Efectos de la denervación mientérico en las fibras de la matriz extracelular y la distribución de los mastocitos en el estómago normal y lesiones gástricas

Efectos de la denervación mientérico en las fibras de la matriz extracelular y la distribución de los mastocitos en las lesiones gástricas del estómago y normales
Resumen Antecedentes
En este estudio el efecto de la denervación mientérico inducida por el cloruro de benzalconio (BAC) en la distribución de los componentes fibrilares de la matriz extracelular (ECM) y células inflamatorias se investigó en la carcinogénesis gástrica inducida por N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG). Las ratas se dividieron en cuatro grupos experimentales: no denervado (I) y del estómago denervado (II) sin tratamiento MNNG; estómagos no denervado (III) y denervado (IV) tratados con MNNG. Para el análisis histopatológico, histoquímico y estereológicos, secciones de fragmentos gástricas fueron teñidas con hematoxilina-eosina, Picrosirius-hematoxilina, Gomori reticulina, de Weigert de resorcina-fucsina, azul de toluidina y Alcian-azul /safranina (AB-SAF).
Resultados
denervación BAC causa un aumento en la frecuencia de reticular y fibras elásticas en el denervado (grupo II) en comparación con los estómagos no denervado (grupo I). El tratamiento de los animales con MNNG indujo el desarrollo de adenocarcinomas en los estómagos no denervado y denervado (grupos III y IV, respectivamente) con un aumento notable en el volumen relativo de la estroma, la frecuencia de las fibras reticulares y el infiltrado inflamatorio que era más intenso en el grupo IV. Se observó un aumento en la frecuencia de las fibras elásticas en adenocarcinomas de denervado (grupo IV) en comparación con los estómagos no denervado (grupo III) mostraron que la degradación de estas fibras. El desarrollo de las lesiones (grupos III y IV) también se asoció con un aumento en la población de células cebadas, especialmente positivos AB y AB-SAF, estos últimos principalmente en el grupo IV denervado.
Conclusiones
Los resultados muestran una fuerte asociación en la alteración morfológica de los componentes fibrilares ECM, el aumento de la densidad de los mastocitos y el desarrollo de tumores inducidos por MNNG en el estómago de rata no denervado o denervado por BAC. Esto sugiere que el estudio de componentes extracelulares e intracelulares de microambiente tumoral contribuye a la comprensión de la biología del tumor por la acción de la denervación mientérico.
Antecedentes
interacción entre las células tumorales y el estroma circundante es uno de los aspectos clave en el mecanismo de proliferación de células tumorales y la invasión [1]. Las células tumorales hacen remodelar la matriz extracelular (ECM), una mezcla compleja de fibras (colágeno, reticulares y elásticas) y sustancia fundamental que proporciona soporte celular [2], para facilitar la comunicación y el escape del control por el microambiente [3]. El sistema fibrilar de colágeno actúa como un marco de soporte de tejidos, donde las fibras reticulares conectan las fibras de colágeno con las láminas basal de las células epiteliales, musculares y adiposas; el sistema de microfibrillas-elastina desempeña un papel en la distribución uniforme de la tensión para mantener la capacidad de resistencia a las necesidades locales en los tejidos [4].
la integridad estructural y funcional de los sistemas fibrilares colágeno y elastina-microfibrillas son importantes para el estómago para empacar la comida, para secretar enzimas y ácidos para romper los nutrientes primas y para transferir la mezcla al intestino delgado. Las tres tareas dependen de la extrínseca (divisiones simpática y parasimpática del sistema nervioso autónomo) y la inervación intrínseca (sistema nervioso entérico - ENS). Los principales componentes de la ENS son dos redes o plexos de neuronas y fibras nerviosas, el plexo mientérico y submucoso [5]. Se observa la importancia ENS para la regulación de las funciones gastrointestinales después de la aplicación tópica del agente tensioactivo catiónico, cloruro de benzalconio (BAC), en la capa serosa que resulta en la destrucción parcial y selectiva de las neuronas del plexo mientérico [6]. La correlación entre la carcinogénesis y la ENS se ha demostrado en modelos experimentales usando el denervación mientérico por BAC y la inducción de tumores mediante la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) [7] y 1,2-dimetilhidrazina ( DMH) [8] con una reducción en la incidencia y el tamaño de los tumores gastrointestinales.
