Evaluering og kliniske betydning af maven alder model for vurdering ældning af maven-et multicenter studie i Kina

Evaluering og kliniske betydning af maven alder model for vurdering ældning af maven-et multicenter studie i Kina
Abstrakt
Baggrund
En højere forekomst af kronisk atrofisk gastritis (KAG) forekommer i yngre voksne i Asien. Vi brugte Mave Alder at undersøge de forskellige ordninger for CAG mellem yngre voksne og ældre mennesker, og etableret en simpel model for kræftrisiko, der kan anvendes til CAG overvågning.
Metoder
Mave Alder blev bestemt ved FISH undersøgelse af telomer længde i mave biopsier. ATm blev også bestemt ved flowcytometri. Tres frivillige blev anvendt til at bekræfte den lineære sammenhæng mellem telomer længde og alder, mens 120 individer blev anvendt til at opbygge en matematisk model af en multivariat analyse. Samlet blev 146 individer anvendt til at evaluere validiteten af ​​modellen, og 1.007 forsøgspersoner blev anvendt til at vurdere forholdet mellem prognosen og Δage (beregnet ud fra den matematiske model). ROC kurver blev anvendt til at vurdere forholdet mellem prognose og Δage og til at bestemme cut-off point for Δage.
Resultater
Vi konstaterede, at en stram lineær sammenhæng mellem telomer længde og alder. Den telomer længde var indlysende forskellige mellem patienter med og uden KAG selv i samme alder. ATm faldt i individer, hvis Mave Alder var større end reel alder, især hos yngre voksne. En matematisk model af mave Alder (virkelige alder + Δage) lykkedes konstrueret som var let at anvende i klinisk arbejde. En højere Δage var korreleret med en dårligere resultat. Kriteriet om Δage > 3.11 bør betragtes som cut-off for at vælge den undergruppe af patienter, der kræver endoskopisk kontrol
Konklusion
Variation i maven Age mellem individer af samme biologiske alder blev bekræftet.. Man bør være opmærksom på dem med en større mave Age, især hos yngre voksne. Den Δage i den simple model kan bruges som et kriterium for at vælge CAG patienter til mavekræft overvågning.
Nøgleord
Mave Alder Kronisk atrofisk gastritis mavekræft Model overvågning Baggrund
Kronisk atrofisk gastritis (KAG) blev opført som præcancer betingelse for mavekræft af WHO i 1978. det er blevet observeret, at en moderat øget risiko for mavekræft med tilstedeværelsen af ​​CAG efter 10 års opfølgning [1]. Fordi CAG tendens til at være livslang, og spontan helbredelse er sjælden [2], er det ingen tvivl om, at yngre voksne med CAG ville have en højere risiko for mavekræft grund af den lange varighed sygdom.
Nogle eksperter mener, at den patologiske degenerative forandringer af CAG kan være en semi-fysiologisk fænomen, især i den ældre befolkning [3]. Imidlertid er en høj forekomst blandt yngre voksne findes i nogle højrisiko områder for mavekræft i Asien [4]. Vores forskning har til formål at undersøge de forskellige underliggende årsager til CAG mellem forskellige aldersgrupper.
Telomere erosion kan betragtes som en biologisk ur [5]. Som telomerer forkorte med alderen hos mennesker og for tidlig ældning syndromer er ofte forbundet med forkortede telomerer, er det blevet foreslået, at telomer længde er en vigtig parameter i aldring. reduktion telomerlængde er blevet bekræftet i sygdomme, såsom hypertension [6], diabetes og koronar hjertesygdom [7, 8], og det er også blevet bekræftet i celler af den humane skjoldbruskkirtel og parathyroidea [9], samt lever, nyre og hud [10]. Men om dette er også tilfældet med CAG eller i maven modningen fortsat uklart.
For at løse disse spørgsmål, kvantificering af telomer længde er afgørende. Nylige undersøgelser har beskrevet en fremgangsmåde til fluorescens in situ hybridisering
(FISH), der er hurtigere og mere pålidelig end sammenlignelige teknikker [11-14], som også kan anvendes til paraffinindlejret vævsprøver [15]. Ved hjælp af FISH, var vi i stand til at måle telomer længde af kromosomer i maven celler fra biopsiprøver opnået ved endoskopi.
