La prognosi importanza di HER-2 /neu /amplificazione in pazienti cinesi con cancro gastrico curativo resezione dopo la sperimentazione clinica ToGA

La prognosi importanza di HER-2 /neu /amplificazione in pazienti cinesi con cancro gastrico curativo resezione dopo il trial clinico ToGA
Abstract
sfondo
HER-2 /neu-terapia mirata è stato utilizzato con successo in gastrico avanzato il cancro, ma il ruolo di HER-2 /neu nella prognosi del cancro gastrico non è ancora chiaro. In questo studio, abbiamo studiato la correlazione tra HER-2 /neu espressione e l'amplificazione, così come la loro associazione con clinica risultati in pazienti con carcinoma gastrico curativo resezione
Metodi
abbiamo costruito blocchi di microarray di tessuti contenenti >. 70% di tessuto cancro gastrico e abbinati tessuto gastrico normale adiacente per 227 pazienti. Espressione dei HER-2 /neu proteine ​​in questi campioni è stato analizzato utilizzando colorazione immunoistochimica. Amplificazione di HER-2 /neu è stata analizzata anche per gli stessi campioni utilizzando fluorescence in situ
ibridazione. I dati sulle caratteristiche clinico-patologiche e fattori prognostici rilevanti in questi pazienti sono stati analizzati.
Risultati
dei campioni di cancro gastrico 227, 11,89% sono risultati positivi per HER-2 /neu /amplificazione con il nuovo sistema di punteggio. HER-2 /neu /amplificazione è strettamente correlato al tipo Lauren, grado di differenziazione, dimensioni del tumore e metastasi linfonodali. HER-2 /neu /amplificazione previsto scarsa sopravvivenza in analisi univariata, ma non in un modello di rischio proporzionale di Cox.
Conclusione
HER-2 /neu iperespressione /amplificazione non era un predittore indipendente per la sopravvivenza nei pazienti con curativo resezione cancro gastrico.
Parole
FISH cancro gastrico HER-2 /neu IHC Prognosi Sfondo
Sebbene l'incidenza di cancro gastrico è in calo in tutto il mondo, è ancora relativamente alta in Cina con 420.000 pazienti di nuova diagnosi ogni anno. Il tasso di mortalità di cancro gastrico in Cina è al terzo posto tra tutti i decessi per cancro, con 320.000 pazienti per il periodo 2004 al 2005 [1]. Sebbene ci sia stato un grande miglioramento nella diagnosi precoce del cancro gastrico, in combinazione con i recenti progressi delle tecniche chirurgiche e completa utilizzazione della chemioterapia e la radioterapia, il tasso di sopravvivenza a 5 anni per il cancro gastrico rimane a partire da 20% al 30% [ ,,,0],2]. la terapia mirata
è una nuova tendenza nel trattamento del cancro per migliorare la sopravvivenza globale nei pazienti con tumore. Per quanto riguarda il cancro gastrico, terapia mirata molecolare è anche guadagnando di stato. La terapia antiangiogenica e la terapia del recettore del fattore di crescita epidermico anti-sono emerse come una nuova speranza [3], in particolare l'anti-HER-2 farmaco, il trastuzumab. Secondo la sperimentazione clinica ToGA riportato nel 2010 [4], i pazienti con HER-2 /neu sottoposti a chemioterapia e trastuzumab ha avuto un significativo la sopravvivenza globale mediana più lunga di 13,8 mesi, senza effetti collaterali negativi aggiuntivi. Shitara et al
. anche riferito che i pazienti che erano HER-2-positivo con carcinoma gastrico avanzato hanno una prognosi migliore rispetto ai pazienti che erano negativi per HER-2 quando vengono trattati con trastuzumab [5]. Tutti questi indicano che il /la terapia HER-2 neu mirati ha un grande potenziale per migliorare il trattamento del cancro gastrico.
Oncogene HER-2 /neu è stato originariamente scoperto in neuroglioblastomas ratto indotta chimicamente [6] ed è situato sul cromosoma 17q21 e codifica per una glicoproteina transmembrana di 185kD. La proteina è costituita da un dominio extracellulare ligand-legame di 653 aminoacidi, una sola regione di membrana-spanning di 654 a 675 aminoacidi, e un citoplasmatica della proteina tirosina chinasi dominio di 675 a 1.255 amminoacidi. È uno dei membri del recettore del fattore di crescita epidermico umano (HER) famiglia che comprende HER-1 (recettore del fattore di crescita dell'epidermide), HER-2 /neu, HER-3 e HER-4 [7]. Tra questi, HER-2 /neu svolge un ruolo importante nello sviluppo normale, differenziazione e apoptosi della cellula. amplificazione genica e sovraespressione di HER-2 /neu sono stati riportati in molti tipi di cancro, compreso quello delle ovaie [8], polmone [9] e della prostata [10], oltre al seno [11]. Ad esempio, è stato dimostrato che HER-2 overexpression /neu è stata rilevata in circa il 10% al 34% dei tumori al seno invasivo ed è stata associata con prognosi infausta. Anche se HER-2 /neu è considerato un fattore prognostico indipendente per il cancro al seno, il suo ruolo prognostico nel carcinoma gastrico rimane ancora controverso perché diversi studi hanno generato risultati contrastanti [12-16].
