Eigenschaften von Epstein-Barr-Virus-Varianten mit Magenkarzinom assoziiert im südlichen Tunisia

Eigenschaften von Epstein-Barr-Virus-Varianten mit Magenkarzinom in Süd-Tunesien assoziiert
Zusammenfassung
Backgroud
EBV-assoziierten Magenkarzinom (EBVaGC) hat eine deutliche klinische Merkmale und die Prävalenz ist variabel weltweit.
Ergebnis einschränken, um die Prävalenz von EBVaGC in Tunesien, EBV-kodierte kleine RNA (EBER) Ausdruck bestimmen wurde in 81 Magenkarzinom (GC) Proben beurteilt. Die Kern EBER-Expression wurde in 12 von 81 GC-Fälle (14,81%) und Konkordanz zwischen dem Score-Bereich Ebers-Färbung und die Anzahl der EBV DNA-Kopien als Schätzung von QPCR erkannt beobachtet wird. Auf der anderen Seite fanden wir, dass EBVaGC stark mit dem Alter bei Diagnose korreliert und schwach mit Tumordifferenzierung und venöse Invasion.
Weiterhin wurden die Proben EBVaGC unterworfen, um die EBV DNA-Polymorphismen zu bestimmen. Unsere Ergebnisse zeigen eine einzigartige genetische Profil der EBV-Stämme in Bezug auf die A- und D-Typen, die F-Prototyp, die Beibehaltung der Xho
I-Restriktionsstelle und die 30 bp del-LMP1-Variante. Nach unseren früheren Studien über Nasen-Rachen-Karzinom (NPC), schlugen wir, dass der GC und NPC assoziiert EBV Stämme einige Ähnlichkeiten in der tunesischen Patienten geteilt.
Fazit
Die Prävalenz von EBVaGC von 14,81% im Süden Tunesiens ist und dass gemeinsam sind EBV-Stamm mit beiden NPC und GC verbunden, die aus asiatischen Stämmen wahrscheinlich zu unterscheiden sind. Unsere Ergebnisse unterstützen daher eine gewisse geographische Verteilung der EBV-Stämmen, die nicht auf EBV-assoziierten malignen Erkrankungen beschränkt ist.
Schlüsselwörter Magenkarzinom EBV EBER Polymorphismen hintergrund und Magenkarzinom (GC) ist die zweithäufigste Ursache für Krebstod weltweit [1]. Die Inzidenz von GC variiert von einem geographischen Bereich zu einem anderen darauf hindeutet, dass genetische und Umweltfaktoren einschließlich Helicobacter pylori-Infektion
magen Karzinogenese beitragen angesehen [2, 3]. Im Süden Tunesiens variiert die jährliche Inzidenz von GC 2,6-4,8 /100 000 [4]. In den wenigen vergangenen Jahren viele Berichte haben den Zusammenhang zwischen dem Epstein-Barr-Virus (EBV) Infektion und GC [5-9] untersucht. Die EBV-assoziierten GC (EBVaGC) wurde durch das Vorhandensein von einheitlichen Expression von EBV-codierten kleinen RNA (EBER) in GC-Zellen [10], der Nachweis von monoklonalen EBV Episomen in GC-Zellen [11] und der Anstieg des Serum wurde bewiesen Antikörper gegen virales Capsid-Antigen [12]. Die Inzidenz von EBVaGC variiert stark 2-18%, wie durch frühere Studien berichtet [13-20]. Außerdem gehören die klinischen Merkmale von EBVaGC männlichen Vorherrschaft, relativ jüngeren Alter und Lage im proximalen Magen [9, 21]. Die EBVaGC eine niedrigere Rate von Lymphknotenbefall zeigt und hat eine relativ günstige Prognose im Vergleich zu EBV-negativ [22].
