activation IL-1β induite par p38 favorise les métastases dans adénocarcinome gastrique par surexpression de l'AP-1 /c-fos, MMP2 et MMP9

IL-1β induite par l'activation de p38 favorise les métastases dans les adénocarcinomes gastriques par l'intermédiaire d'une régulation positive de l'AP-1 /c-fos, MMP2 et MMP9
Résumé de l'arrière-plan
Interleukine-1β (IL-1β) a été impliquée dans la progression de l'adénocarcinome gastrique (GA); Cependant, les mécanismes moléculaires d'action de l'IL-1β en GA sont mal caractérisés. P38 et JNK sont les principaux membres de la famille MAPK qui régulent les voies de signalisation de l'IL-1β. Ici, nous avons étudié le rôle à la fois de p38 et JNK dans la migration cellulaire GA IL-1β induite, l'invasion et le potentiel métastatique.
Méthodes
Les effets de l'IL-1β p38 induite et l'activation de JNK dans des cellules GA ont été déterminées in vitro en utilisant Transwell migration et l'invasion des essais de MKN-45 et AGS cellules, ou un test in vivo de métastases chez la souris nude. La voie de signalisation p38 de l'IL-1β a été induite dans les cellules, caractérisé en outre GA. Résultats de l'activation de la voie de signalisation de l'IL-1β /p38 a également été évaluée dans les tissus GA primaires humains par immunohistochimie.
activation IL-1β-induite de p38 a augmenté la migration des cellules GA et l'invasion in vitro et promouvoir le potentiel métastatique GA cellules in vivo; ces effets ont été atténués par siRNA p38 ou le SB202190 inhibiteur de p38. MMP2 ou MMP9 siRNA et l'inhibiteur MMP2 /9 PIF ont aussi inhibé la migration des cellules GA IL-1β-induite et l'invasion in vitro. IL-1β induite par l'activation de p38 a augmenté significativement MMP2 et MMP9 l'ARNm et l'expression de protéine et d'activité. Des dosages de rapporteur de luciférase ont démontré que la protéine-1 activateur (AP-1) et l'AP-1 des sites de liaison du promoteur de la MMP9 (-670 /MMP9) ont été activées par l'activation de p38 d'IL-1β-induite. Phospho-p38 était significativement régulée positivement dans les tissus humains GA (par rapport aux tissus non néoplasiques appariés), et associée de manière significative avec métastases ganglionnaires, et l'invasion au-delà de la séreuse. L'expression de phospho-p38 en corrélation significative avec l'IL-1β, MMP2, MMP9, et c-fos expression dans les tissus humains GA et des métastases de cellules GA dans les poumons des souris nude. IL-1β est également capable d'activer JNK dans les cellules GA, mais l'activation de JNK n'a pas été associée à la migration des cellules GA et de l'invasion. Par conséquent, l'IL-1β induit la migration et l'invasion des cellules GA ont été régulée par p38, mais pas par JNK.
Conclusions L'activation de la p38 de l'IL-1β et induite par l'IL-1β /p38 /AP-1 ( c-fos) /MMP2 & voie de MMP9 jouent un rôle important dans les métastases dans les AG; cette voie peut fournir une nouvelle cible thérapeutique pour les GA.
Mots-clés
IL-1β p38 gastrique adénocarcinome MMP2 et MMP9 AP-1 Métastase Contexte
augmentation de la preuve indique que les tumeurs sont promues et soutenues par des signaux inflammatoires de la tumeur microenvironnement, et le microenvironnement tumoral joue un rôle important dans la promotion du cancer [1, 2]. Les cytokines, en particulier les cytokines sécrétées par les cellules tumorales, sont des composants essentiels du microenvironnement tumoral. facteur alpha de nécrose tumorale (TNF-α), l'interleukine-1β (IL-β) et l'IL-6 sont les plus cytokines bien caractérisés qui se sont révélées être étroitement liée à la progression du cancer. Un grand nombre d'études ont montré que l'inflammation induite par les cytokines jouent un rôle important dans le développement du cancer gastrique [3]. Il est bien établi que les infections, en particulier celles induites par Helicobacter pylori,
sont capables d'induire des réponses inflammatoires de la muqueuse gastrique, ce qui entraîne une régulation positive de l'IL-1β, qui à son tour peut favoriser la carcinogenèse associée à une inflammation [4]. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents pour le rôle de la signalisation de l'IL-1β dans la carcinogenèse gastrique restent largement inconnus, et sont actuellement d'intérêt.
