Caratteristiche del virus di Epstein Barr varianti associate con carcinoma gastrico in Tunisia del sud

Caratteristiche del virus di Epstein Barr varianti associate con carcinoma gastrico in Tunisia meridionale
Abstract
Backgroud
EBV-associata gastrica carcinoma (EBVaGC) ha un distinte caratteristiche cliniche e la sua prevalenza è variabile in tutto il mondo.
Risultati
Per determinare la prevalenza di EBVaGC in Tunisia, piccoli RNA (EBER) espressione EBV-encoded è stata valutata in 81 gastrica carcinoma esemplari (GC). L'espressione EBER nucleare è stata rilevata in 12 su 81 casi GC (14,81%) e concordanza tra la gamma punteggio di EBER colorazione e il numero di copie di DNA EBV come stima QPCR si osserva. D'altra parte, abbiamo trovato che EBVaGC fortemente correlata con l'età alla diagnosi, e debolmente con differenziazione del tumore e l'invasione venosa.
Inoltre, i campioni sono stati sottoposti EBVaGC per determinare i polimorfismi EBV DNA. I nostri risultati mostrano un profilo genetico unico dei ceppi EBV quanto riguarda i tipi A e D, il prototipo F, il mantenimento di Xho I portale restrizione e il 30 bp variante del-LMP1. In base ai nostri precedenti studi sul carcinoma nasofaringeo (NPC), abbiamo suggerito che i ceppi EBV associati a GC e NPC condiviso alcune somiglianze nei pazienti tunisini.
Conclusione
La prevalenza di EBVaGC è del 14.81% nella Tunisia meridionale e che comune ceppo EBV sono associati sia con NPC e GC che sono probabilmente diverse da ceppi asiatici. I nostri risultati supportano quindi una certa distribuzione geografica dei ceppi EBV che non è limitato ai tumori EBV-associati.
Parole
gastrica carcinoma EBV EBER polimorfismi Sfondo
carcinoma gastrico (GC) è la seconda causa di morte per cancro in tutto il mondo [1]. L'incidenza di GC varia da una regione geografica all'altra, suggerendo che i fattori genetici e ambientali compresi Helicobacter pylori
infezione sono considerati per contribuire alla carcinogenesi gastrica [2, 3]. Nel sud della Tunisia, l'incidenza annuale di GC varia da 2,6 a 4,8 /100 000 persone [4]. Nei pochi anni passati, molte relazioni hanno esplorato l'associazione tra virus di Epstein-Barr (EBV) e GC [5-9]. Il GC EBV-associato (EBVaGC) è stata evidenziata la presenza di espressione uniforme EBV-encoded piccolo RNA (EBER) in cellule di GC [10], la rilevazione di episomi EBV monoclonali nelle cellule GC [11] e l'aumento di siero anticorpi contro l'antigene del capside virale [12]. L'incidenza di EBVaGC varia ampiamente da 2 a 18% come riportato da studi precedenti [13-20]. Inoltre, le caratteristiche cliniche di EBVaGC includono predominanza maschile, età relativamente più giovane e la posizione nello stomaco prossimale [9, 21]. Il EBVaGC mostra un tasso inferiore di coinvolgimento dei linfonodi e ha una prognosi relativamente favorevole rispetto a un EBV-negativi [22].
In EBVaGC, infezione di cellule tumorali è caratterizzata da un modello di tipo I della latenza, in cui la espressione dei geni virali latenti è limitato a Epstein-Barr antigene nucleare (EBNA) -1, EBER, proteina di membrana latente LMP-2A e trascrizioni dal Bam
HI Una cornice verso destra (BARF) -0 e -1 [11, 23]. Dal momento che i prodotti EBV di tipo I infezione latente hanno dimostrato di essere coinvolto in tumorogenesi EBV-mediata, è stato suggerito che il processo oncogeno in EBVaGC potrebbe essere guidato da meccanismi diversi da quelli del GC convenzionale. Successivamente, EBVaGC tumore maligno potrebbe essere considerato come entità diverse tra GC che richiede una maggiore attenzione per migliorare la cura del paziente.
