Epstein-Barr virus associato gastrica carcinoma: un rapporto dall'Iran negli ultimi quattro decenni

Epstein-Barr virus associato gastrica carcinoma: un rapporto dall'Iran negli ultimi quattro decenni
Abstract Background
di Epstein-Barr virus è stato dimostrato essere associato con molti dei malignità umana, compresa carcinoma gastrico , uno dei più importanti tumori umani nel mondo. Non ci sono stati studi sulla presenza di EBV in adenocarcinoma gastrico in Iran.
Metodi
Abbiamo esaminato la presenza di EBV nel 273 formalina casi fissate in paraffina di carcinoma gastrico da Cancer Institute dell'Università di Teheran, dal 1969 al 2004. L'ibridazione in situ di EBV-encoded piccoli RNA-1 (EBER-1) è stata condotta. Il ceppo di casi positivi è stata esaminata mediante reazione a catena della polimerasi e /o frammenti di restrizione analisi polimorfismo della lunghezza
Risultati
Abbiamo trovato 9. (3%; 95% CI = 1-5%) casi positivi EBV. La differenza di genere non era statisticaly significativo. La proporzione di casi EBV-GC in tipo diffuso era superiore di tipo intestinale (OR = 0,08; 95% CI = ,002-,64). casi EBV-GC ha avuto alcun rapporto con l'età, la posizione e l'invasione. Sei su 9 casi EBV-GC sono nati nel periodo compreso tra il 1928 e il 1930. Tutti i 9 casi erano tipo A. prototipo F è stata osservata in 6 su 8 casi. Tipo "i" è stata trovata in 8 casi e di tipo I in 1 caso. XhoI + e XhoI- polimorfismo hanno rappresentato rispettivamente 6 e 3 dei casi,.
Conclusione
Il nostro studio è il primo a descrivere la frequenza di EBV-GC in Iran e in Medio Oriente, mettendo in evidenza una prevalenza molto bassa con particolare clinicopathologic Caratteristiche. La predominanza di anno EBV-GC nascita in un determinato periodo, suggerisce che l'infezione da EBV o di altri eventi a prima infanzia possono essere correlate allo sviluppo di EBV-GC nel corso della vita. La predominanza del tipo "i" e XhoI + casi sono in contraddizione con altri studi in Asia ed è simile a quanto riportato dai paesi dell'America Latina.
Sfondo
virus di Epstein-Barr (EBV) è un DNA a doppio filamento onnipresente virus dalla famiglia herpes virus umano, che ha B-linfotropismo [1]. Più del 90% degli adulti nel mondo hanno evidenza sierologica di infezione da questo virus [1]. Si è acquisita durante la prima infanzia e l'età di infezione è molto più bassa nei paesi non sviluppati con una bassa condizione socio-economica [1]. Dopo l'infezione primaria, il virus instaura una infezione latente lunga vita nei linfociti B-cellule in cui è presente in 1 a 10 5-10 6 cellule circolanti [2]. Esso esprime alcuni antigeni in questa fase latente, che sono dimostrato di avere alcune proprietà oncogeniche [3-8]. Ci sono molti documenti su un'associazione causale tra EBV e tumori maligni linfoidi come il linfoma di Burkitt in Africa equatoriale [9], nasali T /NK linfoma a cellule [10], il linfoma di Hodgkin [11] e il linfoma a cellule B in pazienti immunodepressi [12]. EBV ha anche la capacità di infettare le cellule epiteliali, e ha anche effetto tumorogenicità in queste cellule da cui il carcinoma nasofaringeo è uno dei prototipi importanti [13].
Il primo rapporto di coinvolgimento EBV nel carcinoma gastrico è stato pubblicato nel 1990 a carcinoma linfoepiteliale dello stomaco [14]. Di conseguenza, nel 1992 Shibata e Weiss hanno riferito di rilevamento EBV nel 16% dei ordinario carcinoma gastrico in Stati Uniti [15]. Da allora, la prevalenza di carcinoma gastrico EBV-associato (EBV-GC) è stato indagato e riportato in diversi paesi che andavano dal 3 al 18% [15-34] con la più bassa prevalenza in Papua Nuova Guinea, Pakistan e Corea, che è tra l'1 e il 3% e la più alta in Germania e negli Stati Uniti, che è dal 16 al 18% di
ci sono molte testimonianze di relazione causale tra EBV e carcinoma gastrico, come:. monoclonalità dei virus nelle cellule neoplastiche, che è stata dimostrata da terminale unico ripetizione di EBV DNA [35]; presenza uniforme di EBV in tutte le cellule tumorali rilevate mediante ibridazione in situ di EBER-1, ma non nelle cellule epiteliali che circonda [15-34] e di elevazione di anticorpi IgG e IgA contro antigene del capside virale diversi mesi prima della presentazione clinica della malattia [36 .]