P38 est un membre de la protéine kinase activée par un mitogene (MAPK) superfamille. Les voies de signalisation MAPK ont été bien étudiés et sont constitués d'au moins trois superfamilles de MAPK qui régissent les activités cellulaires diverses [5]. Il est bien connu que p38 est capable de réguler un grand nombre de réponses cellulaires à des cytokines et de stress, y compris l'IL-1β [6]; Cependant, des données récentes ont montré que la p38 est étroitement liée au développement de différents types de cancer humain par sa capacité à élever la migration des cellules cancéreuses et de l'invasion, en réponse à divers stimuli, y compris les facteurs inflammatoires [6]. En outre, p38 est également impliquée dans la régulation de la différenciation cellulaire et l'apoptose. Quatre isoformes de p38 ont été identifiées jusqu'à présent: p38-α, β-p38, p38-γ et δ-p38 [7]. Bien que les séquences d'acides aminés de ces MAPK p38 sont essentiellement identiques, le motif d'expression de chaque isoforme varie [8]. P38-α est le principal MAPK p38 et il est exprimé de façon ubiquitaire, p38-β est principalement exprimé dans le cerveau, tandis que p38y est abondamment exprimé dans le muscle squelettique [9] et p38-δ est principalement exprimé dans les glandes endocrines [10]. De nombreuses études ont également montré que la p38 participe à 1'IL-lß cascades de signalisation dans un ensemble de types de cellules, en particulier dans les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) macrophages et les cellules des cellules [11, 12]; cependant, on sait très peu sur la fonction de p38 IL-1β activé dans le cancer gastrique.
kinase c-Jun N-terminal (JNK) est un autre membre de la famille MAPK qui est aussi bien connu pour jouer un rôle important dans la régulation IL-1β voie de signalisation [13]. En plus de la participation dans la voie de signal inflammatoire de régulation, JNK remplit plusieurs autres fonctions cellulaires importantes, y compris la régulation de la croissance cellulaire, la différenciation, la survie et l'apoptose. En outre, des études récentes démontrent que JNK est fréquemment surexprimé dans les tissus cancéreux différents, et la régulation de JNK peuvent être étroitement associés à l'invasion du cancer [14]; Toutefois, si JNK participe à la régulation de la migration cellulaire de cancer gastrique IL-1β-induite et l'invasion reste largement inconnue
adénocarcinome gastrique (GA) est la tumeur néoplasique la plus courante de l'estomac. par conséquent, nous nous sommes concentrés sur la GA dans cette étude. Ici, nous avons étudié l'activation de la p38 et JNK en réponse à l'IL-1β, et leur effet sur l'IL-1β induite par le potentiel métastatique des cellules GA in vitro ou in vivo.
En outre, l'expression de phospho-p38 (P- p38) en GA, sa relation avec les caractéristiques clinicopathologiques de GA, et la corrélation entre l'expression de l'IL-1β et de p-p38 ont été étudiés dans les tissus de l'AG de paraffine humaines par immunohistochimie. Enfin, nous avons également caractérisé les mécanismes moléculaires qui régulent le potentiel de l'IL-1β induite par p38 médiée métastatique des cellules GA.
Résultats
IL-1β induite par l'activation de p38 favorise la migration des cellules GA et l'invasion in vitro
Premièrement, nous avons cherché à savoir si l'iL-1β a été en mesure d'activer la signalisation de p38 dans les cellules GA. Comme on le voit sur la figure 1, l'activation de la p38 (p-p38) a été détectée dans les deux lignées cellulaires GA (AGS et MKN-45 cellules) après le traitement avec l'IL-1β pendant 30 min; IL-1β induite par l'activation de la p38 a été inhibée par le SB202190 inhibiteur de p38 (figure 1A). Figure 1 IL-1β favorise la migration des cellules GA et l'invasion par l'activation de p38. A: Western blots ont confirmé que p-p38 pourrait être induite par 30 stimulation min avec de l'IL-1β dans AGS et MKN-45 lignées de cellules; l'activation de la p38 par l'IL-1β a été inhibée par l'inhibiteur p38 SB202190. B: Transfection de p38 siRNA renversé l'expression de p38 dans les deux les deux lignées cellulaires GA. C-F: Le traitement des cellules GA avec l'IL-1β a augmenté la migration cellulaire et l'invasion in vitro; ces effets ont été inhibées par siRNA p38 ou l'inhibiteur de la voie p38 SB202190. ** P
< 0,05 vs. scramble siRNA (contrôle siRNA) Les cellules transfectées stimulées par l'IL-1β; △△ P
< 0,05 versus cellules non transfectées (cellules de type sauvage) stimulées par l'IL-1β. Les barres indiquent la moyenne ± écart-type nombre de cellules par champ de vision (400 × grossissement) dans les essais de migration et d'invasion. G:. Représentatifs des images de lumière de microscope d'AGS et MKN-45 migration cellulaire et l'invasion dans les essais Transwell
P38 peut favoriser la migration et l'invasion de différentes cellules cancéreuses [15]. Pour étudier si l'IL-1β peut favoriser la migration et l'invasion des cellules GA via l'activation de la signalisation de p38, les cellules GA transfectées avec un brouillée siRNA (siRNA contrôle) ou p38 ARNsi ou des cellules GA prétraitées avec ou sans la voie p38 inhibiteur SB202190 était stimulées par l'IL-1β. Transwell migration et l'invasion des essais ont démontré que la stimulation de l'IL-1β a augmenté la migration et l'invasion des deux AGS et MKN-45 cellules; Cependant, l'IL-1β induite par la migration des cellules GA et l'invasion ont été considérablement atténuées par knockdown de p38 en utilisant siRNA (figure 1B à G) ou prétraitement avec SB202190 (figure 1C à G). Pris ensemble, ces données suggèrent fortement que l'IL-1β promu la migration cellulaire et l'invasion GA sont médiés par p38.
