Efeitos da desnervação myenteric em fibras da matriz extracelular e distribuição de mastócitos no estômago normais e lesões gástricas

Efeitos da desnervação myenteric em fibras da matriz extracelular e distribuição de mastócitos em lesões de estômago e gástricas normais
Abstract
Neste estudo o efeito da denervação myenteric induzida por cloreto de benzalcónio (BAC) na distribuição de componentes fibrilares de matriz extracelular (ECM) e as células inflamatórias foi investigada na carcinogénese gástrica induzida por N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG). Os ratos foram divididos em quatro grupos experimentais: não desnervado (I) e de estômago desnervado (II) sem tratamento MNNG; estômagos não desnervado (III) e desnervados (IV) tratada com MNNG. Para análise histopatológica, histoquímica e estereológica, seções de fragmentos gástrico foram coradas com Hematoxilina-Eosina, Picrosirius-hematoxilina, Gomori reticulin, de Weigert resorcina-fucsina, Azul de Toluidina e Alcian-Azul /safranina (AB-SAF).
Resultados
BAC desnervação provoca um aumento na frequência de reticular e fibras elásticas na desnervado (grupo II) em comparação com os estômagos não desnervados (grupo I). O tratamento dos animais com MNNG induziu o desenvolvimento de adenocarcinomas no estômago não-desnervados e desnervados (grupos III e IV, respectivamente) com um aumento notável no volume relativo do estroma, a frequência de fibras reticulares e do infiltrado inflamatório que foi mais intensa no grupo IV. Um aumento na frequência de fibras elásticas foi observada em adenocarcinomas de desnervado (grupo IV) em comparação com os estômagos não desnervados (Grupo III), que mostrou degradação destas fibras. O desenvolvimento de lesões (grupos III e IV) também foi associado com um aumento na população de mastócitos, especialmente AB e AB-SAF positivos, este último principalmente no grupo desnervado IV.
Conclusões
Os resultados mostram uma forte associação na alteração morfológica dos componentes fibrilares ECM, o aumento da densidade de mastócitos e o desenvolvimento de tumores induzidos por MNNG no estômago de rato desnervado ou não-desnervados por BAC. Isto sugere que o estudo de componentes extracelulares e intracelulares do microambiente do tumor contribua para a compreensão da biologia do tumor por acção da desnervação mioentérico.
Fundo
A interacção entre as células tumorais e do estroma circundante é um dos aspectos fundamentais no mecanismo de proliferação de células tumorais e invasão [1]. As células tumorais fazer remodelar a matriz extracelular (ECM), uma mistura complexa de fibras (colágeno, reticulares e elásticas) e substância fundamental que fornece suporte de células [2], para facilitar a comunicação e fuga do controle por parte do microambiente [3]. O sistema de colágeno fibrilar atua como uma estrutura de suporte dos tecidos, onde as fibras reticular ligam as fibras de colágeno com as lâminas basal das células epiteliais, musculares e adiposos; o sistema de micro fibrilas-elastina desempenha um papel na distribuição uniforme de stress para manter a resistência às exigências dos tecidos locais [4].
integridade estrutural e funcional dos sistemas de colagénio fibrilar e microfibrilas-elastina são importantes para o estômago para embalar o alimento, a secreção de enzimas e ácidos para quebrar as matérias-nutrientes e para transferir a mistura para o intestino delgado. As três tarefas dependem da extrínseca (divisões simpático e parassimpático do sistema nervoso autônomo) e da inervação intrínseca (sistema nervoso entérico - ENS). Os principais componentes da ENS são duas redes ou plexos de neurônios e fibras nervosas, o plexo mioentérico e submucoso [5]. A importância ENS para a regulação das funções gastrointestinais é observada após a aplicação tópica do agente tensioactivo catiónico, cloreto de benzalcónio (BAC), sobre a camada serosa que resulta em destruição parcial e selectiva dos neurónios mientéricos plexo [6]. A correlação entre a carcinogénese e o ENS tenha sido demonstrada em modelos experimentais utilizando a desnervação mientérico por BAC e a indução de tumores por N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) [7] e 1,2-dimetil-hidrazina ( DMH) [8] com uma redução na incidência e o tamanho dos tumores gastrointestinais.