EBVaGC, Infektion von Tumorzellen wird durch eine Typ-I-Muster der Latenz gekennzeichnet, in denen die Expression viraler latenten Gene Epstein-Barr nuclear antigen beschränkt ist (EBNA) -1, EBER, latent membrane protein LMP-2A und Transkripte aus dem Bam
HALLO A nach rechts Rahmen (BARF) -0 und -1 [11, 23]. Da die EBV-Produkte vom Typ I haben latente Infektion nachgewiesen wurde in EBV-vermittelte Tumorgenese beteiligt sind, wurde vorgeschlagen, dass das onkogene Prozeß in EBVaGC durch verschiedene Mechanismen von denen der herkömmlichen GC angetrieben werden. Anschließend konnte EBVaGC Bösartigkeit als eine andere Person unter GC betrachtet werden, die größere Aufmerksamkeit erfordert die Patientenversorgung zu verbessern.
Die vorliegende Studie mit dem Ziel durchgeführt wurde, um die Prävalenz von EBVaGC im Süden Tunesiens zu bestimmen und anschließend spezifische EBV-Polymorphismen zu analysieren der Tumor isoliert.
Materialien und Methoden Patienten Merkmale
wurden insgesamt 81 primären Magenkarzinomen
gesammelt, von Januar 1999 bis Dezember 2009 von Patienten, die radikale chirurgische Resektion an der Klinik für Viszeralchirurgie von Habib Bourguiba unterzog Universitätsklinikum (Sfax, Tunesien). Alle Patienten gaben informierte Zustimmung vor der Probenentnahme gemäß gültiger Richtlinien. Keiner der Patienten hatte präoperative oder postoperative Chemotherapie. Clinico-pathologischen Parametern wie Geschlecht, Alter, anatomischen Ort, histologischen Typ, Krankheitsstadium, Tumorgröße und venöse Invasion wurden durch die Überprüfung der medizinischen Charts und pathologischen Aufzeichnungen ausgewertet. Zum Zeitpunkt der Operation lag das Alter der Patienten von 18 bis 94 Jahren (Durchschnitts: 59,58 Jahre). Die anatomische Stelle des Tumors wurde nach der vorherrschenden Position der Läsion als Cardia bestimmt (n = 8), Körper (n = 22) und Antrum (n = 48). Die histologischen Subtypen wurden nach den Kriterien von Lauren klassifiziert [24] als intestinalen Typ (n = 47) und diffusen Typ (n = 34), sondern auch von der Weltgesundheitsorganisation als schlecht differenzierten (n = 43), mäßig differenziert (n = 26) und gut differenziertem (n = 9). Die klinische Stadium der Krankheit wurde nach dem Tumor bestimmt, Knoten und Metastasen (TNM) Klassifikation des American Joint Committee on Cancer [25]. Unsere Kohorte enthält 9 Patienten im Stadium I oder II und 47 Patienten im Stadium III oder IV.
In-situ-Hybridisierung
EBV durch die Expression von EBV-kodierte kleine RNA (EBER) identifiziert wurde. Kurz gesagt, wurde auf 3 &mgr; m in Paraffin Blockabschnitte mit EBV Oligonukleotidsonden komplementär zur EBER-1 und -2 gemäß den Anweisungen des Herstellers (PNA ISH Nachweiskit, Dako Cytomation) in situ
Hybridisierung (ISH) -Test durchgeführt. Die Hybridisierungssignale wurden mit Diaminobenzidin sichtbar gemacht (DAB) und positive Kern Signal wurde als dunkelbraune Kernfärbung unter Lichtmikroskopie erfasst. Als positive Kontrolle wurde Ausschnitt aus einem bekannten EBER-positiven NPC Gewebe verwendet. Färbung wurde von 1 bis 3 entsprechend dem Prozentsatz der gefärbten Zellkerne in Gewebeschnitten erzielt. Ergebnis 3 wurde zugeschrieben, als positives Signal wurde in mehr als 75% beobachtet, Score 2, bei 75 bis 50% und erzielt 1 in weniger als 50% der Zellen.
