat ja se olisi myös erittäin informatiivinen lisätä kliinistä tietoa potilaan hoitoa.
Sox2 määräytyy myös mahdollisena kohteena uusille hoitotoimenpiteiden. Vaikka transkriptio tekijät eivät ole klassisia lääkekohteita, lähestymistavat Sox2-täsmähoitoihin on jo käsitelty rintasyövän. Tuoreessa tutkimuksessa, Sox2
geeni valikoidusti kohdistettu käyttäen sinkki-sormen-pohjainen keinotekoinen transkriptiotekijöiden lähestymistapa, jolloin sen erittäin spesifisiä, tehokkaita ja pitkäkestoisia alassäätöä, kääntää heikennetty tuumorigeenisyyteen, sekä in vitro

• Glutationi-S-transferaasi-geenin GSTM1, geeni-geeni vuorovaikutus, ja mahasyövän alttius: todisteita päivitetyn meta-analysis
• Raikasta ilmaa: laadun parantaminen tutkimuksessa verrattiin ilma-kiertävä tekniikka vs. perinteinen tekniikka estää nenämahaletku dysfunction