Características de los virus de Epstein Barr variantes asociadas con el carcinoma gástrico en el sur de Túnez

Características de los virus de Epstein Barr variantes asociadas con el carcinoma gástrico en el sur de Túnez

abstracto de Backgroud
asociada con el EBV carcinoma gástrico (EBVaGC) tiene una serie de características clínicas distintas y su prevalencia es variable en todo el mundo.
Resultados
Para determinar la prevalencia de EBVaGC en Túnez, los pequeños ARN (Eber) la expresión de EBV-codificado se evaluó en muestras de 81 carcinoma gástrico (CG). La expresión de EBER nuclear se detectó en 12 de 81 casos (14,81% GC) y la concordancia entre el rango de puntuación de la tinción de EBER y el número de copias de ADN EBV como estimación de QPCR se observa. Por otra parte, se encontró que EBVaGC fuertemente correlacionado con la edad al momento del diagnóstico, y débilmente con la diferenciación del tumor y la invasión venosa.
Además, las muestras se sometieron EBVaGC para determinar los polimorfismos de ADN de EBV. Nuestros resultados muestran un perfil genético único de las cepas de EBV con respecto a los tipos A y D, el prototipo F, la retención de Xho
sitio de restricción I y la variante del-LMP1 30 pb. De acuerdo con nuestros estudios anteriores sobre el carcinoma nasofaríngeo (NPC), hemos sugerido que las cepas de EBV asociadas a la GC y el CNP comparten algunas similitudes en los pacientes de Túnez.
Conclusión México La prevalencia de EBVaGC es del 14,81% en el sur de Túnez y que cepa EBV común se asocia tanto con la APN y GC que son propensos a diferir de las cepas asiáticas. Nuestros hallazgos apoyan, por tanto, una cierta distribución geográfica de las cepas de EBV que no se limita a las neoplasias malignas asociadas con el EBV.
Palabras clave
carcinoma gástrico EBV EBER polimorfismos Antecedentes
carcinoma gástrico (CG) es la segunda causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. La incidencia de GC varía de una región geográfica a otra, lo que sugiere que se consideran los factores genéticos y ambientales, incluyendo la infección por Helicobacter pylori
para contribuir a la carcinogénesis gástrica [2, 3]. En el sur de Túnez, la incidencia anual de GC varía de 2,6 a 4,8 /100 000 personas [4]. En los últimos años, muchos informes han explorado la asociación entre el virus de Epstein-Barr (EBV) y GC [5-9]. El GC asociado al EBV (EBVaGC) se ha evidenciado por la presencia de expresión uniforme de EBV-codificada ARN pequeño (EBER) en células de GC [10], la detección de episomas EBV monoclonales en las células de GC [11] y el aumento de suero anticuerpos contra antígeno de la cápside viral [12]. La incidencia de EBVaGC varía ampliamente del 2 al 18% según lo informado por estudios anteriores [13-20]. Por otra parte, las características clínicas de EBVaGC incluyen predominio masculino, edad relativamente joven y la ubicación en el estómago proximal [9, 21]. El EBVaGC muestra una menor tasa de participación de los ganglios linfáticos y tiene un pronóstico relativamente favorable en comparación con EBV-negativo uno [22].
En EBVaGC, la infección de las células tumorales se caracteriza por un patrón de tipo I de latencia, en el que la expresión de genes virales latentes se limita a antígeno nuclear de Epstein-Barr (EBNA) -1, EBER, proteína de membrana latente LMP-2A y transcripciones de la Bam HI
Un marco hacia la derecha (BARF) -0 y -1 [11, 23]. Puesto que los productos de EBV de tipo I infección latente han demostrado estar involucrados en la tumorogénesis EBV mediada, se sugirió que el proceso oncogénico en EBVaGC podría ser impulsado por diferentes mecanismos de los de GC convencional. Posteriormente, EBVaGC malignidad podría ser considerada como una entidad diferente entre los GC que requiere mayor atención para mejorar la atención al paciente. Francia El presente estudio se llevó a cabo con el objetivo de determinar la prevalencia de EBVaGC en el sur de Túnez y posteriormente para analizar polimorfismos específicos de EBV aísla el tumor.
Materiales y métodos
características del paciente