DNA-Extraktion
DNA extrahiert wurde aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe. Nach Tumoridentifikation auf Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Objektträger wurden tumorale Bereichen von 40 &mgr; m dicke Paraffinschnitte gekratzt. Die gesammelten Materialien wurden durch Waschen in Xylol entwachst und in Ethanol gespült. Getrocknetes Gewebe wurden mit Proteinase K in Gegenwart von SDS verdaut über Nacht bei 55 ° C, gefolgt von Phenol /Chloroform-Extraktion, wie zuvor beschrieben [26]. Die Menge der DNA wurde mittels Spektrophotometer und gelagert bei -20 ° C zur weiteren Verwendung überprüft. PCR- RFLP und Sequenzierung
fünf Regionen des EBV-Genoms wurden für Polymorphismus-Analyse gezielt durch PCR, RFLP oder Sequenzierung
. Die untersuchten Polymorphismen die A- oder B-Typ in der EBNA-3C-Gen, die C- oder D-Typ in der BamHI-W1 /I1 Region, den Prototyp F oder f Variante in der BamHI-F-Bereich, den Verlust eines Xho umfassen
I-Stelle im ersten Exon von BNLF1gene (Xho I
-loss-Variante) und das 30 bp-Deletion im dritten Exon des gleichen Gens (30 bp del-LMP1 Variante). Die Genotypisierung wurde auf DNA von GC Patienten durchgeführt EBV-positiv und als Kontrolle analysieren wir 10 DNA-Proben von Nasen-Rachen-Schleimhaut positiv für EBV.
PCR-Amplifikation auf 200 ng DNA in einem letzten Reaktionsgemisch von 50 ul, das 0,2 durchgeführt wurde, uM jeder Primer, 200 uM dNTP, 2 mM MgCl 2, 1 × PCR-Puffer und 1 Einheit Taq DNA-Polymerase (Fermentas). Die Primer-Sequenzen und die Größe der PCR-Produkte sind in Tabelle 1.Table 1 Zusammenfassung der Primersequenzen umfassend die EBV-Typen und Varianten
EBV-Gene und Regionen
(Typen oder Varianten gezeigt )
Primer-Sequenzen (5'-3 ')
Produktgröße (bp)
EBNA-3C-Gen
(Typ A oder B)
F : AGAAGGGGAGCGTGTGTTGT
R: GGCTCGTTTTTGACGTCGGC
PCR-Produkte
153: Typ A
246: Typ B
BamH1-W Region
(Typ C oder D)
F: ACCTGCTACTCTTCGGAAAC
R: TCTGTCACAACCTCACTGTC
PCR + Bam
HALLO Verdauung
205: Typ C
130 + 75: Typ D
BamH1-F-Region
(f Variante)
F: TCCCACCTGTTACCACATTC
R: GGCAATGGGACGTCTTGTAA
PCR + Bam
HALLO Verdauung
198: F-Variante
127 + 71: f Variante
Exon 1 von BNLF1 Gen
(XhoI Variante)
F: ACAATGCCTGTCCGTGCA
R: AGAAACACGCGTTACTCT
PCR + Xho
I
497 Verdauung: Xho
I-
340 + 157: Xho
I +
Exon 3 von BNLF1 Gen
(30bpdel-LMP1)
F: TGGAGGGAGAGTCAGTCAGGC
R: ATTGACGGAAGAGGTTGAAAAC
PCR-Produkte
224: 30bpdel-LMP1
254: wt-LMP1
F: Forward Primer
R: Reverse-Primer
Die C /D und F /f das Schreiben auf der BamHI
Verdauung jedes PCR-Produkt basiert. Die enzymatischen Reaktionen wurden in einem Endvolumen von 20 &mgr; l, enthaltend 10 &mgr; l PCR-Produkt, 1X Verdauungspuffer und 10 Einheiten BamHI
Enzym (Fermentas) durchgeführt. Nach Inkubation über Nacht bei 37 ° C, Produkte wurden auf einem 2% igen Agarosegel analysiert und durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht unter UV-Beleuchtung. Die gleichen Bedingungen wie oben beschrieben wurden die XhoI
Website im ersten Exon von BNLF1gene zu identifizieren, zu beurteilen. DNA aus B95.8 (GenBank accession No.V01555) und C666-1 Zelllinie (GenBank Zugangsnummer ABV54173) wurden als Kontrolle für EBV-Typen und Varianten. Die C666-1 Zelllinie aus einem chinesischen NPC abgeleitet, die A /C-Typen birgt, f Variante, Xho
I-Verlust-Variante und 30 bp del-LMP1-Variante.
