IL-1β-inducerad aktivering av p38 befrämjar metastaser i magcancer via uppreglering av AP-1 /c-fos, MMP2 och MMP9

IL-1β-inducerad aktivering av p38 befrämjar metastaser i magcancer via uppreglering av AP-1 /C-fos , MMP2 och MMP9 Bild Sammanfattning
bakgrund
interleukin-1β (IL-1β) har varit inblandad i utvecklingen av magcancer (GA); dock de molekylära mekanismerna för verkan av IL-1β i GA dåligt karaktäriserade. P38 och JNK är de stora MAPK familjemedlemmar som reglerar IL-1β signalvägar. Här undersökte vi rollen av både p38 och JNK i IL-1β-inducerad GA cell migration, invasion och metastatisk potential.
Metoder
Effekterna av IL-1β-inducerad p38 och JNK-aktivering i GA-celler bestämdes med användning av in vitro-Transwell migration och invasionsanalyser av MKN-45 och AGS-celler eller en in vivo-metastas-analys i nakna möss. IL-1β-inducerad p38 signalväg vidare kännetecknat av GA-celler. Aktivering av IL-1β /p38 signalväg bedömdes också i humana primära GA vävnader genom immunhistokemi.
Resultat
IL-1β-inducerad aktivering av p38 ökade GA cellmigration och invasion in vitro och främjat metastatisk potential GA-celler in vivo; dessa effekter dämpas av p38 siRNA eller p38-inhibitor SB202190 den. MMP2 eller MMP9 siRNA och MMP2 /9-hämmare BIPS inhiberade också IL-1β-inducerad GA cellmigration och invasion in vitro. IL-1β-inducerad p38-aktivering signifikant ökad MMP2 och MMP9 mRNA och proteinuttryck och aktivitet. Luciferas reporter analyser visade att aktivatorprotein-1 (AP-1) och AP-1-bindning med de MMP9
promotorn (-670 /MMP9) aktiverades genom IL-1β-inducerad p38-aktivering. Fosfo-p38 var signifikant uppregleras i humana GA vävnader (jämfört med matchade icke-neoplastiska vävnader), och signifikant associerade med lymfkörtelmetastaser och invasion bortom slemhinnorna. Expression av fosfo-p38 signifikant korrelerad med IL-1β, MMP2, MMP9, och c-fos-uttryck i både humana GA vävnader och GA cell metastaser i lungorna hos nakna möss. IL-1β var också kan aktivera JNK i GA-celler, men aktivering av JNK förknippades inte med GA cellmigration och invasion. Därför, IL-1β-inducerad migration och invasion i GA-celler regleras av p38, men inte av JNK.
Slutsatser
IL-1β-inducerad p38-aktivering och IL-1β /p38 /AP-1 ( c-fos) /MMP2 & MMP9 vägen spelar en viktig roll i metastaser i GA; denna väg kan åstadkomma ett nytt terapeutiskt mål för GA.
Nyckelord
IL-1β p38 Gastric adenokarcinom MMP2 och MMP9 AP-1 Metastas Bakgrund
Ökande bevis tyder på att tumörer främjas och upprätthållas av inflammatoriska signaler från tumören mikro och tumörmikro spelar viktiga roller i främjandet av cancer [1, 2]. Cytokiner, särskilt cytokiner som utsöndras av tumörceller, är viktiga komponenter i tumörmikromiljö. Tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α), interleukin-1β (IL-β) och IL-6 är de mest välkarakteriserade cytokiner som har visat sig vara nära relaterat till cancer progression. Många studier har visat att inflammation induceras av cytokiner spelar en viktig roll i utvecklingen av magcancer [3]. Det är väl etablerat att infektioner, särskilt sådana som induceras av Helicobacter pylori,
har förmåga att inducera gastriska mukosala inflammatoriska svar, vilket resulterar i uppreglering av IL-1β, vilket i sin tur kan befrämja inflammationsassocierad karcinogenes [4]. De bakomliggande molekylära mekanismer för rollen av IL-1β signalering i gastric cancer fortfarande till stor del okända, och för närvarande är av intresse.