Activation IL-1β induite par p38 upregulates MMP2 et d'expression de MMP9 et de l'activité dans les cellules GA
MMP2 et MMP9 ont sont révélés jouer un rôle important dans l'invasion des cellules cancéreuses et les métastases [16]. Pour explorer si MMP2 et MMP9 participent également au potentiel de l'IL-1β induite par p38 régulé métastatique des cellules GA, RT-PCR, immunocytochimie, et microscopie confocale, et le dosage de zymographie ont été effectués pour déterminer la MMP2 et MMP9 expression et l'activité GA des lignées de cellules transfectées avec l'ARNsi de contrôle ou d'ARNsi de p38, ou prétraitées avec ou sans l'inhibiteur p38 SB202190, puis traitées avec ou sans IL-1β. Comme on s'y attendait, MMP2 et MMP9 expression et l'activité était élevée en réponse au traitement de l'IL-1β (figure 2A à C). Knockdown de p38 à l'aide ARNsi ou un prétraitement avec le SB202190 inhibiteur de p38 a diminué significativement MMP2 Il-1β induit l'expression de MMP9 et de l'ARNm et l'activité dans les deux lignées cellulaires GA (figure 2A à C). Figure 2 IL-1β upregulates MMP2 et d'expression de MMP9 et de l'activité en activant p38. A: Analyse par RT-PCR a montré que la MMP2 et MMP9
de l'ARNm ont été régulés à la hausse dans les deux AGS et MKN-45 des cellules en réponse à un traitement par l'IL-1β; cet effet a été bloqué par siRNA p38 ou le SB202190 inhibiteur de p38. B: Quantification de l'expression de MMP2
et MMP9 de l'ARNm normalisé à GAPDH de l'ARNm. ** P
< 0,05 vs. cellules siARN transfectées scramble stimulées par l'IL-1β. △△ P
< 0,05 vs cellules non stimulées par l'IL-1β. C: Gel zymographie a montré que la MMP2 et MMP9 activité étaient régulés à la hausse dans les deux AGS et MKN-45 des cellules en réponse à un traitement par l'IL-1β; cet effet a été bloqué par siRNA p38 ou le SB202190 inhibiteur de p38. D: immunocytochimique coloration et microscopie confocale ont confirmé que l'IL-1β activation de p38 (rouge) MMP2 et MMP9 (vert) expression dans les cellules MKN-45 GA a augmenté, et; Ces effets ont été bloqués par l'ARNsi de p38, ou le SB202190 inhibiteur de p38.
immunocytochimie et microscopie confocale ont montré que le p-p38 a été faiblement exprimé dans MKN-45 non traitées, les cellules qui expriment également des niveaux très faibles de MMP2 et MMP9. Après stimulation avec l'IL-1β, une augmentation significative des niveaux de p-p38, MMP2 et MMP9 ont été détectés dans les cellules MKN-45; ces effets de l'IL-1β-induites ont été inhibées par p38 siRNA et SB202190 (figure 2D). Pris ensemble, ces résultats suggèrent fortement que l'IL-1β par l'invasion et la migration des cellules GA induite p38 est médiée par la capacité de p-p38 à upregulate MMP2 et MMP9 expression et l'activité.
