IL-1β-indusoidun aktivaation p38 edistää etäpesäkkeiden mahalaukun adenokarsinooman kautta ylössäätely AP-1 /C-fos, MMP2 ja MMP9

IL-1β-indusoidun aktivaation p38 edistää etäpesäkkeiden mahalaukun adenokarsinooman kautta ylössäätely AP-1 /C-fos, MMP2 ja MMP9
tiivistelmä
tausta
interleukiini-1β (IL-1β) on liitetty etenemistä mahalaukun adenokarsinooman (GA); kuitenkin, molekyylitason toimintamekanismit IL-1β GA huonosti tunnettu. P38 ja JNK ovat tärkeimmät MAPK perheenjäseniä, jotka säätelevät IL-1β signalointireitteihin. Täällä me tutkittiin miten molempien p38 ja JNK IL-1β aiheuttaman GA solumigraation, invaasiota ja metastaattisen potentiaalin. Tool Menetelmät
vaikutukset IL-1β aiheuttama p38 ja JNK-aktivaation GA soluissa määritettiin käyttäen in vitro TranswellTM maahanmuutto- ja invaasion määritykset MKN-45 ja AGS soluja, tai in vivo etäpesäkkeitä määrityksessä nude-hiirissä. IL-1β-indusoitua p38-signalointireitin on lisäksi tunnettu siitä, GA soluissa. Aktivointi IL-1β /p38 signalointireitille arvioitiin myös ihmisen ensisijainen GA kudosten immunohistokemiallisesti.
Tulokset
IL-1β aiheuttama aktivointi p38 lisääntynyt GA solujen vaeltamiseen ja invaasiota in vitro ja edistänyt metastaattisen potentiaalin GA-solut in vivo; nämä vaikutukset vaimenevat p38 siRNA tai p38-estäjän SB202190. MMP2 tai MMP9 siRNA ja MMP2 /9 estäjä Rajatarkastusasemat esti myös IL-1β aiheuttaman GA solumigraatio ja invaasiota in vitro. IL-1β aiheuttama p38 aktivaation huomattavasti MMP2 ja MMP-9 mRNA- ja proteiinin ilmentymiseen ja toimintaan. Lusiferaasireportteri- analyysit osoittivat, että aktivaattori proteiini-1 (AP-1), ja AP-1 sitoutumiskohdat MMP9
promoottori (-670 /MMP-9) aktivoitiin IL-1β-indusoitua p38 aktivaation. Fosfo-p38 oli merkittävästi yläreguloituja ihmisen GA kudoksissa (verrattuna sovitettu ei-neoplastiset kudokset), ja merkittävästi liittyvät imusolmuke etäpesäke, ja invaasio pidemmälle herakalvojen. Expression fosfo-p38 merkittävästi korreloi IL-1β, MMP2, MMP9, ja c-fos ilmaisua sekä ihmisen GA kudosten ja GA solu etäpesäkkeitä keuhkoihin nude-hiirten. IL-1β oli myös pystyvät aktivoimaan JNK GA soluissa, mutta aktivointi JNK ei liittynyt GA solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Siksi IL-1β aiheuttama muuttoliike ja hyökkäyksen GA solut säätelevät p38, mutta ei JNK.
Johtopäätökset
IL-1β aiheuttama p38 aktivaation ja IL-1β /p38 /AP-1 ( c-fos) /MMP2 & MMP-9 polku on tärkeä rooli etäpesäke GA; tämä reitti voi tarjota käyttöön uusi terapeuttinen kohde GA.
Avainsanat
IL-1β p38 Mahalaukun adenokarsinooma MMP2 ja MMP-9 AP-1 Etäpesäke Tausta
Lisääntyvä näyttö osoittaa, että kasvaimet edistettävä ja tulehduksellinen signaaleja kasvain microenvironment, ja kasvain microenvironment on merkittäviä rooleja edistämisessä syöpä [1, 2]. Sytokiinit, erityisesti sytokiinejä, joita tuumorisolut, ovat olennainen osa kasvaimen microenvironment. Tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-α), interleukiini-1β (IL-β) ja IL-6 ovat hyvin tunnettu sytokiinien joiden on osoitettu olevan läheistä sukua syövän etenemisessä. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että tulehduksen indusoiman sytokiinien tärkeä rooli kehitettäessä mahasyövän [3]. On hyvin osoitettu, että infektioita, erityisesti aiheuttama Helicobacter pylori,
kykenevät indusoimaan mahalaukun limakalvon tulehdusvasteet, jolloin säätelyä IL-1β, mikä puolestaan ​​voi edistää tulehdusta, joka liittyy syövän synty [4]. Kuitenkin taustalla molekyylitason mekanismit rooli IL-1β signalointi mahasyövän edelleen suureksi osaksi tuntemattomia, ja tällä hetkellä kiinnostava.