células imunes são potentes fontes de sinais parácrinos para o ENS. Particularmente mastócitos entéricos estão estrategicamente localizados e têm poderosos mediadores farmacológicos que actuam na face de estímulos imunológicos que podem afectar a integridade do tracto gastrointestinal [9]. O anticorpo de ligação aos mastócitos os torna capazes de reconhecer antigénios específicos e sinalizar a sua presença à ENS. ENS, por sua vez, interpreta os sinais químicos de mastócitos como uma ameaça e procura eliminar, proporcionando assim uma resposta protectora [9]. A presença de mastócitos tem sido descrito em várias neoplasias, com papéis pro ou anti-tumorais desempenhados pelos seus mediadores bioactivos libertados pela influência do microambiente do tumor [10-12]. A acção de mediadores pró-tumorais, tais como a histamina, triptase e quimase podem promover a migração e proliferação da célula, induzindo a expressão de moléculas de adesão em células endoteliais e activando assim o processo de angiogénese de tumor, metástase e proliferação [13-15]. Por outro lado, algumas citocinas, tais como interleucina (IL) -2 e -21, factor de necrose tumoral (TNF) e heparina libertados pelos mastócitos, podem actuar como agentes anti-cancerígenos por inibição do seu crescimento [16, 17].
vários estudos têm mostrado que, durante a carcinogénese há um aumento no número de mastócitos, observada em neurofibromas, lipomas, hemangiomas, tumores da glândula supra-renal e pele [18], carcinomas de células escamosas [19], de células escamosas da laringe [20] carcinomas gástricos e [21]. Em adenocarcinomas gástricos, a pequena libertação dos conteúdos armazenados em grânulos citoplasmáticos de mastócitos foi associada com alterações no lâminas basais microvascular, incluindo a espessura irregular, múltiplas camadas e uma fraca associação com células endoteliais e pericitos, que contribuem para a remodelação dos vasos sanguíneos [22]. Após remoção cirúrgica do cancro gástrico, estudos de sobrevivência mostraram que os pacientes com o aumento do número de mastócitos apresentaram um prognóstico pior em comparação com os pacientes com baixos números de eles.
O propósito do presente estudo foi o de determinar os efeitos de ablação química de mientérico neurônios sobre a distribuição das fibras da matriz extracelular e mastócitos na mucosa gástrica de estômagos não-desnervados e desnervados e, em um modelo de carcinogênese gástrica induzida pela administração MNNG em ratos.
material e métodos
delineamento experimental
foram avaliados quatro grupos experimentais. Grupos I (n = 5) e II (n = 5) não desnervado e desnervado respectivamente, sem a presença de neoplasias gástricas; grupos III (n = 10) e IV (n = 10) não desnervado e desnervado, respectivamente, com a presença de neoplasias gástricas. Fragmentos da região pilórica (antro) do estômago usada neste estudo foram obtidos a partir de investigações realizadas pela POLLI-LOPES et al. [7]. Os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as regras da Comissão de Cuidados e Usos de Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisa do N.I.H. (EUA) e Comissão de Ética para Experimentação Animal (CEEA) da FAMERP (Protocolo n ° 6193/2008), São José do Rio Preto, SP.