Activation IL-1β induite par des p38 régule à la hausse MMP2 et MMP9 en activant la transcription AP-1 dans les cellules dépendant GA
Il est bien documenté que le facteur activateur de transcription de la protéine-1 (AP-1) peut réguler l'expression de MMP2 et MMP9 [17] et l'activation p38 est capable de réguler l'activation de AP-1 [18]. Afin d'examiner si l'IL-1β induite élevée MMP2 et MMP9 expression et l'activité de p38 médiée dépendent de l'AP-1, l'activation de la transcription AP-1-dépendante a été étudiée dans des cellules GA traitées avec ou sans IL-1β, en la présence ou l'absence d'inhibition de la p38 en utilisant un essai AP-1 rapporteur de luciférase. IL-1β a augmenté l'activité de l'AP-1 dans les deux lignées cellulaires GA (figure 3A); Cependant, l'inhibition de la p38 en utilisant le siRNA p38 ou des cellules prétraitées avec un inhibiteur de la p38 SB202129 réduit l'IL-1β induite par AP-1 l'activité dans les deux lignées cellulaires GA (figure 3A). Ces résultats indiquent que l'IL-1β induite par p38 expression de MMP2 et MMP9 dépendent de l'AP-1. Figure 3 IL-1β active AP-1 activité par voie de p38. A: Les deux cellules ont été transfectées avec GA AP-1 plasmide rapporteur ou AP-1 plasmide rapporteur conjointement avec scramble siRNA ou p38 siRNA. AP-1 l'activité du gène rapporteur de la luciférase a été significativement augmentée par la stimulation de l'IL-1β dans les deux AGS et MKN-45 cellules; Ces effets ont été significativement inhibés par l'ARNsi de p38 d'une manière dépendante de la dose et également inhibée par le SB202190 inhibiteur de p38. ** P
< 0,05 par rapport au témoin siRNA (scramble siRNA) + AP-1 cellules transfectées luc stimulées par l'IL-1β; ΔΔP
< 0,05 vs. AP-1 cellules transfectées luc stimulées par l'IL-1β; l'activité relative de luciférase a été normalisée à B-gal. B: activation de la p38 induite par l'IL-1β induite par des promoteurs de la MMP9 est dépendante des sites AP-1 de liaison. ** P
< 0,05 vs. transfectées -670 /MMP9 + contrôle des cellules siARN stimulées par l'IL-1β; ΔΔP
< 0,05 vs. transfecté -670 /cellules MMP9 stimulées par l'IL-1β; ▼▼ P
< 0,05 vs. transfecté -570 /cellules MMP9 stimulées par l'IL-1β; l'activité relative de luciférase a été normalisée à B-gal.
Afin de confirmer davantage le rôle de l'AP-1 dans la voie de p38 d'IL-1β-induite, des vecteurs de gènes rapporteurs de luciférase contenant les sites de promoteur de la MMP9 AP-1 régions ont été transfectées dans les cellules GA. En conformité avec l'AP-1 reporter les tests génétiques, les activités de luciférase de la région de promoteur du -670 /MMP9 (contenant deux sites de liaison AP-1 et [-533 -79] et un site de liaison NF-КB [-600 ] [19-21]) a augmenté de manière significative dans les cellules IL-1β stimulées (figure 3B). La transfection des cellules avec l'ARNsi de p38 ou des cellules prétraitées avec un inhibiteur de la p38 SB202129 a réduit l'activité de la luciférase de l'IL-1β induite par le promoteur du gène rapporteur de la -670 /MMP9 (figure 3B). L'activité de luciférase du promoteur de la MMP9 (-571 /MMP9 de
) n'a pas été modifiée par délétion du site de liaison à NFkB (-600). En outre, lorsque les sites AP-1 (-79 et -533) du promoteur de la MMP9 ont été supprimés (-73 mutants MMP9 /
), l'activité de luciférase du gène rapporteur a considérablement diminué par rapport à l'état sauvage respectif gènes -type de contrôle rapporteurs (figure 3B). Collectivement, ces données indiquent fortement que l'IL-1β induit l'activation de la voie de signalisation de p38, ce qui favorise l'invasion et la migration des cellules GA via surexpression AP-1 dépendant de MMP2 et d'expression de MMP9 et de l'activité.