P38 är en medlem av mitogenaktiverat proteinkinas (MAPK) superfamiljen. MAPK signalvägar har väl undersökts, och består av åtminstone tre superfamilies av MAPK som reglerar olika cellulära aktiviteter [5]. Det är väl känt att p38 MAPK är i stånd att reglera en mängd cellulära responser till cytokiner och stress, inklusive IL-1β [6]; emellertid visat senaste uppgifterna att p38 är också nära relaterad till utvecklingen av olika typer av human cancer via dess förmåga att höja cancercellmigration och invasion som svar på olika stimuli, inklusive inflammatoriska faktorer [6]. Dessutom är p38 också involverat i regleringen av celldifferentiering och apoptos. Fyra isoformer av p38 har hittills identifierats: p38-α, p38-β, p38-γ, och p38-δ [7]. Även om aminosyrasekvenserna för dessa p38 MAPK är mestadels identiska, uttrycksmönstret av varje isoform varierar [8]. P38-α är den huvudsakliga p38 MAPK och uttrycks ubiquitously, är p38-β uttrycks huvudsakligen i hjärnan, medan p38γ är rikligt uttryckt i skelettmuskel [9] och p38-δ uttrycks huvudsakligen i endokrina körtlar [10]. Många studier har också visat att p38 deltar i IL-1 p signaleringskaskader i en uppsättning av celltyper, särskilt i mus embryonala fibroblaster (MEF) celler och makrofager celler [11, 12]; emellertid mycket lite är känt om funktionen av IL-1β-aktiverat p38 i magcancer.
c-Jun N-terminal kinas (JNK) är en annan MAPK familjemedlem som också är väl känt för att spela en viktig roll vid reglering IL-1β signalväg [13]. Förutom att delta i regleringen inflammatorisk signalväg, JNK utför flera andra viktiga cellulära funktioner inklusive reglering av celltillväxt, differentiering, överlevnad och apoptos. Dessutom nya studier visar att JNK är ofta överuttryckt i olika cancervävnader, och uppreglering av JNK kan vara nära förknippad med cancer invasion [14]; dock om JNK deltar i reglering av IL-1β-inducerad magsäckscancer cell migration och invasion är i stort sett okänd
Gastric adenokarcinom (GA) är den vanligaste tumör tumör i magen. Därför har vi fokuserat på GA i denna studie. Här undersökte vi aktiveringen av p38 och JNK som svar på IL-1β, och deras effekt på IL-1β-inducerad metastatiska potentialen hos GA celler in vitro eller in vivo.
Dessutom uttrycket av fosfo-p38 (p- p38) i GA, var dess relation till de clinicopathologic funktionerna i GA, och sambandet mellan uttrycket av IL-1β och p-p38 undersöktes i humana paraffininbäddade GA vävnader med hjälp av immunhistokemi. Slutligen, känne vi också de molekylära mekanismer som reglerar IL-1β-inducerad p38-medierad metastatisk potential av GA-celler.
Resultat
IL-1β-inducerad aktivering av p38 främjar GA cellmigration och invasion in vitro
först undersökte vi om IL-1β kunde aktivera p38-signalering i GA-celler. Såsom visas i figur 1, var aktivering av p38 (p-p38) detekterades i båda GA cellinjer (AGS och MKN-45-celler) efter behandling med IL-1β i 30 min; IL-1β-inducerad aktivering av p38 inhiberades genom den p38-inhibitor SB202190 (Figur 1A). Figur 1 IL-1β främjar GA cellmigration och invasion genom att aktivera p38. A: Western blöt bekräftade att p-p38 kan induceras av 30 min stimulering med IL-1β i AGS och MKN-45 cellinjer; aktiveringen av p38 genom IL-1β inhiberades av p38-inhibitor SB202190. B: Transfektion av p38 siRNA omkull p38 uttryck i både två GA cellinjer. C-F: Behandling av GA-celler med IL-1β ökad cellmigration och invasion in vitro; Dessa effekter hämmades av p38 siRNA eller p38 vägen inhibitor SB202190. ** P Hotel < 0,05 vs. rusning siRNA (kontroll siRNA) transfekterade celler stimulerade med IL-1β; △△ P Hotel < 0,05 vs. otransfekterade celler (vildtyp-celler) stimulerade med IL-1β. Staplarna anger medelvärdet ± SD antalet celler per synfält (× 400 förstoring) i migrationen och invasionsanalyser. G:. Representativa ljusmikroskopbilder av AGS och MKN-45 cellmigration och invasion i Transwell-analyser
P38 kan främja migration och invasion av olika cancerceller [15]. För att undersöka om IL-1β kan främja migration och invasion av GA celler via aktivering av p38-signalering, GA-celler transfekterade med en kodad siRNA (kontroll siRNA) eller p38 siRNA eller GA-celler förbehandlades med eller utan inhibitor SB202190 p38-vägen var stimulerades med IL-1β. Transwell migration och invasionsanalyser visade att IL-1β stimulering ökade migration och invasion av både AGS och MKN-45-celler; Men, IL-1β-inducerad GA cell migration och invasion signifikant dämpas av knockdown av p38 med hjälp av siRNA (Figur 1B till G) eller förbehandling med SB202190 (Figur 1C till G). Sammantaget antyder dessa data starkt att IL-1β främjas GA cellmigration och invasion förmedlas av p38.