Animais
Wistar machos
ratos pesando 100 a 150 g, obtido a partir do biotério da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Brasil, foram mantidos (4 animais por jaula), em temperaturas entre 23 a 25 ° C, e recebeu comida e água ad libitum
.
desnervação gástrica im
Os animais foram anestesiados com cloridrato de cetamina e cloreto de tiazina (0,15 ml /0,05 ml /100 g de peso) [23]. O estômago de cada animal foi exteriorizada através de uma laparotomia na linha média abdominal superior e isolado a partir da cavidade peritoneal através de um pequeno fenestra�o numa folha de plástico para aplicação tópica de 0,6% de BAC (v /v) (Aldrich Chemical Co. diluído em solução salina (0,9% NaCl) [7, 24]. os estômagos isolados foram envoltos com gaze embebida em BAC ou solução salina e mantidos húmidos durante 30 min [6, 7, 24]. A superfície serosa dos estômagos foi completamente lavado com solução salina, os órgãos foram devolvidos ao seu local anatômico ea parede abdominal foi suturada. os animais foram mantidos em gaiolas de plástico (4 animais /gaiola) sob temperatura controlada, e recebeu comida e água ad libitum
.
indução de neoplasias em mucosa antro gástrico
Dezasseis semanas após a cirurgia, os animais dos grupos III (não-desinervado) e IV (desinervado) ingeriram uma solução de N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) dissolvido em água destilada e desionizada a uma concentração de 100 mg /L, durante 28 semanas. Os animais foram sacrificados 2 meses após a última ingestão de MNNG e os estômagos foram coletadas para análise morfológica.
A análise morfológica e quantitativa
fibras da matriz extracelular
Fragmentos da região pilórica do estômago (antro) foram corrigidos em 4% de formalina tamponada durante 12 horas, lavadas em água da torneira, desidratados numa série de etanol e embebidos em parafina. Para o estudo da matriz extracelular, as seções 4 mm de espessura foram corados com Hematoxilina-Eosina [25], Picrosirius-hematoxilina [26] e Gomori reticulin [27] para análise histopatológica, e por colágeno e fibras reticulares de avaliação respectivamente. As fibras do sistema elástico foram estudados utilizando de Weigert resorcina-fucsina que cora selectivamente ambas as fibras elásticas e elaunínicas (as fibras oxitalânicas permanecem sem mácula, porque eles não são oxidados anteriormente neste estudo) [28]. As amostras foram analisadas com um microscópio óptico Olympus BX60 (Olympus, Hamburgo, Alemanha) e os campos microscópicos foram digitalizadas usando o programa Image-Pro Plus versão 4.5 for Windows (Media Cybernetics, Silver Springs, MD). Cinco áreas aleatórias da mucosa gástrica foram analisados ​​utilizando uma objectiva x 20, e a calibração foi feita usando uma lâmina de microscópio Olympus graduada. A análise quantitativa foi determinada de acordo com o procedimento de Weibel [29], um sistema de teste da grelha com 168 pontos e 84 linhas de teste, para comparar o volume relativo (percentagem) dos compartimentos da mucosa gástrica (epitélio, estroma e outros compartimentos, com excepção do epitélio e estroma) para a coloração de hematoxilina-eosina e a frequência relativa de reticular e distribuição de fibras elásticas (porcentagem) para Gomori reticulin e coloração fuchsin resorcin- de Weigert, respectivamente. Os valores são apresentados como média ± SEM de volume relativo (porcentagem) dos compartimentos da mucosa gástrica e média ± SEM de frequência relativa de reticular e distribuição de fibras elásticas (porcentagem). Células
Mast
Análise de mastócitos na gástrica antro foi realizada em cortes corados com azul de toluidina 0,5% para quantificação de células intactas e desgranulados e, com Alcian-Blue-safranina (AB-SAF) para a quantificação da mucosa e mastócitos do tecido conjuntivo [30, 31]. Para este fim, foram analisados ​​aleatoriamente sessenta áreas da mucosa gástrica, por animal, com um microscópio óptico Olympus (Olympus, Hamburgo, Alemanha), utilizando uma ocular milímetros x 12,5 /16 e um objectivo × 40 de alimentação (Zeiss, Alemanha) . Os valores são registados como média ± SEM do número de células por milímetro 2.