DNA-Sequenzierung auf den gereinigten PCR-Produkte wurde durchgeführt von das dritte Exon des Gens, das das BNLF1 SV Gel Purification Kit (Promega) gemessen. Zyklus-Sequenzierung wurde unter Verwendung des ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Alle Sequenzen wurden bidirektional ausgeführt. Die Sequenzierungsergebnisse wurden dann mit den EBV Sequenzen von B95.8 (GenBank accession No.V01555), Chinese NSC (Cao Zellen im Vergleich [27], C666-1-Zellen (GenBank Zugangs-Nr ABV54173) und NPC10 Biopsie [28] und Tunisian NPC Proben (CV4, CV5 und CV6 [29]).
Echtzeit quantitative PCR
Q-PCR-Test, um die BamHI-W Region des EBV-Genoms Targeting wurde auf den 12 EBV-positiven Proben durchgeführt, die Kernfärbung anzeigt und 6 EBV-negativen Proben. die Reaktionen wurden durchgeführt auf einem iCycler iQ ™ Echtzeit-PCR-System (BioRad) unter Verwendung von Primern flankierenden BamHI-W Region des EBV-Genoms und TaqMan-Sonde, wie zuvor beschrieben [30]. Aliquot von 1 &mgr; g DNA wurde zur Amplifikation in einem Gesamtreaktionsvolumen von 25 ul, enthaltend 300 nM jedes Primers, 25 nM von TaqMan-Sonde, 1X PCR-Puffer, 2 mM MgCl 2, 200 &mgr; M jedes dNTP und 1 Einheit GoTaq Hot Start-Polymerase (Promega) eingesetzt. die Standardkurve wurde unter Verwendung von seriellen 10-fachen Verdünnungen des rekombinanten Plasmid pGEMT /BamHI-W vorbereitet. Die Proben wurden in zweifacher Ausfertigung und die Ergebnisse gemittelt laufen EBV-Viruslast in Kopien pro Reaktion ausgedrückt zu berechnen. Die statistische Analyse
Statistische Analyse mit SPSS 13.0 Statistik-Software-Programm für Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA durchgeführt wurde, ). P-Wert von weniger als 0,05 als statistisch signifikant betrachtet wurde.
Ergebnisse | Prävalenz von EBVaGC und Assoziation mit klinisch-pathologischen Eigenschaften
Einundachtzig Exemplare von GC wurden EBV-Positivität getestet, um die EBER in situ unter Verwendung von
Hybridisierung. Die Häufigkeit der EBVaGC betrug 14,8% (12 von 81), in dem das EBER positives Signal an den Kernen von Karzinomzellen beschränkt wurde (Abbildung 1). Die EBVaGC Exemplare haben einen variablen Anteil von gefärbten Tumorzellen in sechs Fällen mehr als 75% zeigt (Score 3), zwischen 50 und 75% in drei Fällen und weniger als 50% in den drei übrigen Fällen. Die EBVaGC Fälle wurden mit dem Alter bei der Diagnosestellung (P
= 0,009, Tabelle 2) verbunden sind. Tatsächlich 9 der 12 Patienten mit EBVaGC wurden zwischen 45 und 60 Jahren alt. Darüber hinaus wurde ein Trend zur Verbindung mit Tumordifferenzierung und venöse Invasion beobachtet als statisch signifikanten Wert nicht erreicht wurde (P
= 0,07 und P = 0,09