IL-1β-inducerad aktivering av p38 uppreglerar MMP2 och MMP9 uttryck och aktivitet i GA celler
MMP2 och MMP9 har visats spela viktiga roller i cancercellinvasion och metastas [16]. För att undersöka huruvida MMP2 och MMP9 deltar också i IL-1β-inducerad p38-reglerad metastatisk potential av GA-celler, RT-PCR, immunocytokemi och konfokalmikroskopi, och zymografi analysen utförs för att bestämma MMP2 och MMP9 uttryck och aktivitet i GA cellinjer transfekterade med kontroll siRNA eller p38 siRNA, eller förbehandlats med eller utan inhibitorn SB202190 p38, och behandlades sedan med eller utan IL-1β. Som väntat, var MMP2 och MMP9 expression och aktivitet förhöjd som svar på IL-1β-behandling (figur 2A till C). Knockdown av p38 med hjälp av siRNA eller förbehandling med p38-hämmare SB202190 den minskade betydligt Il-1β-inducerad MMP2 och MMP9 mRNA-expression och aktivitet i både GA cellinjer (Figur 2A till C). Figur 2 IL-1β uppreglerar MMP2 och MMP9 uttryck och aktivitet genom att aktivera p38. A: RT-PCR-analys visade att MMP9
mRNA MMP2
och var uppreglerad i både AGS och MKN-45-celler som svar på behandling med IL-1β; denna effekt blockerades av p38 siRNA eller p38-inhibitor SB202190 den. B: Kvantifiering av uttrycket av MMP9
mRNA MMP2 Köpa och normaliseras till GAPDH
mRNA. ** P Hotel < 0,05 vs. scramble siRNA-transfekterade celler som stimulerats med IL-1β. △△ P Hotel < 0,05 vs. otransfekterade celler stimulerade med IL-1β. C: Gel zymografi visade att MMP2 och MMP9-aktivitet uppregleras i både AGS och MKN-45-celler som svar på behandling med IL-1β; denna effekt blockerades av p38 siRNA eller p38-inhibitor SB202190 den. D: Immunocytokemisk färgning och konfokalmikroskopi bekräftade att IL-1β ökad aktivering av p38 (röd), och MMP2 och MMP9 (grön) expression i MKN-45 GA-celler; Dessa effekter blockerades av p38 siRNA eller p38-inhibitor SB202190 den.
Immuncytokemi och konfokalmikroskopi visade att p-p38 svagt uttrycktes i obehandlade MKN-45-celler, som också uttryckte mycket låga nivåer av MMP2 och MMP9. Efter stimulering med IL-1β, signifikant ökade nivåer av p-p38 var MMP2 och MMP9 detekteras i MKN-45-celler; Dessa IL-1β-inducerade effekter hämmades av p38 siRNA och SB202190 (figur 2D). Sammantaget antyder dessa resultat starkt att IL-1β genom p38-inducerad invasion och migration av GA-celler medieras via förmågan hos p-p38 att uppreglera MMP2 och MMP9-expression och aktivitet.