Il presente studio è stato condotto con l'obiettivo di determinare la prevalenza di EBVaGC nel sud della Tunisia e, successivamente, di analizzare i polimorfismi EBV specifici il tumore isola.
Materiali e metodi
le caratteristiche del paziente
Un totale di 81 carcinomi gastrici primari sono stati raccolti, tra gennaio 1999 e dicembre 2009 pazienti sottoposti a resezione chirurgica radicale presso il Dipartimento di Chirurgia Digestiva di Habib Bourguiba University Hospital (Sfax, Tunisia). Tutti i pazienti hanno dato consenso informato prima della raccolta del campione secondo le linee guida istituzionali. Nessuno dei pazienti ha avuto la chemioterapia pre-operatoria o post-operatoria. parametri clinico-patologici come il sesso, l'età, sito anatomico, tipo istologico, stadio patologico, le dimensioni del tumore e l'invasione venosa sono stati valutati esaminando le cartelle cliniche e registri patologiche. Al momento dell'intervento, l'età dei pazienti variava da 18 a 94 anni (media: 59,58 anni). La sede anatomica del tumore è stata determinata in base alla posizione predominante della lesione come cardias (n = 8), il corpo (n = 22), e antro (n = 48). I sottotipi istologici sono stati classificati in base ai criteri di Lauren [24] come tipo intestinale (n = 47) e il tipo di diffuso (n = 34), ma anche di Organizzazione Mondiale della Sanità come scarsamente differenziate (n = 43), moderatamente differenziato (n = 26) e ben differenziato (n = 9). Lo stadio clinico della malattia è stato determinato in base al tumore, il nodo e metastasi (TNM) la classificazione del Joint Committee on Cancer [25]. La nostra coorte contiene 9 pazienti in stadio I o II e 47 pazienti in stadio III o IV.
Ibridazione in situ
EBV è stato identificato mediante l'espressione di piccoli RNA EBV-codificato (EBER). In breve, in situ
ibridazione (ISH) test è stato eseguito su 3 micron sezioni di paraffina-block con sonde EBV oligonucleotidi complementari al EBER-1 e -2 in base alle istruzioni del produttore (PNA kit di rilevamento ISH, Dako Cytomation). I segnali di ibridazione sono state visualizzate con diaminobenzidina (DAB) e il segnale positivo nucleare è stato riconosciuto come colorazione nucleare marrone scuro al microscopio ottico. Come controllo positivo, è stata utilizzata la sezione da una nota di tessuto NPC EBER-positivo. La colorazione è stato segnato da 1 a 3 in base alla percentuale di nuclei cellulari tinto in sezioni di tessuto. Punteggio 3 è stato attribuito quando è stata osservata segnale positivo in più del 75%, gol del 2 a 75 al 50% e notare 1 in meno del 50% delle cellule. Estrazione del DNA

DNA è stato estratto da fissati in formalina, paraffina tessuti incorporati. Dopo l'identificazione del tumore su ematossilina-eosina macchiato di diapositive, le aree tumorali sono stati raschiati da 40 micron di spessore sezioni di paraffina. I materiali raccolti sono stati de-cera lavaggio in xilene e risciacquati in etanolo. tessuti secchi sono stati digeriti con proteinasi K in presenza di SDS a 55 ° C durante la notte, seguito da estrazione con fenolo /cloroformio come precedentemente descritto [26]. La quantità di DNA è stata verificata spettrofotometro e conservato a -20 ° C per un ulteriore uso.