se recogieron un total de 81 carcinomas gástricos primarios, entre enero de 1999 y diciembre de 2009, de los pacientes que fueron sometidos a resección quirúrgica radical en el Departamento de Cirugía Digestiva de Habib Bourguiba hospital de la Universidad de Sfax (Túnez). Todos los pacientes dieron su consentimiento informado antes de la toma de la muestra de acuerdo con las directrices institucionales. Ninguno de los pacientes tenía la quimioterapia preoperatoria o postoperatoria. parámetros clínico-patológicas tales como el género, la edad, el lugar anatómico, tipo histológico, el estadio patológico, el tamaño del tumor y la invasión venosa se evaluaron mediante la revisión de historias clínicas y registros patológicos. En el momento de la cirugía, la edad de los pacientes osciló entre 18 a 94 años (media: 59,58 años). El sitio anatómico de tumor se determinó de acuerdo a la localización predominante de la lesión como cardias (n = 8), el cuerpo (n = 22), y el antro (n = 48). Los subtipos histológicos fueron clasificados de acuerdo a los criterios de Lauren [24] como tipo intestinal (n = 47) y el tipo difuso (n = 34), sino también de la Organización Mundial de la Salud como pobremente diferenciado (n = 43), moderadamente diferenciados (n = 26) y bien diferenciado (n = 9). El estadio clínico de la enfermedad se determinó de acuerdo con el tumor, nódulo y clasificación metástasis (TNM) del Comité Conjunto sobre el Cáncer [25]. Nuestra cohorte contiene 9 pacientes en estadio I o II y 47 pacientes en estadio III o IV.
La hibridación in situ
EBV fue identificado por la expresión de ARN pequeño EBV-codificado (Eber). Brevemente, in situ
hibridación (ISH) ensayo se realizó en 3 micras parafina de las secciones de bloque con sondas de EBV de oligonucleótidos complementarios a la EBER-1 y -2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kit de detección PNA ISH, Dako Cytomation). Las señales de hibridación se visualizaron con diaminobencidina (DAB) y la señal positiva nuclear fue reconocido como la tinción nuclear marrón oscuro con microscopía de luz. Como control positivo, se usó sección de una conocida tejido NPC EBER-positivo. La tinción se anotó 1-3 de acuerdo con el porcentaje de núcleos de células teñidas en secciones de tejido. Puntuación 3 se atribuyó cuando se observó señal positiva en más del 75%, la puntuación de 2 en 75 a 50% y la puntuación de 1 en menos del 50% de las células.
Extracción de ADN
ADN se extrajo de fijado en formol e parafina tejidos embebidos. Después de la identificación del tumor en hematoxilina-eosina-manchado diapositivas, las zonas tumorales se rasparon de 40 micras de espesor secciones de parafina. Los materiales recogidos se de-encerado por lavado en xileno y se aclararon en etanol. tejidos secos se digirieron con proteinasa K en presencia de SDS a 55 ° C durante la noche, seguido de extracción con fenol /cloroformo como se ha descrito anteriormente [26]. La cantidad de ADN se comprobó mediante espectrofotómetro y se almacenó a -20 ° C para su uso posterior.
PCR RFLP y secuenciación
cinco regiones del genoma EBV fueron objeto de análisis de polimorfismo por PCR, RFLP o secuenciación. Los polimorfismos estudiados abarcan el tipo A o B en el gen EBNA-3C, la C o de tipo D en la región /I1 BamHI-W1, el prototipo F o variante f en la región BamHI-F, la pérdida de un Xho
sitio que en el primer exón del BNLF1gene (XhoI
variante I-pérdida) y la supresión de 30 pb en el tercer exón del mismo gen (30 pb variante del-LMP1). La genotipificación se realizó en el ADN de pacientes GC EBV positivo y como control, se analizan 10 muestras de ADN de mucosa nasofaríngea positivo para EBV.
Amplificación por PCR se realizó en 200 ng de ADN en una mezcla final de reacción de 50 l que contiene 0,2 M de cada cebador, 200 M de dNTP, MgCl2 2 mM, 1X tampón de PCR y 1 unidad de Taq ADN polimerasa (Fermentas). Las secuencias de los cebadores y el tamaño de los productos de PCR se muestran en la Tabla 1.Table 1 Resumen de las secuencias de los cebadores que abarcan los tipos y variantes de EBV
VEB genes y regiones gratis (tipos o variantes ) guía empresas secuencias de los cebadores (5'-3 ') guía empresas tamaño del producto (pb) guía empresas EBNA-3C gen gratis (tipo A o B)
F : AGAAGGGGAGCGTGTGTTGT
R: GGCTCGTTTTTGACGTCGGC
productos de PCR
153: tipo A
246: tipo B Opiniones BamH1-W región
(tipo C o D)
F: ACCTGCTACTCTTCGGAAAC
R: TCTGTCACAACCTCACTGTC
PCR + Bam HI
digestión
205: tipo C
130 + 75: tipo D
BamH1-F región
(variante f)
F: TCCCACCTGTTACCACATTC
R: GGCAATGGGACGTCTTGTAA
PCR + Bam HI
digestión
198: F variante
127 + 71: f variante
exón 1 del gen BNLF1 gratis (variante XhoI)
F: ACAATGCCTGTCCGTGCA
R: AGAAACACGCGTTACTCT
PCR + Xho I digestión