bzw. Tabelle 2). Figur 1 Nachweis von Epstein-Barr-Virus kodiert kleine RNAs (Ebers) durch in-situ-Hybridisierung in Magenkarzinomgeweben. A: H & E-Färbung. B: Intensive EBER positive Färbung (Immuno-Score 3+) in den Kernen der Tumorzellen (Originalvergrößerung × 40). C: Moderate EBER positive Färbung (Immuno-Score 2+) in den Kernen der Tumorzellen (Originalvergrößerung × 40). D: Schwach EBER positive Färbung (Immuno-Score 1+) in den Kernen der Tumorzellen (Originalvergrößerung × 40). E: Positive Kontrolle vertreten durch bekannte EBER-positiven NPC Gewebe (Originalvergrößerung × 40). F: Magenkarzinom Gewebe negativ für EBER (Originalvergrößerung × 10)
Tabelle 2 Korrelation zwischen EBVaGC und klinisch-pathologischen Parametern
Klinische Merkmale
N
EBV Ausdruck *


Negative (%)
Positive (%)

Gender
männlich
48
42 (87,5)
6 (12,5)
Weiblich
33
27 (81,8)
6 (18.2)
p
-Wertes
0,47
Alter
< 45
17
17 (100)
0 (0)
45-60
30
21 (70)
9 (30)
> 60
34
31 (91,2)
3 (8,8)
p
-Wertes
0,009
TNM
I-II
9
9 (100)
0 (0)
III-IV
47
40 (87,1)
7 (14,9)
p
-Wertes
0.216
Anatomische Seite
Antrum
48
41 (85,4)
7 (14,6)
Körper
22
19 (86,4)
3 ( 13.6)
Cardia
8 6 (75)
2 (25)
p
-Wertes
0,72
Differenzierung
Schlechte
43
36 (83,7)
7 (16,3)
Moderate
26
25 (96,2)
1 (3.8)
Well
9
6 (66.7)
3 (33,3)
p
-Wertes
0,075
Lauren Typ
Intestinale
47
38 (80,9)
9 (19.1)
Diffuse
34
31 (91,2)
3 (8,8)
p
-Wertes
0.197
Tumorgröße
< 5 cm
9
8 (88,9)
1 (11.1)
> 5 cm
65
54 (83,1)
11 (16,9)
p
-Wertes
0.658
Venöse Invasion
Negatif
61
54 (88,5)
7 (11,5)
Positif
18
13 (72,2)
5 (27,8)
p
-Wertes
0,09
* EBV-Expression wurde durch EBER in-situ-Hybridisierung bestimmt. Negative Fälle zeigten eine Punktzahl = 0 und positive Fälle eine Punktzahl zeigte = 1+ bis 3+
Quantitative Bewertung von EBV in GC
Q-PCR-Test auf 18 Magenkarzinom Proben durchgeführt wurde. darunter 12 angezeigt EBER Positivität Zellen Kerne beschränkt und 6 negativ waren. Die virale DNA-Kopienzahl wurde durch die absolute Quantifizierungsmethode unter Verwendung von Verdünnungsreihen von rekombinanten Plasmid-DNA (pGEMT /BamHI-W), als externer Standard geschätzt
. Standardkurve durch Auftragen der Start Plasmid-Kopienzahl gegen den Schwellenzyklus (Ct) gegründet wurde, eine lineare Quantifizierung über einen Bereich von 10 6 bis 10 Kopien pro Reaktion zeigt.
Repräsentative Beispiele sind in Abbildung 2 gezeigt, wo Fälle GC10 und GC3 (Ct = 15 bzw. 22) zeigen eine starke EBER Kernfärbung während GC8 (Ct = 30) einen schwachen EBER Ausdruck (Abbildung 2) zeigt. Die Q-PCR-Daten ist in Übereinstimmung mit EBER in situ Hybridisierung
Ergebnis. Tatsächlich sind die sechs Proben mit intensiven EBER-Färbung (Score 3+), zeigte eine hohe EBV-DNA-Kopienzahl während Fälle mit schwachen EBER Ausdruck (Score 1+) zum niedrigen Virus DNA-Kopie (Tabelle 3) entsprach. Abbildung 2 Bestimmung der EBV-DNA-Kopienzahl von Q-PCR. Repräsentative Beispiele für GC Fälle mit hohem (GC10), Zwischenprodukt (GC3) und niedriger (GC8) EBV DNA-Kopien Nummer. Die horizontale Linie markiert die Schwelle für die Beurteilung der Ct-Wert verwendet.