Per valutare l'associazione tra lo stato del suo -2 /neu e la prognosi dei pazienti cinesi con cancro gastrico, abbiamo condotto un (pensiamo "la" è meglio, vuol dire questo studio) studio per esaminare sia l'espressione e l'amplificazione di Her-2 /neu nei tumori del cancro gastrico curativo asportato e correlati queste misure ai risultati clinico-patologici e prognostici dei pazienti.
Metodi
pazienti e la raccolta di informazioni clinicopatologica
Un totale di 227 pazienti con cancro gastrico dagli archivi patologia dell'Ospedale del Popolo Yangzhong sono stati inclusi in questo studio tra il 2002 e il 2004. Tutti i pazienti (ad eccezione di quelli classificati come T1N0M0) aveva subito un intervento chirurgico curativo e ha ricevuto una simile adiuvante regime di chemioterapia (5-fluorouracile e cisplatino). variabili clinicopatologici tra cui l'età, il sesso, il tipo istologico e stadio patologico sono stati raccolti esaminando le cartelle cliniche e registri di patologia. Tra questi pazienti, 157 erano uomini e 70 erano donne, con una fascia di età tra i 24 ei 79 anni (una media di 60 anni). siti tumorali inclusi 28 antro, 50 corpus e 149 Cardia. I pazienti sono stati seguiti dalla data di chirurgia fino alla morte, o censurati al 31 dicembre 2008, che ha comportato un periodo di follow-up di 1 a 108 mesi (una mediana di 64 mesi). Lo studio è stato approvato dal nostro Comitato etnica istituzionale (equivalente a una scheda di revisione istituzionale). Dato che questo era uno studio retrospettivo utilizzando campioni di tessuto d'archivio, il Comitato Istituzionale Etnica rinunciato la necessità del consenso informato scritto
Tissue costruzione microarray
In breve, H &.; sezioni E macchiati sono stati fatti da sezioni tumorali primarie per definire due regioni tumorali rappresentative e tessuti gastrici normali adiacenti. regioni tumorali rappresentative sono state definite come aree tumore solido che contengono le cellule tumorali oltre il 75%, senza necrosi. tessuti gastriche normali sono stati selezionati in modo casuale adiacente ad un tumore con una distanza di più di 5 cm, evitando le aree di sanguinamento. Tumore tipizzazione e la classificazione sono stati eseguiti secondo criteri Lauren e l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). Tutti i pazienti con cancro gastrico sono stati in scena con la settima edizione del tumore-Node-Metastasi (TNM) sistema di stadiazione Unione Internazionale Contro il Cancro. cilindri tissutale (1,5 mm di diametro) sono poi stati perforati dalle regioni definite del blocco utilizzando un microarrayer tessuto (Gentury, IL, USA) e portati in blocchi di paraffina destinatario. sono state fatte due terne di paraffina microarray tissutale (TMA) blocchi. Sezioni dei blocchi TMA risultanti sono stati trasferiti vetrini. Ci sono stati un totale di due set di TMA, che contiene 227 macchie di tessuto tumorale e 135 normali macchie tessuto gastrico adiacenti ciascuno, disponibili per questo studio (in collaborazione con Shanghai biochip, Shanghai, Cina).
Immunoistochimica
immunoistochimica (IHC) colorazione per HER-2 neu /è stato condotto su sezioni TMA. , le sezioni in paraffina fissati in formalina sono stati alla rimozione della cera in xilene e reidratate attraverso alcool classificato. attività perossidasica endogena è raffreddata da perossido di idrogeno al 3%, la sezione è stato lavato in acqua e l'antigene recuperato e posto in tampone citrato. Le sezioni sono state lavate con soluzione salina tampone fosfato, pH 7,2. L'anticorpo monoclonale di topo primaria contro umana HER-2 /neu proteine ​​(MAB-0198, Maxin Biotech, Fujian, Cina) è stato applicato per 1 ora in incubatrice a 37 ° C. Anti HER 2--anticorpo (Dako REAL, En Vison, HRP coniglio /mouse, Dako, Carpinteria, CA, USA) è stato poi applicato. soluzione diaminobenzidina è stato utilizzato come cromogeno.
fluorescenza in situ
ibridazione in situ fluorescente