497: Xho I-

340 + 157: Xho I +

exón 3 de BNLF1 gen gratis (30bpdel-LMP1)
F: TGGAGGGAGAGTCAGTCAGGC
R: ATTGACGGAAGAGGTTGAAAAC
productos de PCR
224: 30bpdel-LMP1
254: peso-LMP1
F: cebador directo
R: cebador inverso Francia el C /D y F /f tipificación se basa en el BamHI
digestión de cada producto de PCR. Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo en un volumen final de 20 l que contenía 10 l de producto de PCR, tampón de digestión 1X y 10 unidades de BamHI
enzima (Fermentas). Después de la incubación durante la noche a 37 ° C, los productos se analizaron en gel de agarosa al 2% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio, bajo iluminación UV. Se evaluaron las mismas condiciones descritas anteriormente para identificar la XhoI
sitio en el primer exón de BNLF1gene. ADN de B95.8 (GenBank adhesión No.V01555) y la línea de células C666-1 (número de acceso GenBank ABV54173) se utilizó como control para este tipo de EBV y variantes. La línea celular derivada de un C666-1 APN de China, que alberga los tipos A /C, la variante f, Xho
variante I-pérdida y 30 pb variantes del-LMP1.
Secuenciación del ADN se realizó en los productos de PCR purificados de el tercer exón del gen BNLF1 utilizando el kit de purificación en gel de SV (Promega). Ciclo de secuenciación se realizó utilizando el Kit Ciclo de Secuenciación ABI PRISM Big Dye Terminator (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las secuencias se realizaron bi-direccionalmente. Los resultados de la secuenciación se compararon con las secuencias de EBV B95.8 (GenBank adhesión No.V01555), CPN chinos (células Cao [27], las células C666-1 (número de acceso GenBank ABV54173) y NPC10 biopsia [28] y Túnez NPC especímenes (CV4, CV5 y CV 6 [29]).
cuantitativa en tiempo real PCR
Q-PCR ensayo de la orientación de la región BamHI-W del genoma de EBV se realizó en las muestras de 12 por EBV positivo que muestran tinción nuclear y muestras negativas 6 EBV. las reacciones se llevaron a cabo en un sistema de PCR iCycler iQ ™ en tiempo real (BioRad), usando cebadores que flanquean la región BamHI-W del genoma EBV y la sonda TaqMan como se describe anteriormente [30]. alícuota de 1 mg ADN se utilizó para la amplificación en un volumen total de reacción de 25 l que contenía 300 nM de cada cebador, 25 nM de la sonda TaqMan, 1X tampón PCR, 2 mM de MgCl2, 200 mM de cada dNTP y 1 unidad de GoTaq Hot Start polimerasa (Promega). la curva estándar se preparó utilizando diluciones en serie de 10 veces del plásmido recombinante pGEMT /BamHI-W. Las muestras se analizaron por duplicado y se promediaron los resultados para calcular la carga viral del VEB expresada en copias por reacción.
El análisis estadístico
análisis estadístico se realizó con el programa estadístico SPSS 13.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EE.UU. ). P-valor inferior a 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados Prevalencia de EBVaGC y la asociación con las características clínico-patológicas
ochenta y una muestras de GC fueron probados para la positividad EBV usando el EBER in situ
hibridación. La frecuencia de EBVaGC era 14,8% (12 de 81) en el que la señal de EBER positivo se restringió a los núcleos de las células de carcinoma (Figura 1). Las muestras EBVaGC tienen un porcentaje variable de células tumorales teñidas que muestra más del 75% en seis casos (puntuación 3), entre 50 y 75% en tres casos y menos de 50% en los tres casos restantes. Los casos EBVaGC se asociaron con la edad al momento del diagnóstico (p = 0,009
, Tabla 2). De hecho, 9 de los 12 pacientes con EBVaGC tenían entre 45 y 60 años de edad. Además, se observó una tendencia hacia la asociación con la diferenciación del tumor y la invasión venosa como no se alcanzó el valor estadísticamente significativa (P = 0,07
y P = 0,09
respectivamente, Tabla 2). Figura 1 Detección del virus de Epstein-Barr codificada pequeños RNAs de virus de Epstein () por hibridación in situ en tejidos de carcinoma gástrico. A: H & E tinción. B: tinción de EBER Intense positivo (inmuno-score 3+) en los núcleos de las células tumorales (aumento original × 40). C: tinción moderada EBER positivo (inmuno-score 2 +) en los núcleos de las células tumorales (aumento original × 40). D: tinción positiva débil EBER (inmuno-score 1+) en los núcleos de las células tumorales (aumento original × 40). E: Control positivo representado por un conocido NPC tejidos Eber-positivo (aumento original × 40). F: tejidos de carcinoma gástrico negativas para EBER (aumento original × 10)
Tabla 2 Correlación entre EBVaGC y los parámetros clínico-patológicas
Características clínicas
N
EBV expresión *


negativo (%) guía empresas positivo (%)