Tabelle 3 EBV-DNA-Kopienzahl und EBER Färbung Punktzahl in den 12 EBV-positiven Proben und 6 negative Fälle
GC Cases
Histologische
Typ
Tumor
Site
Ct *
(Durchschnitt)

EBV DNA *
Kopien /ug
EBER Färbung 10
Intestinale
Antrum Score
15
6.105
3+
3
Intestinale
Antrum
22
4.103
3+
12
Intestinale
Antrum
23
103
3+
9
Diffuse
Antrum
22,8
103
3+ 2
Intestinale
Körper
25
5.102
3+
4 Intestinale
Antrum
26
102
3+
6 Intestinale
proximale
27
8.101
2+
7
Diffuse
Körper
28
5.101
2+
11
Intestinale
proximale 28
5.101
2+
1 Intestinale
Antrum
30
< 10
1+
5
Intestinale
Antrum
30
< 10
1+
8 Diffuse
Körper
30
< 10
1+
13
Antrum Diffuse
ND | ND | 0
14
Körper
ND | ND Diffuse
0
15
Diffuse
Antrum
ND | ND | 0
16
Diffuse
Antrum
ND | ND
0
17
Intestinale
Antrum
ND | ND | 0
18
Intestinale
Körper
ND | ND | 0
* EBV-DNA-Kopienzahl wurde durch Q-PCR unter Verwendung des absoluten Quantifizierungsmethode geschätzt. Ct: Schwellenzyklus. ND: Nicht-Entschlossener
Genotypisierung von EBVaGC Stämme
weiter Um die EBVaGC in unseren 12 tunesischen Proben zu untersuchen, haben wir das genetische Profil von EBV-Stämmen Bestimmung verschiedener Typen und Varianten untersucht. Ein einzigartiges Profil in allen untersuchten Proben beobachtet (Abbildung 3). Es wurde von den A /D-Typen charakterisiert, Prototyp F, Retention von Xho
I-Restriktionsstelle und 30 bp del-LMP1-Variante. Wir nehmen zur Kenntnis, dass die A- und B-Typen zwei verschiedene EBV Stämme Formgebung in einem Fall von EBVaGC Proben (Abbildung 3) gefunden wurden. Abbildung 3 Genotypisierung von EBVaGC Stämme. A: PCR -RFLP des BamHI-F-Region, die f Variante (Vorhandensein von zwei Banden von 128 bp und 71 bp) für die Steuerung C666-1-Zelllinie (Spur 1) und eine Bande von 199 bp für die F-Variante zeigt, um Fälle GC2 zu GC6 (Spur 2 bis 6). B: PCR-RFLP der BamHI-W1 /I1 Region. DNA-Fragmente wurden mit BamHI verdaut
gibt zwei Banden von 139 bp und 67 (Typ D) für GC2 zu GC6 (Spur 2 bis 6) oder eine Bande von 245 bp (Typ C) für die Steuerung C666-1-Zelllinie ( Spur 1). C: EBNA3C Region. EBV-Stämme der Typen A und B entsprechen DNA-Fragment von 153 bp und 246 jeweils. Fall GC6 zeigt Doppelinfektion mit beiden Typen A und B-Viren. B95.8 ist ein Typ A-Virus, das als Kontrolle (Spur 1) verwendet wurde. D: XhoI
Polymorphismus im Exon 1 des Gens BNLF1. PCR Produkt wurde mit XhoI verdaut
zwei Banden von 343 bp zu ergeben, und 154 bp in XhoI
+ Variante für GC2 zu GC6 (Spur 2 bis 6). C666-1 Zellinie ist eine positive verlust XhoI
Variante (Spur 1).
Die Analyse EBV DNA wurde durch partielle Sequenzierung im dritten Exon des BNLF1 codierende Gen Aminosäuren 328-376 der durchgeführten LMP1-Protein. Um die 30-bp-Deletion, welche die Aminosäuren 343-352 des LMP1-Proteins, Sequenzabgleich ergab sieben Aminosäuren Änderungen gegenüber dem Referenzstamm B95.8 zu bestätigen. Es wurde ständig an den Codons Q334R, L338S und S366A in allen EBVaGC Proben gefunden. H358L und L359V (GC2), P360H (GC9-10) und G365R (GC6): Die verbleibenden Aminosäuren-Substitutionen wurden jedoch vor allem in einer oder zwei EBVaGC Proben gefunden. unsere bisherigen Daten über tunesische NPC Exemplare betrifft, so fanden wir ähnliche Ergebnisse über die drei konstanten Aminosäuren-Substitutionen. Darüber hinaus scheinen die EBV-Stämmen beherbergt S366A Substitution mehr assoziiert Tunisian Proben im Vergleich zu den in China (Bild 4). Abbildung 4 Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen von tunesischen GC mit B95.8 Prototyp und zuvor veröffentlichten LMP1-Sequenzen: Cao: NPC-Zelllinie aus Shangai [27]; C666-1 (GenBank Zugangsnummer ABV54173) NPC 10 von Hong Kong [28] und tunesischen NPC Exemplare: CV4, CV5, CV6 [29]. Symbole (---) zeigen Aminosäure-Deletion.
