Auswirkungen von myenteric Denervation auf extrazellulären Matrixfasern und Mastzellverteilung im normalen Magen und Magen-Läsionen

Auswirkungen von myenteric Denervation auf extrazellulären Matrixfasern und Mastzellverteilung im normalen Magen und Magen-Läsionen
Zusammenfassung
Hintergrund
In dieser Studie wurde die Wirkung von myenteric Denervierung induziert durch Benzalkoniumchlorid (BAC) über die Verteilung der fibrillären Komponenten extrazellulären Matrix (ECM) und Entzündungszellen wurde in Magen Karzinogenese induziert durch N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) untersucht. Ratten wurden in vier Versuchsgruppen eingeteilt: nicht-denervierten (I) und denervierten Magen (II) ohne MNNG Behandlung; nicht-denervierten (III) und denervierten Mägen (IV) mit MNNG behandelt. Für histopathologische, histochemische und stereo Analyse, Abschnitte von Magen-Fragmente wurden gefärbt mit Hämatoxylin-Eosin, Picrosirius-Hämatoxylin, Gömöri reticulin, Resorcinfuchsin, Toluidinblau und Alcian-Blau /Safranin (AB-SAF) Weigert.
Ergebnisse
BAC Denervierung bewirkt eine Erhöhung der Frequenz von retikulären und elastischen Fasern in dem denervierten (Gruppe II) im Vergleich zu den nicht-denervierten Mägen (Gruppe I). Die Behandlung der Tiere mit MNNG induziert die Entwicklung von Adenokarzinomen in nicht-denervierten und denervierten Mägen (Gruppen III bzw. IV) mit einem bemerkenswerten Anstieg des relativen Volumens des Stroma, die Frequenz der retikulären Fasern und entzündliches Infiltrat, das war intensiver in der Gruppe IV. Eine Zunahme der Frequenz von elastischen Fasern wurde in Adenokarzinomen von denervierten (Gruppe IV) beobachtet, im Vergleich zu den nicht-denervierten Mägen (Gruppe III), die Abbau dieser Fasern zeigten. Die Entwicklung von Läsionen (Gruppen III und IV) wurde ebenfalls mit einem Anstieg der Mastzellpopulation, insbesondere AB und AB-SAF Positive, letztere vor allem in der denervierten Gruppe IV verbunden.
Schlussfolgerungen
Die Ergebnisse zeigen eine starke Assoziation in der morphologischen Veränderung der ECM fibrillären Komponenten, die eine erhöhte Dichte von Mastzellen und die Entwicklung von MNNG in der nicht-denervierten Rattenmagen oder denerviert durch BAC induzierten Tumoren. Dies deutet darauf hin, dass die Studie von extra- und intrazellulären Komponenten von Tumor-Mikroumgebung trägt zum Verständnis der Tumorbiologie durch die Wirkung von myenteric Denervierung.
Hintergrund
Wechselwirkung zwischen Tumorzellen und dem umgebenden Stroma einer der wichtigsten Aspekte des Mechanismus ist von Tumorzellproliferation und Invasion [1]. Tumorzellen tun, um die extrazelluläre Matrix umbauen (ECM), ein komplexes Gemisch von Fasern (Kollagen, retikuläre und elastisch) und Grundsubstanz, die Zellen-Unterstützung bietet [2], Kommunikation und Entweichen der Steuerung durch den Mikroumgebung zu erleichtern [3]. Das Kollagen fibrilläres System wirkt als Tragrahmen von Geweben, wo retikulären Fasern Kollagenfasern mit der Basallaminae epithelialer, Muskel- und Fettzellen zu verbinden; die microfibril-Elastin-System spielt eine Rolle bei gleichmäßig Stress Verteilung der Widerstandsfähigkeit gegenüber lokalen Gewebe Anforderungen aufrecht zu erhalten. [4] Was sind strukturelle und funktionelle Integrität der Kollagenfasern und microfibril-Elastin-Systeme wichtig für den Magen, die Nahrung zu verpacken, Enzyme und Säuren zu sekretieren die rohen Nährstoffe zu brechen und die Mischung in den Dünndarm zu übertragen. Die drei Aufgaben sind abhängig von der extrinsischen (Sympathikus und Parasympathikus Abteilungen des autonomen Nervensystems) und die intrinsische Innervation (enterale Nervensystem - ENS). Die Hauptkomponenten der ENS sind zwei Netze oder Geflechte von Neuronen und Nervenfasern, die myenteric und submuköse Plexus [5]. Der ENS Bedeutung für die Regulation der gastrointestinalen Funktionen nach der topischen Anwendung des kationischen Tensids, Benzalkoniumchlorid (BAC) beobachtet wird, auf der serösen Schicht, die in teilweise und selektiven Zerstörung von Plexus myentericus Neuronen führt [6]. Die Korrelation zwischen der Karzinogenese und der ENS wurde in experimentellen Modellen unter Verwendung der myentericus Denervierung von BAC und die Induktion von Tumoren durch N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) [7] und 1,2-Dimethylhydrazin nachgewiesen ( DMH) [8] mit einer Verringerung der Häufigkeit und Größe von gastrointestinalen Tumoren.