IL-1β-inducerad aktivering av p38 uppreglerar MMP2 och MMP9 genom aktivering AP-1-beroende transkription i GA-celler
det är väl dokumenterat att transkriptionsfaktorn aktivatorprotein-1 (AP-1) kan reglera uttrycket av MMP2 och MMP9 [17], och aktivering av p38 kan reglera AP-1-aktivering [18]. För att undersöka huruvida IL-1β-inducerad p38-medierad förhöjd MMP2 och MMP9 uttryck och aktivitet är beroende av AP-1, aktivering av AP-1-beroende transkription undersöktes i GA-celler behandlade med eller utan IL-1β i närvaron eller frånvaron av p38-inhibition, med användning av en AP-1 luciferas reporteranalys. IL-1β ökade aktiviteten av AP-1 i båda GA cellinjerna (figur 3A); emellertid inhiberingen av p38 med användning av p38 siRNA eller förbehandlade celler med p38-inhibitor SB202129 reducerade IL-1β-inducerad AP-1 aktivitet i både GA cellinjerna (figur 3A). Dessa resultat tyder på att IL-1β-inducerad, p38 förmedlad expression av MMP2 och MMP9 är beroende av AP-1. Figur 3 IL-1β aktiverar AP-1-aktivitet genom p38-vägen. A: Båda GA-celler transfekterades med AP-1 reporter plasmid eller AP-1 reporter plasmid tillsammans med rusning siRNA eller p38 siRNA. AP-1 luciferas reporter genaktivitet signifikant ökade med IL-1β stimulering i både AGS och MKN-45-celler; dessa effekter signifikant hämmas av p38 siRNA i ett dosberoende sätt och även hämmas av p38-inhibitor SB202190 den. ** P Hotel < 0,05 jämfört med kontroll siRNA (scramble siRNA) + AP-1 luc transfekterade celler stimulerade med IL-1β; ΔΔP Hotel < 0,05 vs AP-1 luc transfekterade celler stimulerade med IL-1β; relativa luciferasaktiviteten normaliserades till B-gal. B: IL-1β-inducerad p38-förmedlad aktivering av MMP9
promotorer är beroende av AP-1-bindningsställen. ** P Hotel < 0,05 vs. transfekterade -670 /MMP9 + kontroll siRNA celler stimulerade med IL-1β; ΔΔP Hotel < 0,05 vs. transfekterade -670 /MMP9 celler stimulerade med IL-1β; ▼▼ P Hotel < 0,05 vs. transfekterade -570 /MMP9 celler stimulerade med IL-1β; relativa luciferasaktiviteten normaliserades till B-gal.
För att ytterligare bekräfta rollen för AP-1 i IL-1β-inducerad p38-reaktionsvägen, luciferasreportergen vektorer som innehåller AP-1-ställena i MMP9
promotorn regioner transfekterades in i de GA-celler. I enlighet med AP-1 reportergen-analyser, luciferas verksamhet -670 /MMP9
promotorregionen (innehållande två AP-1-bindningsställen [-533 och -79] och en NF-КB bindningsställe [-600 ] [19-21]) ökat markant i IL-1β-stimulerade celler (figur 3B). Transfektion av cellerna med p38 siRNA eller förbehandlade celler med p38-inhibitor SB202129 reducerade IL-1β-inducerad luciferasaktivitet av -670 /MMP9
promotor-reportergenen (figur 3B). Luciferasaktiviteten av MMP9
promotorn (-571 /MMP9
) ändrades inte av deletion av NFKB-bindningsställe (-600). När vidare AP-1-ställen (-79 och -533) av MMP9
promotorn togs bort (-73 /MMP9
mutanter), luciferasaktiviteten av reportergenen minskade betydligt, jämfört med respektive vilda -typ styrreportergener (Figur 3B). Sammantaget indikerar dessa data starkt att IL-1β inducerar aktivering av p38 signalväg, som främjar invasionen och migrering av GA-celler via AP-1-beroende uppreglering av MMP2 och MMP9 uttryck och aktivitet.