PCR-RFLP e sequenziamento
cinque regioni del genoma EBV sono stati mirati per l'analisi del polimorfismo mediante PCR, RFLP o sequenziamento. I polimorfismi studiati comprendono il tipo A o B nel gene EBNA-3C, il tipo D C o nella regione /I1 BamHI-W1, il prototipo F o variante f nella regione BamHI-F, la perdita di un Xho
mi sito nel primo esone di BNLF1gene (Xho
variante I-perdita) e la cancellazione di 30 bp nel terzo esone dello stesso gene (30 bp del-LMP1 variante). Genotipizzazione è stata effettuata su DNA da pazienti GC EBV-positivo e il controllo, analizziamo 10 campioni di DNA da mucosa nasofaringea positivo per EBV.
Amplificazione PCR è stata effettuata su DNA 200 ng in una miscela di reazione finale di 50 microlitri contenente 0,2 mM di ciascun primer, 200 micron di dNTP, 2 mM MgCl2, 1X PCR Buffer e 1 unità di Taq DNA polimerasi (Fermentas). Le sequenze primer e le dimensioni dei prodotti di PCR sono riportati nella tabella 1 1.Table Riassunto delle sequenze di primer che comprende i tipi di EBV e varianti
geni EBV e regioni
(tipi o varianti )
sequenze primer (5'-3 ')
formato del prodotto (bp)
EBNA-3C gene
(tipo A o B)
F : AGAAGGGGAGCGTGTGTTGT
R: GGCTCGTTTTTGACGTCGGC
prodotti di PCR
153: tipo A
246: di tipo B
BamH1-W regione
(tipo C o D)
F: ACCTGCTACTCTTCGGAAAC
R: TCTGTCACAACCTCACTGTC
PCR + Bam HI
digestione
205: tipo C
130 + 75: tipo D
BamH1-F regione
(f variante)
F: TCCCACCTGTTACCACATTC
R: GGCAATGGGACGTCTTGTAA
PCR + Bam HI
digestione
198: F variante
127 + 71: f variante
esone 1 del gene BNLF1
(XhoI variante)
F: ACAATGCCTGTCCGTGCA
R: AGAAACACGCGTTACTCT
PCR + Xho
I digestione
497: Xho
I-
340 + 157: Xho
I +
esone 3 di BNLF1 gene
(30bpdel-LMP1)
F: TGGAGGGAGAGTCAGTCAGGC
R: ATTGACGGAAGAGGTTGAAAAC
prodotti di PCR
224: 30bpdel-LMP1
254: WT-LMP1
F: primer forward
R: Reverse Primer
il C /D e F /f tipizzazione si basa sul BamHI
digestione di ogni prodotto di PCR. Le reazioni enzimatiche sono state eseguite in un volume finale di 20 ml contenente 10 ml di prodotto di PCR, tampone di digestione 1X e 10 unità di BamHI
enzima (Fermentas). Dopo incubazione per una notte a 37 ° C, i prodotti sono stati analizzati su gel di agarosio al 2% e visualizzati mediante colorazione con etidio bromuro, sotto illuminazione UV. Le stesse condizioni di cui sopra sono stati valutati per identificare il XhoI portale nel primo esone di BNLF1gene. DNA da B95.8 (GenBank No.V01555 adesione) e linea cellulare C666-1 (GenBank adesione n ABV54173) sono stati utilizzati come controllo per i tipi di EBV e varianti. La linea cellulare C666-1 derivata da un NPC cinese che ospita i tipi A /C, variante F, Xho
variante I-perdita e 30 bp variante del-LMP1.
Sequenziamento del DNA è stata eseguita sui prodotti di PCR purificati di il terzo esone del gene BNLF1 utilizzando il kit di gel SV Purificazione (Promega). sequenziamento del ciclo è stata effettuata utilizzando il kit ciclo di sequenziamento ABI PRISM Big Dye Terminator (Applied Biosystems) secondo le istruzioni del produttore. Tutte le sequenze sono state eseguite bidirezionale. I risultati di sequenziamento sono stati poi confrontati con le sequenze EBV di B95.8 (GenBank No.V01555 adesione), NPC cinese (cellule Cao [27], le cellule C666-1 (GenBank adesione n ABV54173) e NPC10 biopsia [28] e tunisini esemplari NPC (CV4, CV5 e CV6 [29]).