I denne undersøgelse definerer vi en ny periode af "Mave Age", som kan bruges til at evaluere den aldrende maven og er baseret på telomer længde maven celler. Vi har forsøgt at bruge dette koncept til at forklare fænomenet CAG hos yngre voksne, og at etablere en simpel matematisk model til beregning af mave Age, som kan anvendes klinisk til prognosticering.
Metoder
forsøgspersoner og arkiveres vævsprøver at etablere maven Age model
Vævsprøver blev indhentet fra de patologi arkiver GI Division på Shanghai Jiao-Tong University School of Medicine, Renji Hospital og otte andre medicinske centre (Military General Hospital i Beijing PLA, First Affiliated Hospital of Nanchang Universitet First Affiliated Hospital i Nanjing Medical University, First Affiliated Sygehus af Anhui University, First Affiliated Sygehus af Soo-Chow University, Qilu Hospital i Shandong University, Second Military Medical University, Changhai Hospital og Changzheng Hospital). Formalin-fikseret paraffinindlejrede blokke blev hentet fra 246 individer (60 raske frivillige og 186 ambulante patienter på gastrointestinale kliniske afdelinger), der gennemgik endoskopi. Mindst to biopsier blev taget fra antrum og corpus på både store krumning og mindre krumning af maven, og derefter rutinemæssigt indlejret i paraffinblokke, snittet og farvet. Vævssnit (3-4 um) fra hver prøve blev anvendt til den histopatologiske undersøgelse og FISH. Endnu to biopsier taget fra antrum blev bevaret i flydende nitrogen og holdes ved -80 ° C i flowcytometri.
Undersøgelse befolkning til at evaluere den prædiktive evne til mave Age model
Relevante oplysninger fra 1.200 patienter på Shanghai Jiao -Tong University School of Medicine, Renji Sygehus blev analyseret. Ved baseline tidspunkterne, alle deltagere gennemgik endoskopisk undersøgelse med biopsier, som blev gentaget mindst én gang på efterfølgende besøg i løbet af opfølgningsperioden. De relevante oplysninger om de histologiske resultater og svarene på spørgeskemaet, der er beskrevet nedenfor, blev registreret og sammenlignet mellem aldersgrupper.
Spørgeskema
Vi interviewede alle deltagere ved hjælp af en standard selvadministreret spørgeskema til at vurdere baseline karakteristika. Den gennemsnitlige tid til at udfylde spørgeskemaet var ca. 15-20 minutter. Spørgeskemaet indeholdt følgende: 1) demografiske faktorer; 2) enhver familie historie af medicinske tilstande, herunder kræft; 3) en detaljeret medicin historie; 4) sovevaner og kvalitet, og job pres; 5) antallet af cigaretter røget per dag og varigheden af ​​rygning; 6) hyppigheden og mængden af ​​vand, mælk, drikkevarer, vin og spiritus taget; 7) te og kaffe drikkevaner; 8) forbruget af ris, kød, fisk, grøntsager, frugt, syltede grøntsager eller saltede fermenterede produkter, og tørrede levnedsmidler; og 9) foretrukne varianter, tilberedningsmetoder og indtagelse af night snacks.
Histopatologisk diagnose og Helicobacter pylori infektion vurdering
Hver farvede objektglas blev undersøgt uafhængigt af to erfarne patologer, der var uvidende om den enkeltes kliniske detaljer ved hjælp af den opdaterede Sydney klassifikation [16]. Når der var uenighed, de biopsier blev fornyet overvejelse, indtil der blev opnået enighed. To histopatologiske enheder blev defineret: kronisk ikke-atrofisk gastritis (CNAG) og CAG. CNAG blev defineret som enhver grad af inflammation uden atrofi i både corpus og antrum. CAG blev defineret som atrofi eller /og intestinal metaplasi (IM) i enten corpus eller antrum. De histologiske træk ved de biopsier blev registreret som let, moderat eller svær ifølge Sydney pointsystem. Patienter med ingen eller utilstrækkelige biopsier blev udelukket fra undersøgelsen. Helicobacter pylori
infektion blev påvist ved enten hurtig urease test af biopsiprøver eller [13] 13-C urease udåndingsprøve.