EBV-GC mostra alcune caratteristiche clinico-patologiche caratteristiche costanti, come la predisposizione di alto due terzi dello stomaco [15-17, 19-31]; tubolare moderatamente differenziato per tipo solido scarsamente differenziato di Istologia [16-22, 32, 33]; avendo alcun effetto in stromale invasione e la sopravvivenza [15, 16]; e predominanza maschile nella maggior parte degli studi. Tuttavia, l'ultimo non è visto in alcuni studi eccezionali che vengono eseguite in Messico [32, 37], Cile [16] e la Cina [38]. la dipendenza L'età non è evidente nella maggior parte degli studi. Tuttavia gli studi in Colombia [19], e il Kazakistan [28] mostrano una prevalenza più alta tra i pazienti più giovani.
EBV ha due tipi principali, tipo 1 e tipo 2 che si differenziano per la loro capacità di trasformare linfociti B in uno stato di continua proliferazione [39]. Tipo 1 è predominante nei paesi occidentali e asiatici mentre il tipo B è predominante in Africa ed è visto più comunemente nei pazienti immunosoppressi [40, 41]. Inoltre, ci sono altre tre varianti, che si distinguono in base alla lunghezza dei frammenti di restrizione polimorfismo (RFLP) utilizzando BamHI e XhoI enzimi di restrizione endonucleasi. Alla regione BamHI-F Prototype F ha la distribuzione in tutto il mondo e la variante 'f', che ha un sito in più per enzima è predominante nel sud della Cina ed è associata con il carcinoma nasofaringeo [42, 43]. Polimorfismo in /I1 regione di confine BamHI-W1 conduce a due varianti; Tipo I e 'i'. Tipo I che è predominante in Giappone e in Cina non ha alcun sito per BamHI enzima [44, 45] e digitare 'i' con un sito BamHI in più è visto più comunemente nei paesi occidentali [46]. Infine, il polimorfismo nel sito di restrizione XhoI in assone 1 del gene LMP1 definisce XhoI + che è più diffusa nei paesi occidentali [47] e XhoI -., Che viene spesso visto in Asia [44]
l'Iran è uno dei paesi che hanno un'alta incidenza di carcinoma gastrico, con un'incidenza annuale di 26,1 per 100.000 per i maschi e 11,1 per le femmine. E 'il secondo tumore più diffuso e la prima causa di decessi correlati al cancro negli uomini in Iran [48]. Tuttavia, non vi è alcuno studio circa la prevalenza o genotipo di EBV nel carcinoma gastrico in questo settore. Pertanto, abbiamo deciso di valutare nel più antico centro di riferimento per cancro gastrico in Iran.
Metodi
campioni
abbiamo esaminato 273 casi di cancro gastrico resezione chirurgica in questo studio. I casi sono stati selezionati in modo casuale da 1325 casi di cancro gastrico registrati negli istituti di cancro dell'Università di Teheran tra il 1969-2004 che hanno i blocchi di paraffina intatti e rapporti patologici. Formalina tessuto incluso in paraffina fissato da questi casi sono stati selezionati e inviato a Kagoshima University Graduate School of Medicina e odontoiatria, il Giappone, per ulteriori valutazioni molecolari. dati patologici sono stati ottenuti con rivalutazione di H & diapositive e colorati con due patologi (AA & SGS). Tutti i dati demografici disponibili sono stati ottenuti dai rapporti patologici e medici disponibili dei pazienti.
Patologia
Tutti i campioni sono stati riclassificati in materia di modello istologico predominante come intestinale e il tipo di diffuso secondo la classificazione Lauren [49] e sub-classificati secondo le linee guida della società di ricerca giapponese per cancro gastrico [50] per adenocarcinoma tubolare ben differenziato (tub1), adenocarcinoma moderatamente differenziato (tub2), adenocarcinoma scarsamente differenziato solido (POR1), non solida-adenocarcinoma scarsamente differenziato (por2 ), carcinoma a cellule anello con sigillo (sIG), il carcinoma mucinoso (MUC) e il carcinoma linfoepiteliale come scarsamente differenziati (lE).