Knockdown av MMP2 eller MMP9 minskar IL-1β-inducerad migration och invasion i GA-celler
att ytterligare bekräfta att IL-1β-inducerad GA cell migration och invasion är associerade med uppreglering av MMP2 och MMP9, AGS och MKN-45-celler transfekterades med siRNA mot MMP2
eller MMP9
eller förbehandlades med eller utan MMP2 /MMP9 inhibitor BIPS, och stimulerades sedan med IL-1β. De Transwell migration och invasionsanalyser visade att IL-1β-inducerad migration och invasion av GA-celler signifikant dämpas av knockdown av MMP2
eller MMP9
eller förbehandling med gränskontrollstationer, jämfört med kontrollceller (Figur 4A till C). Därför uppreglering av MMP2 och MMP9 är avgörande för IL-1β-inducerad GA cell migration och invasion. Figur 4 Knockdown av MMP2 eller MMP9 eller förbehandling med MMP2 /9 inhibitor BIPS inhiberar IL-1β-inducerad GA cellmigration och invasion in vitro. A: RT-PCR bekräftade effektiviteten av MMP2 eller MMP9 siRNA, vilket avsevärt minskade MMP2
eller MMP9
uttryck, respektive, med upp till mer än 75%. B: IL-1β ökade GA cellmigration och invasion in vitro; Dessa effekter hämmades av MMP2 eller MMP9 siRNA eller MMP2 /9-hämmare gränskontrollstationerna. ** P Hotel < 0,05 vs. rusning siRNA (kontroll siRNA) transfekterade celler stimulerade med IL-1β. Barer är medelvärdet ± SD-faldig förändringar normaliserat till kontrollgruppen i migrations- och invasionsanalyser. C: Representativa ljus mikroskopiska bilder av AGS och MKN-45 cellmigration och invasion i Transwell migration och invasionsanalyser
IL-1β-inducerad aktivering av JNK inte deltar i regleringen av GA cellmigration och invasion
. det är väl känt att medlemmar av MAPK spelar en viktig roll i regleringen av cellulära svar på cytokiner och stress och P38 och JNK är de stora MAPK familjemedlemmar som reglerar IL-1β signalvägar. Att förstå om JNK är också associerad med IL-1β-inducerad GA cell migration och invasion, utfördes Western blot-analys utfördes för att detektera aktivering av JNK som svar på IL-1β. Såsom visats i figur 5A, var p-JNK detekteras i både AGS och MNK-45 cellinjer efter stimulering med IL-1β i 30 min. Men resultaten av båda Transwell migration och invasionsanalyser visade att den ökade migrationen och invasion av både AGS och MKN-45-celler som induceras av IL-1β stimulering inte dämpas av knockdown JNK med siRNA eller dämpas genom inhibition JNK-vägen med JNK inhibitor SP600125 varken (figur 5B till D); Antalet migrerade och invasiva celler nästan inte visade förändring före eller efter transfektion med siRNA mot JNK (P > 0,05) eller med eller utan förbehandlats med JNK hämmare SP600125 (P > 0,05). JNK inte förknippas med IL-1β-främjat cellmigration och invasion GA ha ytterligare verifieras genom AP-1 luciferas reporter analys. Som uppströms kinas av c-jun (en annan viktig del av AP-1) är JNK kunna aktivera AP-1, och aktivering av AP-1 av JNK är nära besläktad med JNK funktion om reglering av olika cell reaktion inklusive cancer cellmigration och invasion [22]; emellertid IL-1β-inducerad AP-1-aktivering i både AGS och MKN-45-celler inhiberades inte av JNK siRNA nor JNK inhibitor SP600125 varken (Figur 5E). Sammantaget indikerar dessa data starkt att den ökade GA migration och invasion främjas av IL-1β inte regleras av JNK. Figur 5 Aktiveringen av JNK inte är associerad med IL-1β-inducerad GA cell migration och invasion. A: p-JNK upptäcktes av 30 min stimulering med IL-1β i AGS och MKN-45 cellinjer. B: Transfektion av JNK siRNA knockat JNK uttryck i både två GA cellinjer. C-D: Behandling av GA-celler med IL-1β ökad migration cell och invasion in vitro; dessa effekter inte hämmas av JNK siRNA eller hämmare SP600125 JNK-vägen. ** P Hotel < 0,05 vs. scramble siRNA-transfekterade celler som stimulerats med IL-1β; △△ P Hotel < 0,05 vs. otransfekterade celler (vildtyp-celler) stimulerade med IL-1β; ## Eller ●● ingen signifikant skillnad mellan dessa två grupper detekterades (P Hotel > 0,05). Barer indikerade medelvärdet ± SD antal celler per synfält i migrations- och invasionsanalyser. D: representativa ljusmikroskop bilder av AGS och MKN-45 cellmigration och invasion i Transwell-analyser. E: Båda GA-celler transfekterades med AP-1 reporter plasmid eller AP-1 reporter plasmid tillsammans med rusning siRNA eller JNK siRNA. AP-1 luciferas reporter genaktivitet signifikant ökade med IL-1β stimulering i både AGS och MKN-45-celler; dessa effekter inte hämmas av JNK siRNA eller hämmas av SP600125 varken JNK-hämmare. ** P Hotel < 0,05 jämfört med kontroll siRNA (scramble siRNA) + AP-1 luc transfekterade celler stimulerade med IL-1β; ΔΔP Hotel < 0,05 vs AP-1 luc transfekterade celler stimulerade med IL-1β; ## Eller ●● ingen signifikant skillnad mellan dessa två grupper detekterades (P Hotel > 0,05). Relativa luciferasaktiviteten normaliserades till B-gal.