tempo reale PCR quantitativa
Q-PCR mira la regione BamHI-W del genoma EBV è stata eseguita su campioni 12 EBV-positivo che mostrano colorazione nucleare e 6 EBV campioni negativi. le reazioni sono state effettuate su un ™ sistema PCR Real-time iCycler iQ (BioRad), utilizzando primer che fiancheggiano la regione BamHI-W del genoma EBV e sonda TaqMan come precedentemente descritto [30]. Aliquotare di 1 mg DNA è stato utilizzato per l'amplificazione in un volume di reazione totale di 25 microlitri contenente 300 nM di ciascun primer, 25 nM di sonda TaqMan, tampone 1X PCR, 2 mM MgCl2, 200 mM di ogni dNTP e 1 unità di GoTaq Hot Start polimerasi (Promega). la curva standard è stata preparata con diluizioni seriali di 10 volte del plasmide ricombinante pGEMT /BamHI-W. I campioni sono stati analizzati in duplicato ei risultati in media per calcolare EBV carica virale espressa in copie per reazione.
Analisi statistica
analisi statistica è stata eseguita con SPSS 13.0 programma software statistico per Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois, Stati Uniti d'America ). P-valore inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Risultati
Prevalenza di EBVaGC ed associazioni con le caratteristiche clinico-patologici
Ottanta uno esemplari di GC sono stati testati per la positività EBV utilizzando il EBER in situ
ibridazione. La frequenza di EBVaGC era 14,8% (12 su 81), in cui il segnale positivo EBER è stato limitato a nuclei delle cellule di carcinoma (Figura 1). I provini EBVaGC hanno una percentuale variabile di cellule tumorali colorate mostra più del 75% in sei casi (punteggio 3), tra il 50 e il 75% in tre casi e meno del 50% nei tre casi rimanenti. I casi EBVaGC sono stati associati con l'età alla diagnosi (p = 0,009
, tabella 2). In effetti, 9 dei 12 pazienti con EBVaGC avevano un'età compresa tra 45 e 60 anni. Inoltre, una tendenza verso associazione è stata osservata con la differenziazione del tumore e l'invasione venosa come valore staticamente significativo non è stato raggiunto (P
= 0,07 e P = 0,09
rispettivamente, Tabella 2). Figura 1 Rilevazione di Epstein-Barr virus codificati piccoli RNA (Ebers) per ibridazione in situ nei tessuti di carcinoma gastrico. A: H & E colorazione. B: Intenso EBER colorazione positiva (immuno-score 3+) nei nuclei delle cellule tumorali (ingrandimento originale × 40). C: Moderato EBER colorazione positiva (immuno-score 2+) nei nuclei delle cellule tumorali (ingrandimento originale × 40). D: Debole EBER colorazione positiva (immuno-score 1+) nei nuclei delle cellule tumorali (ingrandimento originale × 40). E: Controllo positivo rappresentato da un noto tessuti NPC EBER-positivo (ingrandimento originale × 40). F: tessuti carcinoma gastrico negative per EBER (ingrandimento originale × 10)
Tabella 2 Correlazione tra EBVaGC e parametri clinico-patologici
caratteristiche cliniche
N
EBV espressione *


negativo (%)
positiva (%)

Sesso
Maschio
48
42 (87,5)
6 (12,5)
femminile
33
27 (81,8)
6 (18.2)
p
-value
0.47
Età
< 45
17
17 (100)
0 (0)
45-60
30
21 (70)
9 (30) Hotel > 60
34
31 (91,2) Pagina 3 (8.8)
p
-value