Bei gesunden EBV Träger, Polymorphismus-Analyse zeigte auch die A- und D-Typen, Prototyp F und XhoI + Variante, wie ähnlich in EBVaGC Proben zu identifizieren (Daten nicht gezeigt).
Diskussion
In der vorliegenden Studie wurden 81 Fälle von GC von Patienten des südlichen Region von Tunesien wurden auf das Vorhandensein von EBV und die Prävalenz von EBVaGC betrug 14,8% untersucht (12 von 81). Es war bekannt, dass die Prävalenz von EBVaGC weit von einer geographischen Region zur anderen variiert und die höchste Frequenz wurde in Deutschland (18%), während die niedrigste (3,9%) wurde in Peru [13-20, 31] erkannt zur Kenntnis genommen.
die EBER in situ-Hybridisierung wurde
das zuverlässigste Verfahren in der Literatur berichtet latenten EBV in GC zu detektieren. In der Tat sind alle oben genannten Studien wurden nach diesem Verfahren durchgeführt, einschließlich unserer Studie. Die variablen Anteile der Kerntumorzellen, die EBER zeigt in unserer Studie exprimieren, wurden auch durch Truong abgeleitet et al., Die vorschlagen, mit EBV-Infektion werden im Zusammenhang tritt in onkogenen Prozeß der EBVaGC [32]. Allerdings müssen weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um diese Beobachtung zu klären.
Außerdem haben wir gezeigt, dass die heterogenen Daten Ebers-Expression mit der Anzahl der EBV DNA Kopien korreliert werden konnte, wie durch Q-PCR geschätzt unterstützen, daß dieses Verfahren zuverlässig ist, wie zuvor berichtet [33]. im Hinblick auf die klinisch-pathologischen Merkmale von EBVaGC, starke Assoziation mit dem Alter bei der Diagnose beobachtet wurde (P
= 0,009, Tabelle 3)
. In der Tat war mehr der EBVaGC häufig in der Gruppe der Patienten gefunden im Alter zwischen 45 und 60 Jahre alt, die mit früheren Studien im Einklang ist [19, 34]. Keine andere statistische Assoziation, mit der Ausnahme einer Tendenz mit Tumor-Differenzierung und venösen Invasion (P
= 0,075 und P
= 0,09 beziehungsweise) gefunden. Früheren Berichte haben gezeigt, dass EBVaGC häufig waren bei männlichen, proximalen Magen und Tumoren des diffusen Typs [9, 14, 16, 35-39]. Vor kurzem in einem großen Meta-Analyse, Carmago et al., Bestätigt diese Verbände neben dem Alter bei der Diagnose [38]. In unserer Studie finden wir bei der Verteilung der EBV bei männlichen im Vergleich zu weiblichen Patienten im proximalen vs distalen Magen und bei diffusem vs Darm-histotype nicht Unterschied. Diese Unterschiede zwischen den Daten könnten durch den Beitrag der lokalen Risikofaktoren bei der Entstehung von EBV und auch durch die Größe und Merkmale auf der Kohorte erläutert.
Polymorphismus Analyse der 12 EBVaGC Fälle zeigen ausschließlich den Typ D, Prototyp F, Xho
I-Retention und die 30 bp del-LMP1-Variante. den Polymorphismus des EBNA-3C-Gen betrifft, so fanden wir den A-Typ in allen EBVaGC Fällen und eine Kombination der Typen A und B wurde nur in einem Fall gefunden. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit aktuellen Studie auf vier EBVaGC Fälle aus der zentralen Region von Tunesien [34].