FISH
Hybridisering blev udført ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev objektglassene afparaffiniseret og rehydreret gennem en række ethanol gradienter, behandlet med 0,1% Tween 20 detergent i deioniseret vand, inkuberet i citratbuffer (Target demaskering opløsning; Vector Laboratories, Burlingame, USA) i damp, nedsænket i de- ioniseret vand og fikseret i ethanol gradienter, og lufttørret. Ca. 10 pi PNA-probe blev tilsat til hvert objektglas. PNA-proben for telomere sekvenser var en klar-til-brug-probe inkluderet i telomer PNA Fish Kit /FITC (K5327; DakoCytomation A /S, Glostrup Danmark.). Objektglassene blev derefter dækglas, inkuberet ved 84 ° C i 5 minutter og hybridiseret i 2 timer ved stuetemperatur i mørke. Efter omfattende vaskning først ved 65 ° C og derefter ved stuetemperatur med PBST. Kernerne blev derefter farvet med DAPI (1 ug /ml, Molecular Probes, Eugene, OR), efter vasket i stilled vand blev objektglassene monteret med antifade monterings medier (Prolong ™ Anti-fade Montering Medier; Molecular Probes, Eugene, OR , USA).
Mikroskopi og dataanalyse
Slides blev afbildet under anvendelse af et epifluorescensmikroskop (Nikon Eclipse 80i). Fluorescens excitation /emission anvendte filtre var FITC 490 nm BP excitation via et XF38 filtersæt. Fluorescens billeder blev taget med en afkølet charge-coupled device-kamera (Nikon DSRil). For vævssnittet, blev de beregnede områder identificeret i henhold til H &E-farvede objektglas før fluorescensmikroskopi som indeholdt epitelceller og kirtlerne (pylorus kirtler i antrum og fundiske kirtler i corpus). Efter at den beregnede områder automatisk blev inddelt i fem regioner af den professionelle software (Image-Pro Plus 6.0). Mindst 1.000 kerner blev beregnet i hver region. Fem regioner hvert væv sektion blev undersøgt for telomer mærkning; intensiteten af ​​fluorescensen blev anvendt for at afspejle dette. Telomere signaler blev kvantificeret ved en metode valideret nylig, at summen af ​​pixel intensiteter i FITC-kanalen for en given cellekerne er normaliseret til DAPI signal. DAPI-farvning giver en robust mål for DNA-indhold, er stort set ufølsom for celletype, proliferation status, og graden af ​​chromatinkondensering [17-19]. Hver region af vævssnittet blev undersøgt for telomer mærkning uafhængigt af to erfarne teknikere på forskellige tidspunkter. Korrelationskoefficienterne blev estimeret.
Flowcytometri og måling af A ^ m
A ^ m, spændingen over den indre mitokondrielle membran, kan ændres ved oxidativ skade, som den, der forekommer under modningen. Undersøgelser viste, at A ^ m faldt gradvist med alderen [20, 21]. Så vi mente, at ATm kan anvendes til at evaluere den aldrende maven og som en måling for at validere begrebet "mave Age". For at understøtte vores undersøgelse, vi bestemt værdien af ​​A ^ m af disse patienter. Antrum biopsiprøver blev først fremstillet som enkeltcelle-suspensioner ved anvendelse af en vævs- dissociation kit ifølge producentens protokol (KGA829, Keygen Biology Co., Ltd, Nanjing, Kina). For farvning blev cellerne inkuberet med JC-1 (Molecular Probes, Invitrogen, Tyskland) i 30 minutter ved 37 ° C i mørke. Cellerne blev derefter vasket i PBS og analyseret med det samme ved flowcytometri (FACScan, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). I alt 10.000 celler blev undersøgt for grøn fluorescens under anvendelse af et 529 nm filter og til orange fluorescens under anvendelse af et 590 nm filter. Alle data blev analyseret under anvendelse BD Cell Quest Pro software (BD Biosciences).
Statistisk analyse
Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS 17.0 statistisk software. Den parrede t-test
, Chi-square test og variansanalyse blev anvendt. Alle data blev præsenteret som gennemsnit ± SE. Forskelle blev anset for at være statistisk signifikant ved P
< 0,05. Multivariat analyse blev udført ved logistisk regression ved hjælp af en baglæns elimination procedure for variabler ikke signifikant associeret med Δage (mave Age-real alder P
= 0,05) [22]. Følsomheden og specificiteten af ​​modellerne blev beregnet. Udførelsen af ​​den prædiktive model blev vurderet ved arealet under Receiver Operating karakteristik (AUROC). Vi valgte den højeste Youden indeks som den optimale skæringspunkt [23].
Etik
forsøgsprotokollen blev accepteret af Renji Hospital etiske komité (Shanghai, Kina). Hver deltager var forpligtet til at underskrive en informeret samtykkeerklæring.