las células inmunes son potentes fuentes de señales paracrinas a la ENS. En particular, los mastocitos entéricos se encuentran estratégicamente situado y potentes mediadores farmacológicos que actúan en la cara de estímulos inmunológicos que pueden afectar la integridad del tracto gastrointestinal [9]. La unión de anticuerpos a las células cebadas los hace capaces de reconocer antígenos específicos y señalar su presencia a ENS. ENS, a su vez, interpreta las señales químicas de los mastocitos como una amenaza y trata de eliminarlo, proporcionando así una respuesta protectora [9]. La presencia de los mastocitos ha sido descrita en varias neoplasias, con funciones pro o anti-tumorales jugados por sus mediadores bioactivos liberados por la influencia del microentorno del tumor [10 a 12]. La acción de mediadores pro-tumorales tales como histamina, triptasa y quimasa puede promover la migración y la proliferación celular induciendo la expresión de moléculas de adhesión en las células endoteliales y activando de este modo el proceso de la angiogénesis tumoral, la metástasis y la proliferación [13-15]. Por otro lado, algunas citoquinas tales como la interleuquina (IL) -2 y -21, factor de necrosis tumoral (TNF) y la heparina liberadas por las células cebadas, pueden actuar como agentes contra el cáncer mediante la inhibición de su crecimiento [16, 17].
varios estudios han demostrado que durante la carcinogénesis hay un aumento en el número de mastocitos, observada en neurofibromas, lipomas, hemangiomas, tumores de la glándula suprarrenal y la piel [18], carcinomas de células escamosas [19], de la laringe de células escamosas [20] y carcinomas gástricos [21]. En adenocarcinomas gástricos, la pequeña liberación de los contenidos almacenados en los gránulos citoplasmáticos de los mastocitos se asoció con cambios en la láminas basales microvascular, incluyendo espesor irregular, múltiples capas y una débil asociación con las células endoteliales y los pericitos que contribuyen a la remodelación de los vasos sanguíneos [22]. Después de la extirpación quirúrgica del cáncer gástrico, estudios de supervivencia demostraron que los pacientes con aumento del número de mastocitos mostraron un peor pronóstico en comparación con los pacientes con un bajo número de ellos.
El propósito del presente estudio fue determinar los efectos de la ablación química de mientérico neuronas sobre la distribución de las fibras de la matriz extracelular y mastocitos en la mucosa gástrica de los estómagos no denervado y denervado, y en un modelo de carcinogénesis gástrica inducida por la administración MNNG en ratas.
material y métodos diseño experimental

se evaluaron cuatro grupos experimentales. Grupos I (n = 5) y II (n = 5) no denervado y denervado respectivamente, sin la presencia de neoplasias gástricas; grupos III (n = 10) y IV (n = 10) no denervado y denervado, respectivamente, con la presencia de neoplasmas gástricos. Los fragmentos de la región pilórica (antro) de estómago utilizado en este estudio se obtuvieron de las investigaciones llevadas a cabo por POLLI Lopes et al. [7]. Los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las reglas de la Comisión de Cuidados y Usos de los Animales de Laboratorio del Consejo Superior de Investigaciones Científicas de la N.I.H. (EE.UU.) y el Comité de Ética para la Experimentación Animal (CEEA) de FAMERP (Protocolo n ° 6193/2008), São José do Rio Preto, SP.