Análise Estatística Os dados foram analisados ​​utilizando o software Statistica 6,0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK). Os dados são apresentados como média ± SEM e foram submetidos ao teste t in the Student e one-way análise de variância (ANOVA), e depois para o teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer ou Bonferroni. Diferenças com valores de P <
0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados da análise histopatológica e histoquímica dos estômagos de ratos
Inicialmente, fragmentos pilóricas de estômagos não-desnervados e desnervados por cloreto de benzalcónio (BAC) (grupos I e II, respectivamente) foram estudados . Análise de fragmentos do grupo II mostrou que a desnervação mientérico não alterou a quantidade e distribuição das fibras de colagénio malha que rodeiam as glândulas pilórica em comparação com o grupo I (Fig. 1A e 1B). Este resultado foi confirmado por Picrossírius Hematoxilina-mancha (Fig. 1E e 1F) e análise quantitativa do volume relativo do epitélio e estroma da mucosa gástrica a partir de ambos os grupos (Fig. 1I e 1J). Figura 1 A análise histológica dos estômagos de ratos. A, B, E e F)
pilórica glândulas gástricas (g) rodeadas por estroma com fibras (s) de colagénio observados na camada mucosa dos grupos I e II. Epitélio (ep). poços gástrica (f). Muscularis da mucosa (M). C, D, G e H)
pilórica glândulas gástricas (g), constituído por células tumorais ocupada a maior área da mucosa gástrica dos grupos III e IV. Uma acumulação de PMN (setas) foi observada dentro das glândulas. Hematoxilina-Eosina (A-D); Picrossírius-Hematoxilina (E-H). Barras: 20 uM. I-L
) compartimentos de tecidos (epitélio, estroma, outros) volumes da mucosa gástrica piloro. Os valores são expressos como média ± SEM de percentagem de volume relativo. Os grupos sem lesões (I e II) apresentou um volume relativamente elevada de epitélio (p < 0,05) em comparação com os grupos com lesões (III e IV). A presença de adenocarcinoma nos grupos III e IV resultou em um aumento significativo (p < 0,05). Do estroma em comparação com os grupos I e II
estômagos não-desnervados e desnervados tratados com MNNG (grupos III e IV, respectivamente) apresentou alterações na arquitectura do tecido e a disposição das fibras da matriz extracelular e um aumento do diâmetro das glândulas pilórica, bem como no volume relativo do estroma (Fig. 1C, D, G e 1H). O tratamento com MNNG induziu o desenvolvimento de tumores benignos e malignos, especialmente pólipos adenomatosos e adenocarcinomas (Fig. 1C e 1 g) em estômagos não desnervados (grupo III). Animais com estômagos desnervado tratado com MNNG (grupo IV) desenvolveram lesões pré-cancerosas e de tumores malignos caracterizadas por displasia, gastrite atrófica e adenocarcinoma (Fig. 1D e 1H). Em ambos os grupos, o estroma do adenocarcinomas foi enriquecida pela presença de células inflamatórias, como neutrófilos, células mastro, células plasmáticas e linfócitos, que mostra a resposta imunológica a neoplasias (Fig. 2). No entanto, as lesões neoplásicas do grupo IV foram de perfis mais pequenos e menos agressivas quando em comparação com o grupo III, e o infiltrado inflamatório localizada no estroma do tumor foi mais intenso, especialmente nos animais que desenvolveram adenocarcinomas (fig. 2D). Figura 2 Análise histológica de adenocarcinoma induzida por tratamento MNNG. A e B)
vista morfológico de adenocarcinoma (AD) em não-denervado (grupo III) e estômago desnervado (grupo IV). camada muscular (M). infiltrado inflamatório intenso (In). C e D)