La posizione tumori in base alla posizione predominante delle lesioni sono stati classificati come terzo o cardias superiore, terzo medio o corpo e terzo inferiore o antro secondo le linee guida della società di ricerca giapponese per cancro gastrico [50]. Non c'era nessun caso multifocale nel nostro studio.
La profondità dell'invasione è stato classificato come mucosa, sub-mucosa, muscolare propria e coinvolgimento sierosa.
Ibridazione in situ
EBV è stato identificato con l'espressione di EBV-codificato piccoli RNA-1 (EBER-1). In situ ibridazione con una complementare oligomero 30-base marcata con digossigenina è stato utilizzato per rilevare la EBER-1 secondo il procedimento precedentemente descritto da Chang et al [51]. sezioni 4-5 micron montate su vetrini rivestiti di silano sono stati preparati per ciascun caso. Il tessuto sui vetrini è stato deparaffinate, reidratato, predigerito con pronasi, prehybridized, quindi ibridato notte a 37 ° C con 0,5 ng sonda marcata con digossigenina. Il segnale di ibridazione è stato rilevato da un antidigoxigenin anticorpo coniugato di fosfatasi alcalina. Le sezioni da un paziente con nota EBER-positivo carcinoma gastrico sono stati utilizzati per un controllo positivo e il senso sonda per EBER-1 è stato utilizzato per un controllo negativo per ogni procedura
. Preparazione del DNA
Il fissati in formalina e paraffina esemplare -Embedded stato tagliato in 10 micron fette spesse e campione di DNA è stato preparato seguendo il metodo descritto da Greer et al [52]. Brevemente, le fette sono state trattate con xilene e etanolo e centrifugati a 22.000 g per 20 minuti e il pellet risultante è stato risospeso in 100 ml di tampone di digestione (1 M Tris, pH 8,0, 50 mM EDTA, 0,5% Tween 20) con 200 ug /ml proteinasi K ed incubate a 55 ° C per una notte. Dopo 10 min di ebollizione a 100 ° C, estrazione e precipitazione del DNA è stata effettuata con rispettivamente fenolo-cloroformio e etanolo,.
Primer e sonde
quattro diverse regioni, EBNA-3C, BamHI-F, BamHI-W1 /I1, e XhoI sito in LMP1, sono stati utilizzati per determinare i genotipi virali. La tabella 1 mostra l'elenco dei set di primer e sonde utilizzati nel presente study.Table 1 Lista di primer e sonde utilizzato in questo studio
genotipo
Sequence
Tipo dalla sonda o dimensione dopo RE1 digestione
Riferimento
EBNA-3C
Primer
senso
5'-AGAAGGGGAGCGTGTGTTGT-3 '
antisenso
5'-GGCTCGTTTTTGACGTCGGC-3
campione et al. (53)
Sonde
tipo 1
5'-GAAGATTCATCGTCAGTGTC-3 '
153 BP2
tipo 2
5'-CCGTGATTTCTACCGGGAGT-3'
246 bp
BamHI-F
Primer
senso
'
5'-TCCCACCTGTTACCACATTC-3 prototipo F: 198 bp
Lung et al. (54)
antisenso
5'-GGCAATGGGACGTCTTGTAA-3 '
Variante "f": 127 + 71 bp
Probe
5'-AAGGCTACCGTGCTAATTACCTCC-3'
Hudson et al. (55)
BamHI-W1 /I1
Primer
Senso
5'-ACCTGCTACTCTTCGGAAAC-3 '
di tipo I: 205 bp
Lung et al. (54)
antisenso
5'-TCTGTCACAACCTCACTGTC-3 '
TIPO "I": 130 + 75 bp portale XhoI in LMP1
Primer
senso sull'otturatore
5'- AACAGTAGCGCCAAGAGGAG-3 '
XhoI +: 113 bp
Sandvej et al. (56)
antisenso
5'-ATGGAACACGACCTTGAGAGG-3 '
XhoI-: 67 + 46 bp
1Restriction enzima; 2base coppie
tipo 1 e 2 sono stati riconosciuti mediante amplificazione della regione U2 del gene EBNA-3C da primer descritti da campione et al [53] che ha prodotto i frammenti 153 e 246 bp rispettivamente. Essi sono riconosciuti da ibridazione Southern blot (SBH) con sonde interne specifici del tipo descritto da campione et al [53]. La regione BamHI-F è stato amplificato dal set primer descritto da Lung et al [54]. La conseguente frammento di 198 bp è stato digerito con BamHI enzima di restrizione, che ha urlato un frammento di 198 bp nel caso di wild type F e 127-bp e 71 bp frammenti nel