Animales
Wistar machos
ratas ponderación 100 al 150 g, obtenido a partir de la instalación de animales de la Facultad de Medicina de Ribeirão Preto, Brasil, fueron alojados (4 animales por jaula), a temperaturas comprendidas entre 23 a 25 ° C, y recibieron comida y agua ad libitum
.
denervación gástrico im
Los animales fueron anestesiados con clorhidrato de ketamina y cloruro de tiazina (0,15 ml /0,05 ml /100 g de peso) [23]. El estómago de cada animal se exteriorizó a través de una laparotomía abdominal superior de la línea media y se aisló de la cavidad peritoneal a través de una pequeña fenestración en una hoja de plástico para la aplicación tópica de 0,6% BAC (v /v) (Aldrich Chemical Co. diluyó en solución salina (0,9% NaCl) [7, 24]. los estómagos aislados se envuelve con una gasa empapada en BAC o solución salina y se mantiene húmeda durante 30 min [6, 7, 24]. La superficie serosa de los estómagos se lavó a fondo con solución salina, se devolvieron los órganos a su lugar anatómico y la pared abdominal se sutura. los animales se mantuvieron en jaulas de plástico (4 animales /jaula) bajo condiciones de temperatura controlada, y recibieron comida y agua ad libitum
.
la inducción de neoplasias en mucosa antro gástrico
Dieciséis semanas después de la cirugía, los animales de los grupos III (no denervado) y IV (denervado) ingirieron una solución de N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) disuelto en agua destilada y desionizada a una concentración de 100 mg /L durante 28 semanas. Los animales se sacrificaron 2 meses después de la última ingesta de MNNG y se recogieron los estómagos para el análisis morfológico.
Análisis morfológico y cuantitativo
fibras de matriz extracelulares
se fijaron fragmentos de la región pilórica del estómago (antro) en 4% de formalina tamponada durante 12 horas, se lava en agua del grifo, se deshidrataron en una serie de etanol y se incluyeron en parafina. Para el estudio de la matriz extracelular, las secciones de 4 micras de grosor se tiñeron con hematoxilina-eosina [25], Picrosirius-hematoxilina [26] y Gomori reticulina [27] para el análisis histopatológico, y para la evaluación de colágeno y fibras reticulares, respectivamente. Las fibras del sistema elástico fueron estudiadas a través de Weigert de resorcina-fucsina que tiñe selectivamente las dos fibras elásticas y elaunin (las fibras oxitalán no teñirse porque no se oxidan con anterioridad en este estudio) [28]. Las muestras se analizaron con un microscopio Olympus BX60 luz (Olympus, Hamburgo, Alemania) y los campos microscópicos fueron digitalizadas utilizando la versión Plus Image-Pro 4.5 para Windows (Media Cybernetics, Silver Springs, MD). Cinco áreas aleatorias de la mucosa gástrica se analizaron usando un × 20 objetivo, y la calibración se realizó usando un Olympus clasifica portaobjetos de microscopio. El análisis cuantitativo se determina de acuerdo con el procedimiento de Weibel [29], un sistema de prueba cuadrícula con 168 puntos y 84 líneas de prueba, para comparar el volumen relativo (porcentaje) de los compartimentos de la mucosa gástrica (epitelio, estroma y otros compartimentos, con excepción del epitelio y estroma) para la tinción de hematoxilina-eosina y la frecuencia relativa de reticular y de distribución de fibra elástica (porcentaje) para Gomori reticulina y tinción fucsina resorcin- de Weigert, respectivamente. Los valores se expresan como media ± SEM de volumen relativo (porcentaje) de los compartimentos de la mucosa gástrica y la media ± SEM de frecuencia relativa de reticular y distribución de fibra elástica (porcentaje).
Mastocitos Análisis FODA de los mastocitos en el estómago antro se realizó en secciones teñidas con azul de toluidina al 0,5% para la cuantificación de células intactas y degranulated y, con Alcian Blue-safranina-(AB-SAF) para la cuantificación de la mucosa y los mastocitos del tejido conjuntivo [30, 31]. Para este propósito, se analizaron sesenta áreas al azar de la mucosa gástrica, por animal, con una luz del microscopio Olympus (Olympus, Hamburgo, Alemania) usando un ocular milímetro × 12,5 /16 y un objetivo × 40 de potencia (ZEISS, Alemania) . Los valores se expresan como media ± SEM del número de células por mm Análisis estadístico 2
.