Detalhe de infiltrado inflamatório do estroma tumor constituído por mastócitos (setas pretas), neutrófilos (setas), linfócitos (setas verdes) e células plasmáticas (setas vermelhas). Azul de Toluidina. Bares:. 100 mm (Fig. A e B), 10 mm (Fig. C e D)
análise histoquímica das secções pilóricas foi realizada com Gomori reticulin e resorcina-fucsina coloração de Weigert para estudar a distribuição ( frequência) da reticular e fibras elásticas no estroma, respectivamente. Secções submetidas a ambos os métodos revelados distribuição semelhante de malha as fibras que circundam as glândulas pilórica dos estômagos dos grupos I e II (Fig. 3A, B, E e 3F). Não desnervados ou desnervados estômagos com MNNG (grupos III e IV, respectivamente), aparentemente apresentados quantidade aumentada de fibras reticulares (FIG. 3C e 3D) e fibras elásticas grossas e curtas altamente desorganizada (Fig. 3G e 3H) em adenocarcinomas em comparação com seus respectivos grupos de controlo (grupos I e II, respectivamente). Figura 3 Análise histoquímica de reticular (A-D) e as fibras elásticas (E-H) nos estômagos de ratos. A e B)
Grupos I e II apresentados fibras reticulares e rectilíneas alinhadas (setas) que envolve o epitélio (EP) e o estroma (s). C e D)
fibras reticulares (seta) de enrolamento e, aparentemente, mais densas na base (pontas de setas) das glândulas (g). Foram observadas acumulação de fibras de colágeno entre as glândulas (*). E e F)
As glândulas são acompanhadas por uma delicada teia de fibras elásticas (seta) e mais intensamente marcadas em E. G e H)
Um aumento da espessura destas fibras, a perturbação e a fragmentação das variáveis ​​fibrilares massas agrupadas de elastina (setas) pode ser observada em torno das glândulas (g) em comparação com seus respectivos grupos de controlo (I e II). prata (A-D) de Gomori; de Weigert resorcina-fucsina (E-H). Bares:. 10 mm
Análise quantitativa das fibras reticulares confirmou o aumento deste componente extracelular nos adenocarcinomas observadas nos grupos III e IV, e também mostrou um aumento significativo inesperado na mucosa do estômago desnervado (grupo II ) em comparação com o grupo I (Tabela 1). Apesar do aparente aumento das fibras elásticas no estroma de animais não-desnervados e desnervados tratados com MNNG (grupos III e IV, respectivamente), não se observou diferença estatística na sua distribuição em comparação com grupos de controle (I e II) (Tabela 1) . Por outro lado, a desnervação mientérico induzida aumento significativo das fibras elásticas de estroma gástrica dos grupos II e IV, em comparação com não-estômagos desnervados, dos grupos I e III (Tabela 1). Nenhuma diferença significativa foi observada no colágeno e distribuição de fibras elásticas entre as lesões não-malignas e malignas de estromas de grupos III e IV.Table 1 avaliação estereológica dos efeitos da desnervação mioentérico no antro gástrico.

distribuição de freqüência relativa das fibras (%) 1
Grupos
Collagen Sistema
Elastic Sistema
I
16,87 ± 0,5
13,27 ± 0,5
II
24,06 ± 1,5 *
19,4 ± 0,6 *
III - NT
21,8 ± 0,9
11,2 ± 0,6
III - MT
25,71 ± 0,5 *
11,1 ± 0,4
IV - NT
21,2 ± 1,6
20,2 ± 1,7 &
IV - MT
26,87 ± 1,5 *
19 ± 0,7 &
preparação histológica foi realizada como descrito em Materiais e Métodos
. Os valores são expressos como média ± SEM de percentagem de frequência relativa de fibras. tumor não maligno (NT); tumor maligno (MT). 1 A análise estatística baseada em ANOVA seguida de correcção de Tukey-Kramer. * P < 0,05 versus grupo I; &Amp; P < 0,05 vs grupo III.