Sexo Masculino

48
42 (87,5) página 6 (12,5)
Mujer
33
27 (81,8) página 6 (18,2)
p-valor

0,47
Edad
< 45
17
17 (100)
0 (0): perfil del 45-60
30
21 (70) página 9 (30) Hotel > 60
34
31 (91,2) página 3 (8,8)
p-valor

0,009
TNM
I-II página 9
9 (100)
0 (0)
III-IV
47
40 (87,1) página 7 (14,9)
p-valor

0,216 El sitio anatómico

antro
48
41 (85,4) página 7 (14,6)
Cuerpo
22 página 19 (86,4) página 3 ( 13.6)
Cardia página 8 página 6 (75) página 2 (25)
p-valor

0,72
Diferenciación
Pobre
43
36 (83,7) página 7 (16,3)
Moderado
26
25 (96,2)
1 (3,8)
Bueno página 9 página 6 (66.7) página 3 (33,3)
p-valor

0,075
Lauren tipo
intestinal
47
38 (80,9) página 9 (19.1)
Difuso
34
31 (91,2) página 3 (8,8)
p-valor

0.197
tamaño del tumor
< 5 cm página 9 página 8 (88,9)
1 (11,1) Hotel > 5 cm
65
54 (83,1) página 11 (16,9)
p-valor

0.658
invasión venosa
Negativo
61
54 (88,5) página 7 (11,5)
Positif
18 página 13 (72,2) página 5 (27,8)
p-valor

0,09
* expresión EBV se determinó por EBER hibridación in situ. casos negativos mostraron una puntuación = 0 y positivos casos mostraron una puntuación = 1+ a 3+ evaluación cuantitativa de
EBV en GC
ensayo de Q-PCR se realizó en 18 muestras de carcinoma gástrico.; entre ellos 12 muestran positividad EBER restringida a las células los núcleos y 6 fueron negativos.
El número de copias de ADN viral se estimó por el método de cuantificación absoluta mediante dilución en serie de ADN de plásmido recombinante (pGEMT /BamHI-W), como estándar externo. curva estándar se estableció mediante el trazado de los plásmido de partida el número de copias frente al ciclo umbral (Ct), que muestra una cuantificación lineal en un intervalo de 10 6 a 10 copias por reacción.
ejemplos representativos se muestran en la Figura 2 donde los casos GC10 y GC3 (Ct = 15 y 22, respectivamente) muestran una fuerte tinción nuclear de EBER mientras que GC8 (Ct = 30) exhibe una expresión de EBER débil (Figura 2). Los datos de Q-PCR está en concordancia con EBER in situ
resultado de la hibridación. De hecho, las 6 muestras con tinción intensa EBER (puntuación de 3+), mostraron el número de copias de ADN EBV alta, mientras que los casos con expresión de EBER débil (puntuación de 1+) correspondieron a copias de ADN viral baja (Tabla 3). Figura 2 Determinación de ADN EBV número de copias por Q-PCR. Los ejemplos representativos de los casos con alta GC (GC10), intermedio (GC3) y baja (GC8) ADN del VEB número de copias. La línea horizontal marca el umbral utilizado para la evaluación del valor de Ct.
Tabla 3 EBV número de copias de ADN y la puntuación de tinción EBER en las 12 muestras positivas EBV y 6 casos negativos
GC Casos
histológico
Tipo
tumor sitio

Ct * gratis (promedio)

ADN del VEB *
copias /g
tinción EBER
puntuación
10
intestinal
antro
15
6.105
3+ página 3
intestinal
antro
22
4.103
3+ página 12
intestinal
antro
23
103
3+ página 9
Difuso
antro
22,8
103
3+
2 intestinal
Cuerpo
25
5.102
3+
4 de intestinal
antro
26
102
3+ página 6
intestinal proximal

27
8.101
2+ página 7
difusa
Cuerpo
28
5.101
2+ página 11
intestinal proximal

28
5.101
2+ 1

• Un aumento de la integrina-quinasa vinculadas confiere no-canónicamente ventajas de crecimiento mediada por NF-kB en células de cáncer gástrico mediante la activación de ERK1 /2
• adenocarcinoma gástrico virus de Epstein-Barr infectados expresa transcritos virales latentes como líticos y tiene una expresión de genes humanos profile