Los datos fueron analizados utilizando el software Statistica 6.0 (StarSoft, Inc., Tulsa, OK). Los datos se presentan como media ± SEM y se sometieron a
t de Student y el análisis de una vía de varianzas (ANOVA), y luego a la prueba de comparaciones múltiples de Tukey-Kramer o Bonferroni. Las diferencias con los valores de P Hotel < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
El análisis histopatológico y la histoquímica de los estómagos de ratas
Inicialmente, se estudiaron fragmentos de pilórico estómagos no denervado y denervado por cloruro de benzalconio (BAC) (grupos I y II, respectivamente) . Análisis de fragmentos de grupo II mostró que la denervación mientérico no cambió la cantidad y distribución de las fibras de colágeno meshwork que rodean las glándulas pilórico en comparación con el grupo I (Fig. 1A y 1B). Este resultado fue confirmado por Picrosirius-hematoxilina mancha (Fig. 1E y 1F) y el análisis cuantitativo del volumen relativo del epitelio y el estroma de la mucosa gástrica de ambos grupos (Fig. 1I y 1J). Figura 1 El análisis histológico de los estómagos de rata. A, B, E y F)
pilórica glándulas gástricas (g) rodeadas de estroma con fibras (s) de colágeno observados en la capa mucosa de los grupos I y II. Epitelio (ep). fosas gástricas (f). mucosa muscular (m). C, D, G y H)
pilórica glándulas gástricas (g) constituidos por células tumorales ocupan la mayor superficie de la mucosa gástrica de los grupos III y IV. Se observó una acumulación de PMN (flechas) dentro de las glándulas. Hematoxilina-eosina (A-D); Picrosirius-hematoxilina (E-H). Bares: 20 micras. I-L
) compartimentos de tejido (epitelio, estroma, otros) volúmenes de la mucosa del píloro gástrico. Los valores se expresan como media ± SEM de porcentaje de volumen relativo. Grupos sin lesiones (I y II) presentan un alto volumen relativo de epitelio (p < 0,05) en comparación con los grupos con lesiones (III y IV). La presencia de adenocarcinoma en los grupos III y IV resultó en un aumento significativo (p < 0,05). De estroma en comparación con los grupos I y II
estómagos no denervado y denervado tratados con MNNG (grupos III y IV, respectivamente) presentado cambios en la arquitectura del tejido y la disposición de las fibras de la matriz extracelular y un aumento del diámetro de las glándulas pilórico, así como en el volumen relativo de la estroma (Fig. 1C, D, G y 1H). El tratamiento con MNNG indujo el desarrollo de tumores benignos y malignos, especialmente los pólipos adenomatosos y adenocarcinomas (Fig. 1C y 1 g) en estómagos no denervado (grupo III). Los animales con estómagos denervado y tratados con MNNG (grupo IV) desarrollado lesiones precancerosas y tumores malignos se caracterizan por la displasia, gastritis atrófica y el adenocarcinoma (Fig. 1D y 1H). En ambos grupos, el estroma de la adenocarcinomas fue enriquecido por la presencia de células inflamatorias, como los mastocitos, neutrófilos, células plasmáticas y linfocitos, que muestra la respuesta inmunológica a neoplasias (Fig. 2). Sin embargo, las lesiones neoplásicas del grupo IV eran de perfiles más pequeños y menos agresivo en comparación con el grupo III, y el infiltrado inflamatorio localizada en el estroma del tumor fue más intensa, especialmente en animales que desarrollaron adenocarcinomas (Fig. 2D). Figura 2 El análisis histológico de adenocarcinoma inducida por el tratamiento MNNG. A y B)
vista morfológico de adenocarcinoma (AD) en no denervado (grupo III) y el estómago denervado (grupo IV). capa muscular (M). intenso infiltrado inflamatorio (A). C y D)