Immune Zellen sind potente Quellen parakrine Signale an den ENS. Besonders magensaftresistenten Mastzellen strategisch und haben starke pharmakologische Mediatoren, die im Angesicht der immunologischen Stimuli wirken, die die Integrität des Magen-Darm-Trakt beeinflussen können [9]. Die Antikörper-Bindung an Mastzellen macht sie in der Lage spezifische Antigene zu erkennen und ihre Anwesenheit zu ENS signalisieren. ENS seinerseits interpretiert die chemischen Signale von Mastzellen als Bedrohung und versucht, sie zu beseitigen, wodurch eine schützende Antwort Bereitstellen [9]. Die Anwesenheit von Mastzellen wurde in mehreren Neoplasien, mit pro oder anti-Tumor-Rollen von ihren bioaktive Mediatoren durch den Einfluss der Tumor-Mikroumgebung [10-12] freigegeben beschrieben. Die Wirkung von pro-Tumor-Mediatoren, wie Histamin, Tryptase und Chymase kann die Migration und die Zellproliferation zu induzieren die Expression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen fördern und damit den Prozess der Tumorangiogenese, Metastasierung und Proliferation Aktivierung [13-15]. Auf der anderen Seite, einige Zytokine wie Interleukin (IL) -2 und -21, Tumornekrosefaktor (TNF) und Heparin durch Mastzellen freigesetzt, können als Antikrebsmittel wirken, indem sie ihr Wachstum inhibierende [16, 17].
mehrere Studien haben gezeigt, dass es während der Karzinogenese gezeigt, dass eine Erhöhung der Anzahl von Mastzellen ist, in Neurofibrome, Lipome, Hämangiome beobachtet, Tumoren der Nebenniere und der Haut [18], Plattenzellkarzinomen [19], Kehlkopf- squamous cell [20] und Magenkarzinomen [21]. In Magen-Adenokarzinome, wurde die kleine Freisetzung des Inhalts in zytoplasmatischen Granula von Mastzellen gespeichert sind mit den Veränderungen in der mikrovaskulären Basallaminae verbunden sind, einschließlich unregelmäßiger Dicke, mehrere Schichten und eine schwache Assoziation mit Endothelzellen und Perizyten, die auf den Umbau von Blutgefßen beitragen [22]. Nach der chirurgischen Entfernung von Magenkrebs, Überlebensstudien haben gezeigt, dass mit einer erhöhten Anzahl von Mastzellen Patienten eine schlechtere Prognose zeigten im Vergleich zu Patienten mit einer geringen Zahl von ihnen.
Der Zweck der vorliegenden Studie war es, die Auswirkungen von chemischen Ablation von myenteric zu bestimmen Neuronen auf der Verteilung der extrazellulären Matrix Fasern und nicht-denervierten und denervierten Mägen Mastzellen in der Magenschleimhaut von und in einem Modell von MNNG Verwaltung bei Ratten.
Material und Methoden
Experimentelles Design induzierten Magen Karzinogenese
Es wurden vier Versuchsgruppen bewertet. I-Gruppen (n = 5) und II (n = 5) nicht-denervierten und denervierten bzw. ohne Anwesenheit von Magen Neoplasmen; III-Gruppen (n = 10) und IV (n = 10) nicht-denervierten und denervierten jeweils mit der Anwesenheit von Magen Neoplasmen. Fragmente des Pylorusgegend (Antrum) des Magens in dieser Studie verwendet wurden aus Untersuchungen, die durch POLLI-LOPES et al. [7]. Die experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Regeln des Ausschusses für Pflege und Verwendung von Labortieren des Nationalen Forschungsrats des N.I.H. durchgeführt (USA) und Ethikkommission für Tierversuche (CEEA) von FAMERP (Protokoll Nr 6193/2008), São José do Rio Preto, SP.