Knockdown de MMP2 ou MMP9 diminue la migration IL-1β-induite et l'invasion des cellules GA
Pour confirmer en outre que GA migration et l'invasion cellulaire IL-1β-induite sont associés à une régulation positive de MMP2 et MMP9, AGS et MKN-45 cellules ont été transfectées avec des ARNsi contre MMP2
ou MMP9
ou prétraitées avec ou sans l'inhibiteur MMP2 /MMP9 PIF, puis stimulées avec IL-1β. La migration et l'invasion des essais ont montré que Transwell la migration de l'IL-1β induit et l'invasion des cellules GA ont été sensiblement atténués par knock-down de la MMP2
ou la MMP9,
ou pré-traitement avec PIF, par rapport aux cellules témoins (figure 4A à C). Par conséquent, la régulation positive de MMP2 et MMP9 sont cruciales pour la migration des cellules GA IL-1β-induite et de l'invasion. Figure 4 Knockdown de MMP2 ou MMP9 ou prétraitement avec le MMP2 /9 inhibiteur PIF inhibe la migration des cellules GA IL-1β-induite et l'invasion in vitro. R: RT-PCR a confirmé l'efficacité de la MMP-2 ou la MMP9 ARNsi, ce qui réduit de manière significative MMP2
ou l'expression de MMP9 par respectivement jusqu'à plus de 75%. B: IL-1β a augmenté la migration des cellules GA et l'invasion in vitro; ces effets ont été inhibées par MMP2 ou MMP9 siRNA ou l'inhibiteur MMP2 /9 PIF. ** P
< 0,05 vs. scramble siRNA (siRNA contrôle) des cellules transfectées stimulées par l'IL-1β. Bars sont la moyenne ± écart-type de pliage change normalisée au groupe témoin dans les essais de migration et d'invasion. C: représentatifs des images de microscopie lumineuse de AGS et MKN-45 migration cellulaire et l'invasion dans la migration et l'invasion des essais Transwell
IL-1β induite par l'activation de JNK ne participe pas à la régulation de la migration cellulaire GA et de l'invasion
. Il est bien connu que les membres de MAPK jouent un rôle important dans la régulation des réponses cellulaires à des cytokines et le stress, et P38 et JNK sont les principaux membres de la famille MAPK qui régulent les voies de signalisation de l'IL-1β. Pour comprendre si JNK est également associée à la migration des cellules GA IL-1β induit et l'invasion, l'analyse par transfert de Western a été réalisée pour détecter l'activation de JNK en réponse à l'IL-1β. Comme montré sur la figure 5A, le p-JNK a été détectée dans les deux AGS et MNK-45 lignées de cellules après stimulation par l'IL-1β pendant 30 min. Toutefois, les résultats de la migration et l'invasion des essais Transwell ont montré que la migration accrue et l'invasion des deux AGS et MKN-45 cellules induites par la stimulation de l'IL-1β sont atténuées par JNK knock-down avec l'ARNsi ni atténué par l'inhibition de JNK avec un inhibiteur de JNK SP600125 ni (figure 5B à D); Le nombre de cellules ayant migré et invasives presque n'a pas montré de changement avant ou après transfection avec le siRNA contre JNK (P > 0,05) ou avec ou sans pré-traitées avec un inhibiteur de JNK SP600125 (P > 0,05). JNK n'a pas été associé à l'IL-1β promu la migration cellulaire et l'invasion GA ayant été en outre vérifiée par AP-1 essai rapporteur luciférase. Comme la kinase en amont de c-Jun (un autre élément important de l'AP-1), JNK est capable d'activer l'AP-1, et l'activation de AP-1 de JNK est étroitement liée à la fonction de JNK sur la régulation de divers réaction cellulaire y compris le cancer la migration et l'invasion cellulaire [22]; Cependant, l'IL-1β induite par AP-1 activation dans les deux AGS et MKN-45 cellules n'a pas été inhibée par JNK siRNA ni inhibiteur de JNK SP600125 ni (Figure 5E). Tous ensemble, ces données indiquent fortement que la migration GA accrue et l'invasion promue par l'IL-1β sont pas réglementés par JNK. Figure 5 L'activation de JNK est pas associée à la migration des cellules GA IL-1β induit et l'invasion. R: p-JNK a été détecté par la stimulation 30 min avec de l'IL-1β dans l'AGS et MKN-45 lignées cellulaires. B: Transfection de JNK siRNA renversé expression de JNK dans les deux les deux lignées cellulaires GA. C-D: Le traitement des cellules GA avec la migration des cellules IL-1β accrue et l'invasion in vitro; ces effets ne sont pas inhibés par JNK siRNA, ni la voie de JNK inhibiteur SP600125. ** P
< 0.05 cellules siARN transfectées vs. scramble stimulées par l'IL-1β; △△ P
< 0,05 vs cellules non transfectées (cellules de type sauvage) stimulées par l'IL-1β; ## Ou ●● aucune différence significative entre ces deux groupes a été détectée (P
> 0,05). Bars indiqué la moyenne ± écart-type nombre de cellules par champ de vision dans les essais de migration et d'invasion. D: Représentant images lumière de microscope d'AGS et MKN-45 migration cellulaire et l'invasion dans les essais Transwell. E: Les deux cellules ont été transfectées avec GA AP-1 plasmide rapporteur ou AP-1 plasmide rapporteur conjointement avec scramble siRNA ou JNK siRNA. AP-1 l'activité du gène rapporteur de la luciférase a été significativement augmentée par la stimulation de l'IL-1β dans les deux AGS et MKN-45 cellules; ces effets ne sont pas inhibées par la JNK siRNA, ni inhibée par le SP600125 inhibiteur de JNK non plus. ** P
< 0,05 par rapport au témoin siRNA (scramble siRNA) + AP-1 cellules transfectées luc stimulées par l'IL-1β; ΔΔP
< 0,05 vs. AP-1 cellules transfectées luc stimulées par l'IL-1β; ## Ou ●● aucune différence significative entre ces deux groupes a été détectée (P
> 0,05). l'activité de luciférase a été normalisée par rapport à la B-gal.