Detalle de infiltrado inflamatorio de estroma tumoral constituido por los mastocitos (flechas negras), neutrófilos (puntas de flecha), linfocitos (flechas verdes) y células plasmáticas (flechas rojas). Azul de toluidina. Bares: 100 m. (Fig. A y B), 10 mm (Fig. C y D)
análisis histoquímico de las secciones pilórica se realizó con tinción de Gomori reticulina y resorcina-fucsina de Weigert para estudiar la distribución ( frecuencia) de la reticular y fibras elásticas en el estroma, respectivamente. Secciones presentados a ambos métodos revelaron distribución similar de las fibras meshwork que rodean las glándulas pilórica del estómago de los grupos I y II (Fig. 3A, B, E y 3F). estómagos no denervado o denervado tratados con MNNG (grupos III y IV, respectivamente), aparentemente presentan una mayor cantidad de fibras reticulares (Fig. 3C y 3D) y fibras elásticas gruesas y cortas altamente desorganizado (Fig. 3G y 3H) en los adenocarcinomas en comparación con sus respectivos grupos de control (grupos I y II, respectivamente). Figura 3 El análisis histoquímico de reticular (A-D) y fibras elásticas (E-H) en los estómagos de ratas. A y B)
los Grupos I y II fibras reticulares rectilíneas y alineados (flechas) que rodea el epitelio (ep) y el estroma (s) presentan. C y D)
fibras reticulares (flecha) de bobinado y, aparentemente, más densas en la base (puntas de flecha) de las glándulas (g). se observó la acumulación de fibras de colágeno entre las glándulas (*). E y F)
Las glándulas se acompañan de una delicada red de fibras elásticas (flecha) y más intensamente marcadas en E. G y H): perfil Un aumento en el espesor de estas fibras, la alteración y fragmentación de las variables fibrilares masas agrupadas de la elastina (flechas) se observan alrededor de las glándulas (g) en comparación con sus respectivos grupos de control (I y II). plata (A-D) de Gomori; Resorcin de Weigert-fucsina (E-H). Bares:. 10 micras
El análisis cuantitativo de las fibras reticulares confirmaron el aumento de este componente extracelular en los adenocarcinomas observados en los grupos III y IV y también mostraron un aumento significativo inesperado en la mucosa del estómago denervado (grupo II ) en comparación con el grupo I (Tabla 1). A pesar de la aparente aumento de las fibras elásticas en el estroma de los animales no denervado y denervado tratados con MNNG (grupos III y IV, respectivamente), no se observó diferencia estadística en su distribución en comparación con grupos de control (I y II) (Tabla 1) . Por otro lado, la denervación mientérico indujo un aumento significativo de las fibras elásticas de estroma gástrico de los grupos II y IV en comparación con los estómagos no denervado de los grupos I y III (Tabla 1). No se observaron diferencias significativas en la distribución de colágeno y fibras elásticas entre las lesiones no malignas y malignas de estromas de los grupos III y IV.Table 1 Evaluación Estereológico de los efectos de la denervación mientérico en el antro gástrico.

distribución de la frecuencia relativa de las fibras (%) 1
Grupos
Sistema de colágeno
elástico Sistema
I
16,87 ± 0,5 13,27 ± 0,5

II
24.06 ± 1.5 *
19,4 ± 0,6 *
III - NT
21,8 ± 0,9 11,2 ± 0,6

III - MT
25,71 ± 0,5 * 11,1 ± 0,4

IV - NT
21,2 ± 1,6 20,2 ± 1,7
&
IV - MT
26,87 ± 1,5 *
19 ± 0,7 &
preparación histológica se realizó como se describe en Materiales y Métodos
. Los valores se expresan como media ± SEM de porcentaje de la frecuencia relativa de las fibras. tumor no maligno (NT); tumor maligno (MT). 1 El análisis estadístico basado en ANOVA seguido por la corrección de Tukey-Kramer. * P < 0.05 vs. grupo I; &Amp; P < 0,05 frente al grupo III.