Tiere
Männliche Wistar-Ratten
100 mit einer 150 g Gewichten erhalten aus der Tierhaltung von der School of Medicine von Ribeirão Preto, Brasilien, wurden (4 Tiere pro Käfig) untergebracht sind, bei Temperaturen zwischen 23 bis 25 ° C und erhielt Nahrung und Wasser ad libitum
. Gastric Denervierung

Die Tiere wurden anästhesiert im mit Ketamin-Hydrochlorid und thiazin Chlorid (0,15 ml /0,05 ml /100 g Gewicht) [23]. Der Magen von jedem Tier wurde eine Mittellinie Oberbauchlaparotomie exteriorisiert durch die und aus der Bauchhöhle durch einen kleinen Fenestration in einer Kunststofffolie für die topische Anwendung von 0,6% BAC isoliert (v /v) (Aldrich Chemical Co. in Kochsalzlösung verdünnt (0,9% NaCl) [7, 24]. Die isolierten Mägen mit Gaze umwickelt wurden in BAC oder Kochsalzlösung getränkt und gehalten für 30 min feucht [6, 7, 24]. Die Serosaoberfläche der Mägen gründlich mit Kochsalzlösung gewaschen wurde, wurden die Organe zurück ihrer anatomischen Ort und der Bauchwand vernäht wurde. die Tiere wurden in Plastikkäfigen (4 Tiere /Käfig) unter kontrollierter Temperatur und erhielten Futter und Wasser ad libitum
.
Induktion von Neoplasien in Magenantrum Schleimhaut gehalten
Sechzehn Wochen nach der Operation werden die Tiere der Gruppen III (nicht denervierten) und IV (denervierten) aufgenommen, eine Lösung von N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) für 28 Wochen in destilliertem und deionisiertem Wasser bei einer Konzentration von 100 mg /l gelöst. Die Tiere wurden 2 Monate nach der letzten Einnahme von MNNG getötet und die Mägen wurden für die morphologische Analyse gesammelt.
Morphologische und quantitative Analyse
extrazelluläre Matrixfasern
Fragmente des Pylorusgegend des Magens (Antrum) festgelegt wurden in 4% Formalin für 12 Stunden gepuffert, in Leitungswasser, dehydriert in einer Ethanolreihe gewaschen und in Paraffin eingebettet. Für die extrazelluläre Matrix Studie Abschnitte 4 um dicke wurden mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt [25], Picrosirius-Hämatoxylin [26] und Gömöri reticulin [27] für die histopathologische Analyse und für Kollagen und Retikulumfasern Auswertung sind. Die Fasern des elastischen Systems wurden unter Verwendung sucht Weigert Resorcin-Fuchsin, die selektiv sowohl elastische als auch elaunin Fasern Flecken (die Oxytalanfasern ungefärbt bleiben, weil sie in dieser Studie nicht oxidiert werden zuvor) [28]. Die Proben wurden mit einem Olympus BX60 Lichtmikroskop (Olympus, Hamburg, Deutschland) und die mikroskopischen Felder analysiert wurden digitalisiert die Image-Pro Plus-Version 4.5 für Windows-Software (Media Cybernetics, Silver Springs, MD) verwendet wird. Fünf zufällige Bereiche der Magenschleimhaut wurden unter Verwendung eines 20 × Ziel analysiert, und die Kalibrierung durchgeführt wurde unter Verwendung eines Olympus Objektträger sortiert. Die quantitative Analyse wurde gemß dem Verfahren von Weibel bestimmt [29], einem Gittertestsystem mit 168 Punkten und 84 Testlinien, die relativen Volumen (in Prozent) der Magenschleimhaut Abteile (Epithel, Stroma und andere Kompartimente zu vergleichen, mit der Ausnahme der Epithel und Stroma) für Hämatoxylin-Eosin-Färbung und die relative Häufigkeit von retikulären und elastischen Faserverteilung (in Prozent) für Gömöri reticulin und Resorcin- Fuchsin-Färbung Weigert sind. Die Werte sind als Mittelwert ± SEM der relativen Volumen (in Prozent) der Magenschleimhaut Fächer und Mittelwert ± SEM der relativen Häufigkeit von retikulären und elastischen Faserverteilung (in Prozent) gemeldet.
Mastzellen
Analyse von Mastzellen in der Magen Antrum wurde in Abschnitte gefärbt mit Toluidinblau 0,5% für die Quantifizierung von intakten und degranulierten Zellen und mit Alcian-Blau-Safranin (AB-SAF) zur Quantifizierung der Schleimhaut und des Bindegewebes Mastzellen [30, 31] durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden sechzig zufällig Bereiche der Magenschleimhaut analysiert, pro Tier, mit einem Olympus Lichtmikroskop (Olympus, Hamburg, Deutschland) unter Verwendung eines × 12,5 /16 Millimeter Okular und ein 40 × Leistungsziel (Zeiss, Deutschland) . Die Werte sind als Mittelwert ± SEM von der Anzahl der Zellen pro mm angegeben 2.