Phospho-p38 uppregleras och korrelerar med uttrycket av IL-1β, MMP2, MMP9 och c-fos i humana GA vävnader
expression av p-p38 i en serie av 105 GA vävnader och de parade icke-neoplastiska gastriska vävnader undersöktes genom immunhistokemi (IHC). Av de 105 cancerprov, 53 fall av GA vävnader (50,48%) uppvisade överexpression av p-p38 jämfört med de parade icke-neoplastiska gastriska vävnader (P
< 0,05; figur 6A). Positiv p-p38-uttryck observeras ofta i både GA cellens cytoplasma och kärna. Figur 6 Fosforylerad p38 överuttrycks i human GA, och uttrycket av p-p38 korrelerar positivt med IL-1β, MMP2, MMP9 och c-fos-uttryck i GA vävnader. A: Överuttryck av p-p38 var ofta observerats i GA vävnader, jämfört med de parade icke-neoplastiska gastric vävnader. A, P-p38 inte upptäcks eller bara svagt uttryckt i icke-neoplastiska gastric vävnader. B-E: olika intensiteter av positiv p-p38 uttryck i GA vävnader. B: Uttryck av p-p38 positivt korrelerad med IL-1β, MMP2, MMP9, och c-fos-uttryck i humana GA vävnader. GA vävnadsprov uppvisar starkare IL-1β uttryck och starkare p-p38, MMP2, MMP9 och c-fos-uttryck; och svagare IL-1β uttryck och svag p-p38, MMP2, MMP9 och c-fos-uttryck. C: Summan betyg för positiv färgningsintensitet av IHC för p-p38. ** P Hotel < . 0,05 vs parade icke neoplastiska gastric vävnader
Inga signifikanta samband observerades mellan överuttryck av p-p38 i patienternas ålder (< 50 eller ≥ 50 år), kön, tumörstorlek (< 3 cm eller ≥ 3 cm), histologisk typ, eller grad av differentiering. Emellertid överexpression av p-p38 som visas signifikant relaterade med lymfkörtel metastas (P
< 0,05), och invasion bortom serosa (P
< 0,05). Dessa data tyder på att överuttryck av p-p38 är associerad med metastas i human GA.
Såsom visats i figur 6B, expressionen av p-p38 uppvisade god correlativity med nivåerna av IL-1β, MMP2, MMP9 och AP-1 (c-fos) i GA vävnaden, och en signifikant korrelation mellan den förhöjda p-p38-expression och uppreglering av IL-1β, MMP2, MMP9 och c-fos i GA vävnad (r = 0,72, p < 0,01; r = 0,63, p < 0,01; r = 0,58, p < 0,05 och r = 0,69, p < 0,01) påvisades vid analys genom Spearman metod sälja The sum betyg för positiv färgningsintensitet av IHC för p-p38 i båda 105 fall av GA. vävnader och parade icke neoplastiska gastriska vävnader ställdes ut i Figur 6C.