caso della variante di 'F'. La wild-type F e varianti f sono stati confermati dalla SBH con la sonda interna come descritto in precedenza [55]. Per distinguere I /I varianti, la regione /I1 BamHI-W1 è stato amplificato utilizzando il set di primer descritta da Lung et al [54]. La digestione con enzima di restrizione BamHI urlato frammento di 205 bp nel tipo I e frammenti di 130 bp e 75 bp nel caso di 'i'. Sono stati confermati anche da SBH con una sonda frammento BamHI-I DNA clonato. L'analisi del polimorfismo nell'esone 1 del gene LMP1 è stata effettuata utilizzando un set di primer descritto da Sandvej et al [56] che ha portato frammenti di 113 bp. Dopo la digestione con enzima di restrizione XhoI, XhoI + casi che contengono sito di taglio XhoI (XhoI mantenuto) mostrano frammenti di 67 bp e 46 bp ma XhoI - casi mostrano il prodotto di PCR 113 bp digerito originale. Il frammento 113 bp del prodotto di PCR della linea cellulare B95-8 è stato utilizzato come sonda per confermare XhoI di sfaldatura di LMP1 da SBH [57]. Compra di tipo 1, tipo selvaggio F, tipo I, e XhoI - virus la linea cellulare B95-8 è stato utilizzato come controllo positivo. Le linee cellulari AG786 e Akata e la clonato BamHI-'f 'e BamHI- "i" frammenti di DNA serviti come controlli positivi per il tipo 2, XhoI -, variante "f" e digitare "i" virus, rispettivamente. herpesvirus umano 6 cellule infettate MOLT-4 utilizzato come controllo negativo [58]. reazione a catena della polimerasi

amplificazione del DNA bersaglio è stata effettuata utilizzando 2 ml di DNA e la miscela di 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 50 mm KCl, 1,5 mM MgCl 2, 200 mM dNTP, 1 mM di ciascun primer e 1,0 U Taq Polymerase (Hot Star, Qiagen, Germany) in un volume finale di 25 microlitri miscela. Il protocollo utilizzato per l'amplificazione del gene EBNA-3C era un ciclo a 95 ° C per 15 minuti, seguiti da 40 cicli di denaturazione a 95 ° C per 1 minuto, appaiamento a 46 ° C per 1 min e allungamento a 72 ° C per 1 min e infine chiuso con 5 min a 72 ° C. Il protocollo utilizzato per BamHI-F, BamHI-W1 /I1 ed amplificazione sito XhoI era un ciclo a 95 ° C per 5 min seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 ° C per 1 minuto, appaiamento a 43 ° C per 1 min e allungamento a 72 ° C per 1 min e infine chiuso con 5 min a 72 ° C. Elettroforesi in un gel di agarosio al 2% e colorazione con 0,5 ug /ml di bromuro di etidio è stata effettuata per identificare i prodotti di PCR.
Analisi di restrizione frammento lunghezza polimorfismo
prodotti amplificati di DNA (15 microlitri) sono stati digeriti con 10 U di BamHI o XhoI enzimi di restrizione, secondo le istruzioni del produttore e visualizzati mediante elettroforesi in un gel di agarosio al 2% colorato con 0,5 ug /ml di bromuro di etidio e trasferite su una membrana di nylon per SBH.
Southern blot ibridazione
Specificità di PCR reazione è stata confermata da SBH. Il DNA elettroforetico è stata trasferita su una membrana di nylon Hybond N + (Amersham Pharmacia Biotech, UK) per capillarità blotting utilizzando 0,4 soluzione N NaOH. Le membrane sono state prehybridized con tampone di ibridazione per 1 ora a 42 ° C. Dopo aver aggiunto la sonda, l'ibridazione è stata effettuata una notte a 42 ° C. Sonde di tipo A e B, e BamH-I F sono stati etichettati con Dig oligonucleotide 3'-end kit di etichettatura e rilevati da Dig kit di rilevamento luminescente (Boehringer Mannheim, Germania). Per rilevare il frammento BamHI-I e XhoI polimorfismo in LMP1, ibridazione è stata effettuata utilizzando l'etichettatura e la rilevazione diretta kit ECL (Amersham, Pharmacia Biotech, UK) in base alle istruzioni del produttore.