phospho-p38 est régulée positivement et est en corrélation avec l'expression de l'IL-1β, MMP2, MMP9 et c-fos dans des tissus humains GA
L'expression de la p-p38 dans un série de 105 GA tissus et les tissus non néoplasiques gastriques paires a été examinée par immunohistochimie (IHC). Des échantillons de cancer, 105 53 cas de tissus GA (50,48%) ont présentaient une surexpression de p-p38 par rapport aux tissus non néoplasiques gastriques par paires (P
< 0,05; figure 6A). expression p-p38 positive a été fréquemment observée tant dans le cytoplasme de la cellule GA et le noyau. La figure 6 p38 phosphorylée est surexprimée dans les GA humaine et l'expression de la p-p38 est en corrélation positive avec l'IL-1β, MMP2, MMP9 et c-fos expression dans des tissus GA. R: Surexpression de p-p38 a été fréquemment observée dans les tissus GA, par rapport aux tissus non néoplasiques gastriques liés. a, P-p38 n'a pas été détecté ou seulement faiblement exprimé dans les tissus gastriques non néoplasiques. b à e: différentes intensités d'expression positive p-p38 dans les tissus GA. B: L'expression de p-p38 positivement corrélée avec l'IL-1β, MMP2, MMP9, et c-fos expression dans les tissus GA humains. GA échantillon de tissu présentant plus forte expression de l'IL-1β et plus fort p-p38, MMP2, MMP9 et c-fos expression; et plus faible expression de l'IL-1β et faible p-p38, MMP2, MMP9 et c-fos expression. C: La somme des scores d'intensité de la coloration positive de IHC pour p-p38. ** P
< . 0,05 vs. jumelé tissus gastriques non néoplasiques
Aucune association significative n'a été observée entre la surexpression de p-p38 dans l'âge des patients (< 50 ou ≥ 50 ans), le sexe, la taille de la tumeur (< 3 cm ou ≥ 3 cm), le type histologique, ou la qualité de la différenciation. Cependant, la surexpression de p-p38 affiché une relation significative avec métastases ganglionnaires (P
< 0,05), et l'invasion au-delà de la séreuse (P
< 0,05). Ces données suggèrent que la surexpression de p-p38 est associée à des métastases chez GA humain.