Die Vorherrschaft des Typs A und Prototyp F wurde auch in früheren Berichten unabhängig der geographischen Herkunft von EBVaGC wie im Süden gezeigt China [35], im südlichen Japan [40], und lateinamerikanischen Ländern [41]. Interessanterweise wurde die Variante-f insbesondere in NPC assoziiert EBV Stämme Südasiens [42] beschrieben. In diesem Bereich ist eine Dominanz von C-Typ und Verlust-XhoI
Variante wurde bei Patienten mit EBVaGC oder NPC [35, 40], im Gegensatz zu unserer Gegenwart zu finden und frühere Ergebnisse zu den tunesischen NPC-Patienten [29, 43] beobachtet.
besser um den Genotyp EBVaGC Stämme definieren und sie mit denen mit dem NPC assoziiert vergleichen zu können, führten wir die partielle Sequenzierung von Exon 3 des BNLF1 Gen aus und verglichen sie mit dem Prototyp B95-8 und andere veröffentlichten Sequenzen aus asiatischen und tunesische NPC EBV Stämme [29, 43]. Die Q334R, L338S und L338P wurden in allen unseren EBV gefunden isoliert und wurden bereits in EBV-Stämmen assoziiert NPC mit Ursprung aus China oder Tunesien [29, 44] berichtet. Allerdings ist die S366A spezifisch für EBV-Isolaten mit tunesischen NPC und GC assoziiert .. In der Tat, und basierend auf dem vorherigen Bericht von Edwards et al. [44] sieben phylogenetisch verschiedene Stämme von LMP1 beschreiben, können wir vorschlagen, dass tunesische Isolate eine zusätzliche Gruppe mit einer bestimmten Signatur (T366A), aber diese Hypothese bedarf der Bestätigung durch die Sequenzierung des gesamten BNLF1 Gen in dieser Isolate bilden. Nach diesem Datum, schlagen wir vor, dass Polymorphismus im Gen BNLF1 ein zusätzliches Argument im Einklang mit den anderen EBV-Polymorphismen (D-Typ, Prototyp F und XhoI +) bilden die Unähnlichkeit der EBV-Stämme zwischen den beiden Regionen zu unterstützen.
Auf der Andererseits seits~~POS=HEADCOMP haben wir del-LMP1-Varianten zuvor
anderen beschrieben (69 bp und 81 bp-Deletion Spanning-Codons 334-353 und 345-371, jeweils) in der tunesischen NPC-Patienten [29, 43]. Diese Varianten wurden nicht gefunden, und nur die 30 bp del-LMP1-Variante wurde in allen Fällen EBVaGC wie bereits berichtet von Chen et al identifiziert., In einer großen Studie an chinesischen GC Patienten durchgeführt [35].
Unsere Polymorphismus Analyse von EBV bei gesunden Trägern Isolate ergab einen identischen Genotyp mit denen von EBVaGC und NPC darauf hindeutet, dass gemeinsame Stämme geographisch verteilt sind, aber nicht mit einem bestimmten malignen Erkrankungen in Verbindung gebracht. In der Tat könnte die Entwicklung von EBV assoziierten Malignitäten auf eine Variation in potentielle Immunerkennung in unterschiedliche Populationen und Individuen korreliert werden, wie von Edwards et al, [44].
Schlussfolgerung
Die Prävalenz von EBVaGC in Patienten aus südlichen Tunesien ist 14,8%, die mit gemeldeten Daten in Reichweite befindet. Die EBVaGC wurde überwiegend in der Gruppe der Patienten gefunden im Alter von 45 bis 60 Jahre alt, und dass EBV DNA-Ebene die EBER Status in Magenkarzinom widerspiegeln.
Außerdem EBV-Stämmen assoziiert tunesischen Patienten mit GC oder NPC einige Ähnlichkeiten darauf hindeutet, dass wahrscheinlich das gleiche EBV-Stamm sind mit beiden Tumoren. Insgesamt unsere Ergebnisse die verschiedenen geographischen Verteilung der EBV-Stämme unterstützen, nicht aber ihre Beschränkung auf eine zugehörige Malignität.
Erklärungen
Danksagung
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des tunesischen Ministeriums für Hochschulbildung und wissenschaftliche Forschung unterstützt wurde . Wir wünschen Herrn M Jaoua für die Sequenzierung Einrichtungen zu danken.
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