0.009
TNM
I-II
9
9 (100)
0 (0)
III-IV
47
40 (87,1)
7 (14,9)
p
-value
0.216 sito
anatomica
Antrum
48
41 (85,4)
7 (14,6)
corpo
22
19 (86,4)
3 ( 13.6)
Cardia Pagina 8 Pagina 6 (75) Pagina 2 (25)
p
-value
0.72
differenziazione
Poor
43
36 (83,7)
7 (16,3)
Moderato
26
25 (96,2)
1 (3,8)
Bene
9 Pagina 6 (66,7) Pagina 3 (33,3)
p
-value
0.075
tipo Lauren
intestinale
47
38 (80,9)
9 (19.1)
Diffondere le
34
31 (91,2) Pagina 3 (8.8)
p
-value
0,197 dimensioni del tumore

< 5 cm
9 Pagina 8 (88,9)
1 (11.1)
> 5 cm
65
54 (83,1)
11 (16,9)
p
-value
0,658
invasione venosa
Negatif
61
54 (88,5)
7 (11,5)
Positif
18
13 (72,2)
5 (27,8)
p
-value
0.09
* espressione EBV è stata determinata dalla EBER ibridazione in situ. casi negativi esibito un punteggio = 0 e positivi casi hanno mostrato un punteggio = 1 + a 3+ valutazione quantitativa
di EBV in GC
saggio di Q-PCR è stata eseguita su 18 campioni di carcinoma gastrico.; tra i quali 12 visualizzati EBER positività limitato a cellule nuclei e 6 sono risultati negativi.
Il numero di copie di DNA virale è stato stimato con il metodo di quantificazione assoluta utilizzando diluizioni seriali di ricombinante DNA plasmidico (pGEMT /BamHI-W), come standard esterno. curva standard è stata stabilita tracciando il plasmide di partenza il numero della copia contro il ciclo soglia (Ct), mostrando una quantificazione lineare su un range da 10 6 a 10 copie per reazione.
esempi rappresentativi sono mostrati in figura 2 dove i casi GC10 e GC3 (Ct = rispettivamente 15 e 22) mostrano una forte colorazione nucleare EBER mentre GC8 (Ct = 30) presenta una espressione EBER debole (Figura 2). I dati Q-PCR è in accordo con EBER in situ
risultato ibridazione. In effetti, i 6 campioni con intensa colorazione EBER (punteggio 3+), hanno dimostrato alto numero di copie di DNA EBV, mentre i casi con debole espressione EBER (score 1+) corrispondeva a bassa copia di DNA virale (Tabella 3). Figura 2 Determinazione della EBV DNA numero di copie da Q-PCR. Esempi rappresentativi di casi GC con alta (GC10), intermedio (GC3) e bassa (GC8) EBV DNA numero di copie. La linea orizzontale indica la soglia utilizzata per la valutazione del valore di Ct.
Tabella 3 EBV numero di copie di DNA e EBER punteggio colorazione nei 12 EBV campioni positivi e 6 casi negativi
Casi GC
istologica
Tipo
Tumore
sito
Ct *
(media)

DNA EBV *
copie /mg
EBER colorazione
punteggio
10
intestinale
Antrum
15
6.105
3+ 3
intestinale
Antrum
22
4.103
3+
12
intestinale
Antrum
23
103
3+
9
Diffondere le
Antrum
22,8
103
3+ 2
intestinale
corpo
25
5.102
3+ 4
intestinale
Antrum
26
102
3+
6
intestinale
prossimale
27
8,101
2+ 7
Diffuse
corpo
28
5.101
2+
11
intestinale
prossimale
28
5.101
2+
1 intestinale
Antrum
30
< 10
1+
5
intestinale
Antrum
30
< 10
1+ Pagina 8
Diffuse
corpo
30
< 10
1+
13
Diffuse
Antrum
ND

• Un aumento della chinasi integrina-linked conferisce non canonicamente vantaggi della crescita di NF-kB-mediate a cellule di cancro gastrico attivando ERK1 /2
• Epstein-Barr virus infetta adenocarcinoma gastrico esprime trascritti virali latenti e litici ed ha una distinta espressione del gene umano profile