Statistische Analyse
Daten analysiert wurden unter Verwendung von Statistica 6.0-Software (Starsoft, Inc., Tulsa, OK). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt und wurden an die Student-t-Test
und Einweganalyse von Varianzen (ANOVA) vorgelegt, und dann an den Tukey-Kramer mehrere Vergleichstest oder Bonferroni. Unterschiede mit Werten von P
< 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.
Ergebnisse
Histopathologische und histochemische Analyse von Rattenmägen
Anfänglich pyloric Fragmente von nicht-denervierten und denervierten Mägen von Benzalkoniumchlorid (BAC) (Gruppen I und II, jeweils) wurden untersucht . Die Analyse der Fragmente der Gruppe II zeigten, dass myenteric Denervierung, die die Pylorusdrüsen umgeben nicht die Menge und Verteilung der meshwork Kollagenfasern ändern im Vergleich zu der Gruppe I (Abb. 1A und 1B). Dieses Ergebnis wurde durch Picrosirius-Hämatoxylin-Färbung (Fig. 1E und 1F) und quantitative Analyse des relativen Volumens des Epithel und Stroma der Magenschleimhaut aus beiden Gruppen (Fig. 1I und 1J) bestätigt. Abbildung 1 histologische Analyse von Ratten Mägen. A, B, E und F)
Pyloric Magendrüsen (g), umgeben von Stroma mit Kollagenfasern (s) in der Schleimhaut-Schicht der Gruppen I und II beobachtet. Epithels (ep). Magengrübchen (f). Muscularis Schleimhaut (m). C, D, G und H)
Pyloric Magendrüsen (g) von Tumorzellen gebildet besetzt den größten Bereich der Magenschleimhaut der Gruppen III und IV. Eine Ansammlung von PMN (Pfeile) innerhalb von den Drüsen beobachtet. Hämatoxylin-Eosin (A-D); Picrosirius-Hämatoxylin (E-H). Bars: 20 &mgr; m. I-L
) Gewebekompartimenten (Epithel, Stroma, andere) Volumen der Magen pyloric Schleimhaut. Die Werte sind als Mittelwert ± SEM der prozentualen relativen Volumen ausgedrückt. Gruppen ohne Läsionen (I und II) präsentiert eine hohe relative Volumen von Epithel (p < 0,05) im Vergleich zu den Gruppen mit Läsionen (III und IV). Die Anwesenheit von Adenokarzinom in den Gruppen III und IV in einem signifikanten Anstieg führte (p < 0,05). Stroma im Vergleich zu den Gruppen I und II
Non-denervierten und denervierten Mägen mit MNNG behandelt (Gruppe III bzw. IV) Veränderungen in der Gewebearchitektur und Anordnung der Fasern der extrazellulären Matrix präsentiert und eine Erhöhung des Durchmessers des Pylorusdrüsen sowie in relativen Volumen des Stroma (Fig. 1C, D, G und 1H). Die Behandlung mit MNNG induziert die Entwicklung von gutartigen und bösartigen Tumoren, insbesondere adenomatösen Polypen und Adenokarzinome (Abb. 1C und 1G) in nicht-denervierten Mägen (Gruppe III). Tiere mit denervierten Mägen und mit MNNG (Gruppe IV) entwickelt Präkanzerosen und malignen Tumoren durch Dysplasie gekennzeichnet, atrophische Gastritis und Adenokarzinom (Abb. 1D und 1H). In beiden Gruppen wurde das Stroma der Adenokarzinome durch die Anwesenheit von Entzündungszellen angereichert, wie Mastzellen, Neutrophile, Lymphozyten und Plasmazellen, die zeigen immunologische Antwort auf Neoplasien (Fig. 2). Jedoch waren die neoplastischen Läsionen der Gruppe IV von kleineren und weniger aggressive Profilen verglichen, wenn der Gruppe III und der entzündliches Infiltrat in dem Tumorstroma lokalisiert war intensiveren, insbesondere bei Tieren, die Adenokarzinome (Fig. 2D) entwickelt. Abbildung 2 histologische Analyse von durch MNNG Behandlung induziert Adenokarzinom. A und B)
Morphologische Ansicht des Adenokarzinoms (AD) in nicht-denerviert (Gruppe III) und denervierten Magen (Gruppe IV). Muskelschicht (M). Intensive Entzündungsinfiltrat (In). C und D)

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