Analisi statistica
analisi statistica è stata fatto utilizzando LogExact 7.0 software (un pacchetto statistico per la procedura di regressione con metodo esatto); Cytel Studio 7.0.0 pacchetto (Cytel Software Corporation, 2005). test esatto di analisi logistica binaria è stata condotta per confrontare la proporzione di casi positivi EBV tra adenocarcinoma gastrico. Sesso, età (< 50, 50-69 e ≥ 70 anni), la posizione anatomica del tumore (antro, corpo e Cardia), invasione del tumore (sierosa, altri) e la classificazione istologica di Lauren sono stati inclusi come variabili indipendenti. variabili multinomiale sono stati divisi a n-1
variabili binomiali fittizie (n
era il numero di categorie). odds ratio con il 95% intervallo di confidenza è stato calcolato per ogni categoria. Type 1 errore (α) è stato fissato a 0,05. Tutti i valori di p erano a due code.
Risultati
Abbiamo esaminato 273 tumori gastrici, tra cui 196 (72%) maschi e 77 (28%) femmine. L'età media era di 57,3 ± 11,3 (SD) anni (range: 24-90; mediana: 58). La maggior parte di essi (108 casi; 66%) sono stati tra i 50 ei 69 anni, 54 (20%) casi erano sotto i 50 ed i rimanenti sono stati oltre 70 anni. Un centinaio di trenta casi (48%) erano situate in antro, e 64 (23%) e 71 casi (26%) erano situati nel corpo e Cardia, rispettivamente. In 5 casi la posizione non è stato definito e in 3 casi tutta la parete gastrica sono stati coinvolti (linite plastica), che non sono stati inclusi nell'analisi statistica. Come mostrato nella tabella 2, la maggior parte dei casi erano tipo intestinale (56%). Tabella 2 Distribuzione di Eber-1 carcinomi gastrici positivi per tipo istologico e genere
Histology1
Maschio
femminile
totale

EBER + /N2 (%)
EBER + /N (%)
EBER + /N (%)
intestinale
1/113 (1)
0/39 (0)
1/152 (1)
pap
0/11 (0)
0/3 (0)
0/14 (0)
tub1
0/36 (0)
0/11 (0)
0/47 (0)
tub2
1/50 (2)
0/16 (0)
1/66 (1)
MUC
0/16 ( 0)
0/9 (0)
0/25 (0)
Diffondere le
7/83 (8)
1/38 (3)
8/121 (7 )
POR1
3/34 (8)
1/16 (6)
4/50 (8)
por2
4/40 (10)
0 /18 (0)
4/58 (8)
sig
0/9 (0)
0/4 (0)
0/13 (0)
1 pap: adenocarcinoma papillare; tub1: adenocarcinoma tubolare ben differenziato; tub2: adenocarcinoma moderatamente differenziato; POR1: adenocarcinoma solido scarsamente differenziato; por2: non solido adenocarcinoma scarsamente differenziato; Sig: carcinoma a cellule anello con sigillo; muc: il carcinoma mucinoso; 2 il numero totale di casi in ciascun gruppo (Basato sulla società di ricerca giapponese per il cancro gastrico)
prevalenza di casi positivi EBV
EBER-1 è stato rilevato in nove su 273 casi (3%) che sono state considerate come EBV GC. Il segnale è stato limitato ai nuclei di cellule tumorali, ma non trovato in cellule non tumorali (Fig. 1). Figura 1 Un caso di EBV carcinoma gasrtric positivo. Moderatamente differenziato adenocarcinoma tubolare con formazione tubul occasionale (A); EBER nucleare segnale positivo in tutte le cellule tumorali rilevate con ibridazione in situ (B).
I fattori associati con casi positivi EBV
tabella 3 mostra le frequenze di EBV-GC per età, sesso, localizzazione, istologia e l'invasione pure come il risultato di logistica analysis.Table 3 risultato di analisi logistica
Variabili
EBER + /N1
(%)
OR2
95% CI2
genere
Femminile
1/76
(1)
1 riferimento
Maschio
8/188
(4)
0,3
0,01-2,96
P = 0,595

Età
≥ 70
1/36
(3)
1 riferimento
50-69
5/180
(3)
0.8
0,08-44,62
< 50

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