ibridazione (FISH) analisi è stato applicato alle sezioni. L'amplificazione del HER
-2
gene è stato determinato utilizzando un FISH Vysis a due colori, dual-fusion insieme sonda traslocazione acquistato da Abbott Molecular Inc. (Desplaines, IL, USA). In breve, le sezioni sono state deparaffinate, disidratato, e poi incubate in bisolfato di sodio al 30% per 20 min a 45 ° C. Dopo essere stati lavati in 2 × SSC Sodio soluzione tampone citrato-cloridrico}, vetrini sono stati trattati con proteinasi K a 37 ° C per 25 min. Poi ibridazione è stata effettuata una notte a 42 ° C in una camera umida, seguito da lavaggi post-ibridazione in soluzione denaturazione e 0,1% NP-40 con 2 × SCC Sodio soluzione tampone citrato-cloridrico} a temperatura ambiente. Infine, i vetrini sono stati lavati e di contrasto con 0,2 mmol /L 4'-6-diamidino-2-phenylindole e esaminati al microscopio confocale a scansione laser LSM 510 (Carl-Zeiss, Jena, Germania).
Punteggio di immunoistochimica e fluorescenza in situ ibridazione

HER-2 immunocolorazione è stato valutato con il seguente sistema di punteggio adottato da Hofmann nel trial clinico ToGA: segnare 0, nessuna marcatura di membrana o < 10% delle cellule colorate; 1+, debole /appena percettibile reattività di membrana nel 10% delle cellule o superiori o reattività soltanto per una parte della membrana cellulare; 2+, debole a moderata reattività membranosa completa o basolaterale nel 10% delle cellule tumorali o superiore; e 3+, forte reattività membranosa completa o basolaterale nel 10% delle cellule tumorali o superiore. Decine di 0 e 1 + sono stati considerati negativi per HER-2 /neu, e decine di 3+ ​​sono stati considerati positivi. Decine di 2+ sono stati considerati sovraespressione se FISH ha confermato l'amplificazione [4, 17]. amplificazione genica è stata definita come nuclei cellulari tumorali che presentano un rapporto di HER-2 /neu per CEP17 (sonda centromerica 17) ≥2, o quando è stato osservato un cluster HER-2 /neu segnale.
Tutti i campioni su sezioni TMA dal tumori gastrici sono state esaminate da due patologi indipendentemente per determinare i punteggi di IHC. Per i pareri discordanti, i campioni sono stati riesaminati dai due patologi per ottenere un punteggio di consenso. Analisi statistica