Comme montré sur la figure 6B, l'expression de p-p38 a montré une bonne corrélativité avec les taux d'IL-1β, MMP2, MMP9 et AP-1 (c-fos) dans le tissu GA, et une corrélation significative entre l'expression élevée p-p38 et surexpression d'IL-1β, MMP2, MMP9 et c-fos dans le tissu GA (r = 0,72, p < 0,01; r = 0,63, p < 0,01; r = 0,58, p < 0,05 et r = 0.69, p < 0,01) a été détectée lors de l'analyse par la méthode de Spearman
la somme des scores d'intensité de la coloration positive de IHC pour p-p38 dans les deux 105 cas de GA. des tissus et des tissus non néoplasiques gastriques par paires ont été exposées dans la figure 6C. le plus dosage d'invasion dans MKN-45 les cellules de souris nude transfectées avec un siRNA ou d'ARNsi de p38 brouillés ont été injectés dans la veine caudale de souris BALB /c nu /nu souris; IL-1β ou du PBS ont été injectés par voie intrapéritonéale du jour des cellules ont été injectées pendant 14 jours. Le groupe 1 a été injecté avec du PBS et embrouillé MKN-45 des cellules transfectées siARN; groupe 2 ont été injectés avec de l'IL-1β et brouillés MKN-45 cellules siARN transfectées; et le groupe 3 ont été injectés avec p38 siRNA-transfectées MKN-45 cellules et IL-1β
A 45 jours après l'injection des cellules, tous les animaux. (6/6; 100%) dans le groupe IL-1β-traité avait développé métastases pulmonaires (Figure 7A à D) (groupe 2; la moyenne des foyers métastatiques dans 6 des sections du poumon était de 14 pour les poumons). En revanche, le nombre d'animaux (2 /6,33.33%) dans le groupe témoin qui ne sont pas injectés avec l'IL-1β avaient développé des métastases pulmonaires (groupe 1; moyenne de 6 à 6 métastases pulmonaires des sections par les poumons). Considérant que seuls deux animaux du groupe ARNsi p38 plus IL-β-traités ont développé des métastases pulmonaires et le nombre de métastases pulmonaires dans ce groupe était significativement plus faible (groupe 3, en moyenne de 4 métastases dans 6 des sections pulmonaires par des poumons) et significativement plus petite que celui du groupe correspondant traité avec de l'IL-1β (groupe 2) (figure 7A à D). La figure 7 stimulation de l'IL-1β augmente le potentiel métastatique des cellules GA in vivo par un mécanisme dépendant de p38. A: métastases pulmonaires représentatives formées dans la souris de groupe différent. B: Bars indiqué le nombre d'animaux a développé des métastases pulmonaires. C: Des résultats représentatifs de l'IL coloration des métastases pulmonaires. D: Les barres indiquent la moyenne ± écart-type nombre de foyers métastatiques dans les six sections de poumon /par poumon chez les souris qui avaient développé des métastases pulmonaires. △△ P
< 0,05 vs. injecté avec des cellules transfectées scramble siARN ainsi que la stimulation de l'IL-1β. E: Analyse par RT-PCR de p38, MMP2, MMP9
et l'expression de l'ARNm de c-fos dans les métastases pulmonaires de souris différentes. analyse IHC de p-p38, MMP2, MMP9 et c-fos expression des protéines dans les métastases pulmonaires, F IL-1β induite élevée p-p38, MMP2, MMP9 et c-fos expression de la protéine.
Pour confirmer davantage si p38, MMP2 et MMP9 sont impliqués dans les métastases du poumon IL-1β induite par des cellules GA, et de déterminer si ce processus est régulée par l'AP-1, les niveaux de p38, MMP2, MMP9 et
(une composante clé de l'AP-1) de c-fos dans le poumon métastatiques ont été quantifiés par RT-PCR et le p-p38 expression d'ARNm , MMP2, MMP9 et c-fos expression des protéines dans des coupes de poumons ont été examinés à l'aide d'IHC. Comme cela est représenté sur la figure 7, E et F, les taux de p-p38, MMP2, MMP9 et c-fos dans les foyers de métastases pulmonaires d'expression ont été élevées en réponse à l'IL-1β. les niveaux de p38, MMP2, MMP9 et c-fos activation de la p38 et l'expression d'ARNm ou de protéine étaient plus faibles dans les métastases formées par les cellules transfectées avec l'ARNsi de p38 ainsi que des groupes β-traités IL (group3) ou dans le groupe témoin (groupe 1 ) par rapport aux métastases formées par bousculade ARNsi ainsi que le groupe IL-β-traité (groupe 2) (figure 7E et F). Pris ensemble, les données in vivo confirme en outre que l'IL-1β induite par cellules métastase GA est médiée par la signalisation p38 via AP-1 surexpression dépendante de MMP2 et MMP9. De la discussion
Un certain nombre d'études ont suggéré que IL- 1β est capable d'activer la p38 et JNK [11, 12] et p38 et JNK jouent un rôle important dans la migration des cellules cancéreuses et l'invasion [14, 23-26]. Par conséquent, nous avons supposé que l'IL-1β peut contribuer à l'invasion des cellules GA et la métastase via l'activation des p38 et JNK. Pour étudier cette possibilité, nous avons évalué la capacité de l'IL-1β pour activer p38 et JNK, et de promouvoir la migration et l'invasion des cellules GA. Nos résultats ont montré que l'IL-1β peut activer à la fois p38 et JNK, et d'augmenter GA la migration et l'invasion cellulaire et que ces effets peuvent être inhibés par p38 ARNsi ou l'inhibiteur de p38 SB 202190, mais pas JNK ARNsi ou un inhibiteur de la JNK SP600125. Ceci est la première démonstration du fait que l'IL-1β peut induire la migration cellulaire et l'invasion GA via l'activation de p38; Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents par lesquels la signalisation p38 IL-β-médiée est régulée pendant la carcinogenèse gastrique demeurent largement inconnus.