La cuantificación de los mastocitos en los fragmentos de la región pilórica del estómago
Los mastocitos se analizaron y cuantificaron en la mucosa, submucosa y las capas musculares en todos los grupos experimentales. El análisis del número total de células por fragmento gástrico no mostró diferencias significativas entre la no denervado (I) y (II) grupos denervado (Fig. 4A). Sin embargo, en los grupos no denervado o denervado tratados con MNNG (III y IV, respectivamente), el desarrollo de lesiones benignas o malignas se asoció con un aumento significativo del número de células cebadas en el antro gástrico en comparación con el grupo no denervado (YO). En las capas mucosa y submucosa, el aumento significativo de mastocitos en los grupos no denervado o denervado trató con MNNG, (III y IV) se asoció con un aumento de las células intactas y desgranulados (Fig. 4B). En la capa de músculo, este aumento se asocia principalmente con el gran número de mastocitos intactas (Fig. 4C). Figura 4 Análisis cuantitativo de los mastocitos en el estómago. Los datos representan la media ± E.E.M de sesenta campos analizados por animal como se describe en Materiales y Métodos. No denervado (I) y denervado estómago (II) sin lesiones. -Denervado no (III) y denervado estómago (IV) con lesiones. tumor no maligno (NT). tumor maligno (MT). A): perfil del número total de los mastocitos en el fragmento gástrico. * P < 0.05 vs. grupo I. # P < 0,01 frente a otros grupos experimentales. B y C)
mastocitos desgranulados intacto y en la mucosa, la submucosa y las capas musculares. * P < 0.05 vs. grupo I; #P ≪ 0,05 frente a otros grupos experimentales; δ P < 0,05 vs grupo III - NT (mastocitos intacta); &Amp; P < 0,05 frente al grupo III - NT (mastocitos degranulated). C)
mastocitos intacto y degranulated en la capa muscular. * P < 0.05 vs. grupo I; # P < 0,05 frente a grupo II.
El análisis fenotípico de las células del mástil
Para la caracterización fenotípica de las células cebadas se utilizó el método de Alcian Blue-safranina (AB-SAF). En los animales de no denervado (I) y (II) grupos denervado, hubo un predominio de los mastocitos AB positivo (AB +) en las capas mucosa y submucosa del antro gástrico, la caracterización de estas células como mastocitos de la mucosa (MMC) (Fig. 5A y 5B). En los grupos experimentales tratados con MNNG (III y IV), una alta proporción de AB + y AB-SAF se observaron, este último principalmente en el grupo denervado (IV) (Fig + mastocitos subtipos. 5C y 5D). Fragmentos de la gástrico antro que contiene mesenterio se utilizaron para confirmar la presencia de SAF + células, la caracterización de los mastocitos del tejido conectivo (CTMC) por este método de tinción (Fig. 5E y 5F). Figura 5 Análisis fenotípica de las células cebadas de fragmento gástrico. A y B)
capa submucosa del (grupo I no denervado) y denervado (grupo II) que muestra el estómago mastocitos con gránulos citoplasmáticos positivas para Alcian-azul (flechas), que caracterizan fenotipo mastocitos de la mucosa - en detalle del panel A . C y D) sobre Two población de células cebadas se señaló en las lesiones gástricas del estómago) del grupo IV denervado (no denervado (grupo III) y células: Alcian-azules positivas mástil (flechas negras) y Alcian azul /safranina mastocitos positivos (flechas rojas). Las células E y F)
mástil con gránulos positivos safranina (flechas) se observan en el mesenterio, la caracterización de los mastocitos del tejido conectivo. Alcian azul /método de safranina. Bares: 10 m (Fig A-F.); 5 micras (detalle Fig. A)
. Francia El cuantificación total de tres subtipos de células cebadas (AB +, AB-SAF + y SAF +) confirmó las observaciones morfológicas, que muestra un predominio de AB + células en el fragmento pilórica en todos los grupos experimentales (Tabla 2). En los grupos no denervado y denervado tratados con MNNG (III y IV, respectivamente), este subtipo de células aumentó significativamente en comparación con el grupo no denervado (I). En estómagos denervado tratados con MNNG (grupo IV), subcelular AB-SAF + también fue significativamente mayor en las lesiones malignas en comparación con las lesiones en el grupo no tratado con denervado MNNG (III) .Tabla 2 Densidad de los mastocitos con diferentes fenotipos en el antro gástrico.

pilórica Fragmento
Grupos
AB +

SAF +
AB + + SAF
I
8 ± 2
1 ± 1 página 4 ± 1

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