dati categorici sono stati analizzati utilizzando χ
2
statistiche. La probabilità di sopravvivenza da diversi sottogruppi è stato calcolato utilizzando il metodo di Kaplan-Meier, e la significatività statistica è stata analizzata mediante il log-rank test. L'analisi multivariata è stata effettuata utilizzando il modello di rischio proporzionale di Cox con aggiustamento per covariate di identificare indicatori primari prognostici che erano indipendentemente associati con la sopravvivenza. Tutte le statistiche sono state due lati, ad un livello significativo di P
< 0,05, utilizzando il pacchetto di software statistico SPSS per Windows (versione 13.0, SPSS, Inc., Chicago, IL, USA): Risultati <. br> HER-2 /neu stato espressione proteica e variabili clinicopatologiche in 227 casi di carcinoma gastrico
HER-2 /neu espressione proteica in tessuti di cancro gastrico è stato determinato IHC per 227 pazienti. Come mostrato in figura 1, l'immunocolorazione rivelato che l'espressione era rilevabile solo nelle membrane cellulari delle cellule tumorali, ma non nelle adiacenti normali cellule epiteliali gastriche. Di questi 227 tumori, 189 casi (83.41%) ha segnato 0; 4 casi (1,75%) ha segnato 1+; 11 casi (4,80%) ha segnato 2+; e 23 casi (10,04%) ha segnato 3+. Tra 11 casi di 2+, 4 casi (36,4%) sono risultati positivi per l'amplificazione. Pertanto, 27 casi (11,89%) hanno avuto HER-2 /neu. La correlazione tra HER-2 /neu livelli di espressione della proteina e variabili clinico-patologiche sono riassunti nella Tabella 1. Rispetto ai tumori senza sovraespressione, i tumori del cancro gastrico con HER-2 /neu mostravano prevalentemente ben o istologico moderatamente differenziato dalla classificazione WHO ( P
< 0,05) e un tipo di istologia intestinale dalla classificazione Lauren (P
< 0,05). HER-2 iperespressione /neu è stato anche associato con la dimensione del tumore e metastasi linfonodali (P
< 0,05). Tuttavia, differenze nei livelli di espressione per età, sesso, localizzazione del tumore, la profondità di invasione, stadio TNM, invasione vascolare o tipo Borrmann trovato per tutti (P ​​
> 0,05). Figura 1 colorazione immunoistochimica per HER-2 /neu espressione nei campioni tumorali da pazienti con cancro gastrico. (A) colorazione membrana in normale epitelio gastrico per HER-2 /neu (0+). (B) colorazione di membrana debole a > il 10% delle cellule tumorali (1+). (C) moderata marcatura completa della membrana in > il 10% delle cellule tumorali (2+). (D) Forti membrane completi colorazione a > il 10% delle cellule tumorali (3+). (H & E; ingrandimento originale, × 4, × 40)
Tabella 1 Confronto tra le caratteristiche clinico-patologici secondo il HER-2 iperespressione /amplificazione
caratteristiche clinico-patologiche
HER-2 iperespressione /amplificazione <. br>
HER-2 /neupositive (n = 27)
HER-2 /neunegative (n = 200)
P
Età
0,151
< 65 anni
18
96
≥65 anni
9
104
Sex
0,765
maschio
18
139
femminile
9
61
Lauren
0.001
intestinale 26
118
diffondono
0
49
mista
1
33
classificazione WHO
0.001
W /D
9
24
M /D
16
97
P /D 2
79
Le dimensioni del tumore
0.002
≥5 cm
18
72
< 5 cm
9
128
Tumor posizione
0,258
cardias
21
128
corpus
5
45
antro
1 27
Invasion profondità
0,322
T1
1 19
T2 4
32
T3
22
149
linfa nodo
0,022
presente
20
118
assente 7
82
stadio TNM
0.320
I 3
43
II
6
52
III
18
105
invasione vascolare
0.241
presenti 4
16
assente
23
184
Borrmann
0.133
I 4
26
II
17
102
III
6
64
IV
0
8
M /D: moderatamente differenziato; P /D: scarsamente differenziato; W /D:
ben differenziato OMS:. Organizzazione Mondiale della Sanità
HER-2 /neu stato di amplificazione in 227 casi di carcinoma gastrico
Nel analisi FISH, l'amplificazione del gene è stato rilevato in tutti i campioni di tumore (Figura 2 ). Quando i risultati di FISH e IHC sono stati confrontati (Tabella 2), IHC 0+ o 1+ campioni non hanno mostrato di amplificazione (0%), mentre 23 tumori con 3+ immunocolorazione tutti hanno mostrato di amplificazione (100%). Tuttavia, tra i 11 tumori con 2+ immunostaining, ha mostrato solo l'amplificazione (36.37%). Ci sono stati 27 casi (11,89%) di HER-2 di amplificazione /neu nelle stesse tumori che avevano sovraespressione. Figura 2 ibridazione in situ fluorescente di HER-2 /neu di amplificazione (ingrandimento originale, × 60).
Tabella 2 Correlazione tra sovraespressione e l'amplificazione per HER-2 /neu
FISH
IHC
0 n = 189
1+ n = 4

2+ n = 11
3+ n = 23
totale n = 227
No amplification
189
4
7
0
227
Amplification
0
0
4
23
27
Amplification tasso (%)
0 0

36.40
100

• Preoperatoria multidetector-fila tomografia computerizzata messa in scena di scansione per preoperatoria multidetector fila tomografia computerizzata cancro gastrico linfatico spread
• L'associazione tra la durata a base di fluoropirimidine chemioterapia adiuvante e la sopravvivenza in stadio II o III cancer