Quantificação dos mastócitos nos fragmentos da região pilórica do estômago
Os mastócitos foram analisados ​​e quantificados na mucosa, submucosa e as camadas musculares em todos os grupos experimentais. A análise do número total de células por fragmento gástrico mostrou nenhuma diferença significativa entre a não-desnervado (I) e (II) grupos desnervados (Fig. 4A). No entanto, em grupos não-desnervados ou desnervados tratados com MNNG (III e IV, respectivamente), o desenvolvimento de lesões benignas ou malignas foi associado com um aumento significativo do número de mastócitos no antro gástrico em comparação com o grupo não-desnervado (EU). Nas camadas de mucosa e submucosa, o aumento significativo dos mastócitos nos grupos não-desnervados ou desnervados tratada com MNNG, (III e IV) foi associado com um aumento de células intactas e desgranulados (Fig. 4B). Na camada muscular, este aumento foi associado principalmente com o grande número de mastócitos intactos (Fig. 4C). Figura 4 Análise quantitativa de mastócitos no estômago. Os dados representam a média ± S.E.M de sessenta campos analisados ​​por animal, tal como descrito em Material e Métodos. Não desnervado (I) e do estômago desnervado (II) sem lesões. estômago não-denervado (III) e desnervado (IV) com lesões. tumor não maligno (NT). tumor maligno (MT). A)
número total de mastócitos no fragmento gástrico. * P < 0,05 vs. grupo I. # P < 0,01 vs. outros grupos experimentais. B e C)
mastócitos intacta e desgranulados na mucosa, submucosa e as camadas musculares. * P < 0,05 versus grupo I; #P ≪ 0,05 vs. outros grupos experimentais; δ P < 0,05 vs grupo III - NT (mastócitos intacta); &Amp; P < 0,05 vs. Grupo III - NT (mastócitos desgranulados). C)
mastócitos intacta e desgranulados na camada muscular. * P < 0,05 versus grupo I; # P < 0,05 vs grupo II.
Análise fenotípica das células mastro
Para a caracterização fenotípica dos mastócitos foi utilizado o método de Alcian Blue-safranina (AB-SAF). Em animais de não-denervado (I) e (ii) grupos desnervados, houve um predomínio de mastócitos AB positivo (AB +) nas mucosa e submucosa camadas do antro gástrico, caracterizando essas células como células da mucosa do mastro (MMC) (Fig. 5A e 5B). Nos grupos experimentais tratados com MNNG (III e IV), uma proporção elevada de AB + e AB-SAF + mastócitos subtipos foram observados, esta última principalmente no grupo desnervado (IV) (Fig. 5C e 5D). Fragmentos do antro gástrico contendo mesentério foram usadas para confirmar a presença de SAF + células, caracterizando a mastócitos de tecido conjuntivo (MCTC) por este método de coloração (fig. 5E e 5F). Figura 5 análise fenotípica dos mastócitos de fragmento gástrico. A e B)
camada submucosa de não desnervado (grupo I) e desnervado (grupo II) estômago mostrando mastócitos com grânulos citoplasmáticos positivos para alcian-blue (setas), caracterizando fenótipo de células da mucosa do mastro - no detalhe do painel A . C e D)
dois população de mastócitos são observados nas lesões gástricas de não-denervado (grupo III) e grupo IV) estômagos (desnervados: células alcian azul-positivos mastro (setas pretas) e alcian-blue /safranina mastócitos positivos (setas vermelhas). as células E e F)
mastro com safranina grânulos positivos (setas) são observadas no mesentério, caracterizando mastócitos do tecido conjuntivo. Alcian-azul /método safranina. Barras: 10 uM (Fig A-F.); 5 mm (detalhe Fig. A)
.
A quantificação total de três subtipos de mastócitos (AB +, AB-SAF + e SAF +) confirmou as observações morfológicas, que mostra uma predominância de AB células + no fragmento do piloro em todos os grupos experimentais (Tabela 2). Nos grupos não tratados desnervados e desnervados com MNNG (III e IV, respectivamente), este subtipo de células aumentou significativamente em comparação com o grupo não-desnervado (I). Em estômagos desnervados tratados com MNNG (grupo IV), sub-celular AB-SAF + também foi significativamente aumentada em comparação com lesões malignas lesões no grupo não-tratado com desnervado MNNG (III) .table 2 Densidade de mastócitos com diferentes fenótipos no antro gástrico.

piloro Fragmento
Grupos
AB +

SAF +
AB + SAF +
I
8 ± 2
1 ± 1

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