Un mécanisme potentiel par lequel p38 pourrait augmenter l'invasion et la migration des cellules cancéreuses est en élevant les niveaux de MMP [ ,,,0],27]. Il est bien établi que la sécrétion de MMP avec la capacité de la matrice extracellulaire (ECM), la dégradation est une caractéristique des cellules cancéreuses métastatiques [28]. MMP2 et MMP9 sont deux des MMP plus bien caractérisés et sont étroitement associés à l'invasion du cancer et des métastases en raison de leur forte activité protéolytique de l'ECM [29]. Nous rapportons ici aussi pour la première fois que le mécanisme moléculaire par lequel probablement IL-1β favorise la migration des cellules GA et l'invasion peut impliquer l'IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & MMP9 voie de signalisation. Nous avons démontré que les deux MMP2 et MMP9 ont été surexprimés dans les cellules GA en réponse à la stimulation de l'IL-1β; ces effets ont été inhibées par ARNsi contre p38, MMP2
ou MMP9
, le SB202190 inhibiteur de p38, et l'inhibiteur de la MMP-2/9 PIF. En outre, knockdown de MMP2
ou MMP9
utilisant siRNA, ou l'inhibition de MMP2 /9 activité utilisant PIF, a diminué de manière significative la migration des cellules GA IL-1β-induite et de l'invasion. En tant que protéine-kinase de sérine /thréonine, la p38 est capable d'activation du facteur de transcription AP-1 [30] inducteur. Nous avons en outre constaté que l'IL-1β induite par la régulation positive induite par p38 de MMP2 et MMP9 ont AP-1 dépendante. IL-1β est seulement capable d'activer la transcription des régions promotrices de MMP9 contenant AP-1 des sites, et ces effets ont été atténués par p38 siRNA et SB202190 inhibiteur de p38. En outre l'activation, l'IL-1β induite par la transcription AP-1-dépendante p38 a été inhibée par l'ARNsi.
phospho-p38 (p-p38), la forme activée de p38 n'a pu être détectée dans près de 50% de la GA humaine des échantillons de tissus testés par dosage IHC, et l'expression de p-p38 était significativement associée à des métastases ganglionnaires, et l'invasion au-delà de la séreuse chez les patients avec GA. En outre, l'expression d'IL-1 ß positivement corrélée avec l'expression de la p-p38, MMP2, MMP9 et c-fos dans les échantillons cliniques de GA. De plus, des données in vivo à partir de l'analyse des métastases ont démontré que la formation de métastases pulmonaires foyers par les cellules GA, et p38 /
p-p38, MMP2, MMP9 et de l'ARNm et l'expression de protéine c-fos dans les foyers de métastases pulmonaires a été élevé par IL-1β, et réduit par injection de cellules transfectées avec l'ARNsi de p38. Pris ensemble, ces données suggèrent fortement que la migration des cellules GA IL-1β et de l'invasion induite se produit par l'activation de la voie de signalisation de p38 qui conduit à l'activation de AP-1 et d'une régulation positive de la MMP2 et MMP9. Par conséquent, p38 joue un rôle essentiel dans la métastase IL-1β induite par GA.
JNK est un autre MAPK important d'être bien connu pour jouer un rôle important dans la régulation de signalisation IL-1β dans plusieurs cellules différentes [14, 31]. Toutefois, dans cette étude, JNK a été trouvé pour ne pas être impliqué dans la régulation de la migration cellulaire GA IL-1β-induite et de l'invasion. JNK siRNA et inhibiteur de JNK n'a pas atténué l'IL-1β induit la migration des cellules GA et de l'invasion, ni atténuer l'activation de AP-1 induite par l'IL-1β. migration cellulaire GA Par conséquent, l'IL-1β promu et l'invasion sont réglementés par p38, mais pas par JNK.
En résumé, nous avons identifié pour la première fois que l'IL-1β est fonctionnellement impliquée dans la régulation des métastases dans GA via l'activation de la p38. Ce mécanisme moléculaire consiste p38 médiée par AP-1 dépendant de la régulation positive des deux MMP2 et MMP9; et cette étude suggère fortement que l'IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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