Invasion assay i nakna möss
MKN-45-celler transfekterade med en kodad siRNA eller p38 siRNA injicerades i svansvenen hos BALB /c nu /nu möss; IL-1β eller PBS ades också intraperitonealt från dag för de celler injicerades i 14 dagar. Grupp 1 injicerades med PBS och oordning siRNA-transfekterade MKN-45-celler; grupp 2 injicerades med IL-1β och oordning siRNA-transfekterade MKN-45-celler; och grupp 3 injicerades med p38 siRNA-transfekterade MKN-45-celler och IL-1β-delar på 45 dagar efter injektion av cellerna, alla djur. (6/6; 100%) i IL-1β-behandlade gruppen hade utvecklat lungmetastaser (Figur 7A till D) (grupp 2; genomsnitt metastatiska härdar i sex av lungsektioner var 14 per lunga). I motsats härtill hade färre djur (2 /6,33.33%) i kontrollgruppen, som inte injicerades med IL-1β utvecklade lungmetastaser (grupp 1; genomsnitt 6 metastaser i sex av lungsnitt per lunga). Medan, endast två djur i p38 siRNA plus IL-β-behandlade gruppen utvecklade lungmetastaser, och antalet lungmetastaser i denna grupp var signifikant lägre (grupp 3, i genomsnitt 4 metastaser i sex av lungsnitt per lunga) och signifikant mindre än den hos den motsvarande gruppen som behandlades med IL-1β (grupp 2) (figur 7A till D). Figur 7 IL-1β stimulering ökar metastatisk potential av GA-celler in vivo via en p38-beroende mekanism. A: Representativa lungmetastaser bildade i olika grupper mus. B: Bars indikerade antalet djur utvecklade lungmetastaser. C: Representativa resultat av HE-färgning av lungmetastaser. D: Bars indikerade medelvärdet ± SD antal metastatiska härdar i sex av lungsektioner /per lunga hos möss som hade utvecklat lungmetastaser. △△ P Hotel < 0,05 vs. injiceras med rusning siRNA transfekterade celler plus IL-1β stimulering. E: RT-PCR-analys av p38, MMP2, MMP9 Mössor och c-fos
mRNA-expression i lungmetastaser av olika möss. F: IHC analys av p-p38, MMP2, MMP9 och c-fos proteinuttryck i lungmetastaser; IL-1β inducerade förhöjd p-p38, MMP2, MMP9 och c-fos proteinuttryck.
För att ytterligare bekräfta huruvida p38, MMP2 och MMP9 är involverade i IL-1β-inducerad lungmetastaser av GA-celler, och avgöra om denna process regleras av AP-1, mRNA expressionsnivåer av p38, MMP2, MMP9 Mössor och c-fos
(en nyckelkomponent i AP-1) i metastaser lungan kvantifierades med RT-PCR, och p-p38 , MMP2, MMP9 och c-fos proteinuttryck i lungsektioner undersöktes med hjälp av IHC. Såsom visas i fig 7 E och F var de expressionsnivåer av p-p38, MMP2, MMP9 och c-fos i lungan metastatiska foci förhöjd som svar på IL-1β. Aktivering av p38 och mRNA- eller proteinexpressionsnivåer av p38, MMP2, MMP9 och c-fos var lägre i metastaser som bildas av de celler som transfekterats med p38 siRNA plus IL-β-behandlade gruppen (Group3) eller i kontrollgruppen (group1 ) jämfört med de metastaser som bildas av scramble siRNA plus IL-β-behandlade gruppen (grupp 2) (Figur 7E och F). Sammantaget data in vivo bekräftar vidare att IL-1β-inducerad GA cell metastaser medieras av p38-signalering via AP-1 beroende uppreglering av MMP2 och MMP9.
Diskussion
Ett antal studier har antytt att IL- 1β kan aktivera p38 och JNK [11, 12], och p38 och JNK spelar en viktig roll i cancer cell migration och invasion [14, 23-26]. Därför hypotes vi att IL-1β kan bidra till GA cellinvasion och metastas via aktivering av p38 och JNK banor. För att undersöka denna möjlighet, bedömde vi förmågan hos IL-1β att aktivera p38 och JNK, och främja migration och invasion av GA-celler. Våra resultat visade att IL-1β kan aktivera både p38 och JNK och öka GA cell migration och invasion, och att dessa effekter kan hämmas av p38 siRNA eller p38-hämmaren SB 202190, men inte JNK siRNA eller JNK inhibitor SP600125. Detta är den första demonstrationen att IL-1β kan inducera GA cell migration och invasion via aktivering av p38; emellertid de underliggande molekylära mekanismer genom vilka IL-β-förmedlad p38-signalerings regleras under gastric carcinogenesis förblir till stor del okända.