Resultater
lineær sammenhæng mellem telomer længde og alder i maven celler
For at vurdere maven Age, vi havde til formål at fastlægge ensartede kriterier for mave Alder i raske mennesker. Sixty antrum biopsier fra raske frivillige blev anvendt til at fastlægge de almindelige kriterier. Disse omfattede 30 mænd og 30 kvinder i alderen 23-76 år, i hvem endoskopi viste en generelt normal gastrisk foring og i hvem maven Alder blev anset for at være den samme som deres reelle alder. Fem regioner hvert væv sektion blev undersøgt for intensiteten af ​​telomer mærkning; den gennemsnitlige intensitet blev anvendt til regressionsligning. Den gennemsnitlige variationskoefficient var 0,097, som vi anser for tilfredsstillende. De frivilliges karakteristika og fluorescensintensitet er anført i tabel 1. Som vist i figur 1, en stram lineær sammenhæng (goodness of fit: r
2 = 0,8263) eksisterede mellem intensiteten af ​​telomer mærkning og alder. Ligningen af ​​den beregnede regressionslinjen er x
(år) = (17,719-y
) /0.174. I denne ligning, y
var værdien af ​​fluorescensintensitet på FISK og x
var alderen. Korrelationskoefficienten mellem FISH data og alder er r = √0.8263 = 0,91. Således har vi demonstreret klart et lineært fald i telomerlængde med alderen stigende. Ved at bruge ovenstående ligning den biologiske aldring niveau af maven (mave Alder) af enhver kunne være præcist udtrykt i intensiteten af ​​fluorescens på FISH og sammenlignet individually.Table 1 karakteristika og fluorescensintensitet af frivillige
Aldersinterval ( år)
21-30
31-40
41-50
51-60
61-70

71-80
Samlet antal
6
12
9
15
12
6
antal mandlige
3
9
6
9
6
3
Fluorescensintensitet (gennemsnit ± SD)
14,8 ± 0,69
11,8 ± 0,92
9 ± 1,07
7,87 ± 1,64
6.18 ± 0,76
6,15 ± 0,04
Beskæftigelse
Student
3
0
0
0
0
0
Professional
0
4
4
2
1
0
Administrative
0
2
1
3
1
0
Salg
1
3
1
0
0
0
Blue-collar
1
2
1
0
0
0
Freelance
1
1
2
0
0
0
Pensioneret
0
0
0
10
10
6
Familie historie
Mavekræft
0
0
0
0
0
0
Andre kræft
0
0
1
0
0
0
historie mavesår
0
0
0
0
0
0
Rygestatus & historie
0
2
2
1
1
0
Sjældent
0
1
0
0
1
0
< 10 cigaretter om dagen
0
1
2
1
0
0
10-20 cigaretter om dagen
0
0
0
0
0
0
> 20 cigaretter om dagen
0
0
0
0
0
0
Mindre end 5 år
0
1
0
0
0
0
5-10 år
0
1
1
0
0
0
Mere end 10 år
0
0
1
1
1
0
alkoholindtagelse vaner
0
2
1
2
1
0
< 250 ml pr dag
0
2
1
2
0
0
> 250 ml pr dag
0
0
0
0
0
0 Salg Mindre end 5 år
0
1
0
0
0
0 Salg Mere end 5 år
0
1
1
2
1
0
Kaffe vaner
2
1
0
0
0
0
Tea drikkevaner
1
2
2
1
0
1
Figur 1 mave Age af frivillige. De frivilliges alder og intensiteten af ​​fluorescens på fluorescens in situ hybridisering
er tæt korreleret lineært (R
2 = 0,8263), når en simpel regressionsanalyse anvendes (y
= -0.174x
+ 17,719, hvor y
er fluorescensintensitet og x
er mave Alder). Omorganisering denne ligning, maven Age model er x
(år) = (17,719 -y
) /0.174.