En potentiell mekanism genom vilken p38 skulle kunna öka invasionen och migration av cancerceller är genom att höja nivåerna av MMP [ ,,,0],27]. Det är väl etablerat att utsöndringen av MMP med kapacitet för extracellulära matrisen (ECM) nedbrytning är en funktion av metastaserande cancerceller [28]. MMP2 och MMP9 är två av de mest välkarakteriserade MMP och är nära förknippade med cancerinvasion och metastas på grund av deras starka proteolytiska aktiviteten hos ECM [29]. Vi rapporterar här också för första gången att den sannolika molekylära mekanism genom vilken IL-1β främjar GA cellmigration och invasion kan innebära att IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & MMP9 signalväg. Vi visat att både MMP2 och MMP9 var uppreglerad i GA-celler som svar på IL-1β-stimulering; Dessa effekter hämmades av siRNA mot p38, MMP2
eller MMP9
, p38-inhibitor SB202190 den, och MMP2 /9-hämmare gränskontrollstationerna. Dessutom knockdown av MMP2
eller MMP9
använder siRNA, eller hämning av MMP2 /9 aktivitet med hjälp av BIPS, minskade signifikant IL-1β-inducerad GA cell migration och invasion. Som ett serin /treonin-proteinkinas, är p38 kan inducera aktivering av transkriptionsfaktorn AP-1 [30]. Vi fann vidare att IL-1β-inducerad p38-medierad uppreglering av MMP2 och MMP9 var AP-1-beroende. IL-1β kunde bara aktivera transkriptionen av MMP9
promotorregioner som innehåller AP-1 platser, och dessa effekter dämpas av p38 siRNA och p38-inhibitor SB202190 den. Dessutom, IL-1β-inducerad aktivering av AP-1-beroende transkription hämmades av p38 siRNA.
Phospho-p38 (p-p38), den aktiverade formen av p38, kunde detekteras i nästan 50% av den mänskliga GA vävnadsprover testats av IHC-analys, och uttryck av p-p38 var signifikant associerade med lymfkörtelmetastaser och invasion bortom serosa hos patienter med GA. Dessutom uttrycket av IL-1 positivt korrelerade med expressionen av p-p38, MMP2, MMP9 och c-fos i de kliniska GA prover. Vidare, in vivo-data från metastas-analysen visade att bildningen av lungmetastatiska härdar av GA-celler och p38 /
p-p38, MMP2, MMP9 och c-fos-mRNA och proteinuttryck i lungmetastatiska härdar var förhöjda genom IL-1β och minskad genom injektion av celler transfekterade med p38 siRNA. Sammantaget tyder dessa uppgifter starkt att IL-1β-inducerad GA cell migration och invasion ske via aktivering av p38 signalväg som leder till AP-1-aktivering och uppreglering av MMP2 och MMP9. Därför spelar p38 en viktig roll i IL-1β-inducerad metastaser i GA.
JNK är en annan viktig MAPK vara väl kända för att spela en viktig roll i regleringen IL-1β signalering i flera olika celler [14, 31]. Men i denna studie JNK visade sig vara inte är involverad i regleringen av IL-1β-inducerad GA cell migration och invasion. JNK siRNA och JNK-hämmare inte dämpa IL-1β inducerade GA cell migration och invasion, eller dämpa aktivering av AP-1 som induceras av IL-1β. Därför IL-1β-främjas GA cellmigration och invasion regleras av p38, men inte av JNK.
Sammanfattningsvis, vi har identifierat för första gången att IL-1β är funktionellt involverade i regleringen av metastaser i GA via aktivering av p38. Denna molekylära mekanismen involverar p38-medierad AP-1-beroende uppreglering av både MMP2 och MMP9; och denna studie visar tydligt att IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Gastro samband med gastroptos yttrar sig som en lägre buken bulkmassan hos ett barn: en fallrapport
• Inverkan av IL17A polymorfismer på avvikande metylering av DAPK och CDH1 i godartade magslemhinnan