Forskellige telomer længder mellem CAG og CNAG patienter
andet fandt vi, at telomer længde var indlysende forskellige mellem patienter med og uden KAG. På samme alder, intensiteten af ​​fluorescensen af ​​lavere hos CAG patienter end CNAG patienter (figur 2), hvilket tyder på, at CAG kan accelerere mave aldring. Denne ændring kan gøre graden af ​​maven aldring hos unge patienter med CAG ækvivalent med den for ældre individer. Derfor er vi postuleret, at personer af samme biologiske alder kan have en anden mave Age, som kunne blive påvirket af risikofaktorer såsom gastrisk atrofi og IM. Figur 2 Fluorescens in situ hybridisering (FISH) af mave biopsier. FISH blev udført på biopsiprøver fra patienter ved endoskopi. Telomerer farves med et FITC-mærket antitelomeric sonde og er farvet grønt. Picture A (mand, 40 år, endoskopi resultat: CNAG) demonstrerer stærke telomer signaler i normal mave. Picture B (mand, 40 år, endoskopi resultat: CAG med moderat intestinal metaplasi) viser svage telomere signaler i atrofisk væv, hvilket indikerer, at CAG kan accelerere ældning af maven. Original forstørrelse:. × 40 (A, B)
Flowcytometri og måling af A ^ m
at opnå yderligere beviser til støtte for vores hypotese, vi bestemt værdien af ​​A ^ m. Hvis CAG do fremskynde mave aldring bør den ATm af de patienter falde samtidigt.
JC-1 (5 ', 6,6'-tetrachlor-1,1'3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodid) kan anvendes som en indikator for mitokondriepotentiale, som, når beskadiget, spiller en central rolle i modningen [24]. I celler, der har mitochondrier med stor A ^ m, JC-1 danner orange fluorescerende J-aggregater (Q2 område), mens der i celler med depolariserede eller beskadigede mitokondrier, sensoren farvestof er til stede som grønt fluorescerende monomerer (Q4 område). Vi beregnede telomerlængde af indskrevne patienter (146 personer), og derefter opnået maven Age af disse emner ved hjælp af maven Alder ligning (opnået fra de sundhedsmæssige frivillige). Efter at vi sammenlignede deres A ^ m-værdier.
Vi definerede individer under 50 år, da den yngre voksne gruppe, og personer i alderen ≥ 50 år var den ældre voksne gruppe (figur 3). I CNAG patienter yngre voksne, maven Ages var yngre end eller lig med deres reelle alder, de fleste af prøven celler blev lokaliseret i Q2-regionen (høj A ^ m). Men i CAG patienter yngre voksne, var maven Ages større end deres reelle alder, de fleste cellulære prikker flyttet fra 2. kvartal til 4. kvartal regionen, hvilket indikerer et tab af A ^ m, og det relative forhold af cellulære prikker i Q2 regioner faldt betydeligt ( P
< 0,05). Den samme tendens opstod i ældre voksne, men skiftet i forholdet var ikke så stor som i den yngre gruppe. Disse resultater indikerer, at KAG kunne accelerere mave aldring ledsage med den faldende af A ^ m. Den Aijjm faldt i individer, hvis Mave Alder var større end deres reelle alder, især hos yngre voksne (P
< 0,05). Mave Alder kan repræsentere biologiske alder af maven mere præcist end den sande biologiske alder. Figur 3 Måling af mitochondriemembranpotential (A ^ m). A) Samlet set 90,82% af celler i Q2-regionen, og kun 2,03% i 4. kvartal (mand, 32 år, mave Alder 31 år, endoskopi resultat: CNAG); B) 83,91% af cellerne i 2. kvartal, og 13,49% i 4. kvartal (kvinde, 77 år, mave Alder 76 år, endoskopi resultat: CNAG); C) 69,06% af cellerne i 2. kvartal, og 25,92% i 4. kvartal (kvinde, 30 år, mave Alder 52 år, endoskopi resultat: CAG med svag atrofi og tarm metaplasi); D) 65,29% af cellerne i 2. kvartal, og 31,37% i 4. kvartal (kvinde, 65 år, Mave Alder 74 år, endoskopi resultat: CAG med let atrofi og moderat tarm metaplasi). Forskellen er signifikant inden for hver gruppe og mellem de to grupper (P
< 0,05).
Evaluering og etablering af den simple model i et multicenter studie
Til brug i klinisk praksis, forsøgte vi at ændre ligning af maven alder for at opnå en simpel model. 120 prøver, herunder 60 frivillige blev anvendt (De detaljerede egenskaber er anført i tabel 2). For det første, vi målte prøverne 'intensitet på FISK, og derefter beregnes den enkeltes mave Alder hjælp af equation.Table 2 De baseline variabler og histologisk evaluering af 120 emner til at etablere model
Antal mandlige

Antal kvindelige

• Angiotensin II receptor-ekspression og relation til Helicobacter pylori-infektion i maven af ​​den mongolske gerbil
• Gastrointestinal stromal tumor i maven efterligne en levertumor: en sag report