P38 kuuluu mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) Yläheimo. MAPK signalointireiteissä on hyvin tutkittu, ja ne koostuvat vähintään kolmen superperheistä ja MAPK, jotka säätelevät erilaisia ​​soluaktiivisuuksia [5]. On hyvin tunnettua, että p38 MAPK on kykenee säätelemään paljon soluvasteiden sytokiinien ja stressiä, mukaan lukien IL-1β [6]; kuitenkin, viimeaikaiset tiedot osoittivat, että p38 liittyy myös läheisesti kehittämiseen erilaisten ihmisen syövän kautta sen kyky nostaa syövän solujen vaeltamiseen ja invaasio vastauksena erilaisiin ärsykkeisiin, kuten tulehduksellinen tekijät [6]. Lisäksi p38 on myös mukana säätelyyn solujen erilaistumisen ja apoptoosin. Neljä isoformia p38 on tunnistettu tähän mennessä p38-α, p38-β, p38-γ, ja p38-δ [7]. Vaikka aminohapposekvenssit näistä p38 MAPK ovat enimmäkseen samat, ilmentymiskuvio kunkin isoformin vaihtelee [8]. P38-α on suuri p38 MAPK, ja se ilmaistaan ​​kaikkialla läsnä, p38-β ilmentyy pääasiassa aivoissa, kun taas p38γ on ilmentyy runsaana luustolihasten [9] ja p38-δ ilmentyy pääasiassa umpirauhasissa [10]. Useat tutkimukset ovat myös osoittaneet, että p38 osallistuu IL-1β signa- useista eri solutyyppejä, erityisesti hiiren alkion fibroblasti (MEF) solut ja makrofagit soluja [11, 12]; kuitenkin hyvin vähän tiedetään toiminta IL-1β-aktivoitua p38 mahasyövän.
c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK) on toinen MAPK perheenjäsen, joka on tunnettu myös tärkeä rooli sääntelyn IL-1β-signalointireitin [13]. Sen lisäksi, että osallistuminen asetukseen tulehduksellinen signaalireitin, JNK suorittaa useita muita tärkeitä solun toimintoja kuten solukasvun säätelyssä, erilaistumiseen, selviytymisen ja apoptoosin. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että JNK on usein yli-ilmentynyt eri syövän kudoksissa, ja ylös-säätely JNK voidaan läheisesti liittyy syövän invaasio [14]; kuitenkin, onko JNK osallistuu säätelyyn IL-1β aiheuttama mahasyövässä solumigraatioon ja invaasiota jää suurelta osin tuntemattomia.
Mahalaukun adenokarsinooma (GA) on yleisin kasvaintuumorisolujen vatsan; Siksi olemme keskittyneet GA tässä tutkimuksessa. Tässä, tutkimme aktivointi p38 ja JNK: n vasteena IL-1β, ja niiden vaikutus IL-1β-indusoidun metastaattisen potentiaalin GA-solujen in vitro tai in vivo.
Lisäksi ilmaus fosfo-p38 (p- p38) in GA, sen suhde viittaavia tekijöitä GA, ja korrelaatio IL-1β ja p-p38 tutkittiin ihmisen parafinoidut GA kudoksiin käyttämällä immunohistokemiallisesti. Lopuksi ominaista myös molekyylitason mekanismeja, jotka säätelevät IL-1β aiheuttama p38-välitteisen metastaattisen potentiaalin GA soluja.
Tulokset
IL-1β aiheuttama aktivointi p38 edistää GA solujen vaeltamiseen ja invaasiota in vitro
ensin tutkitaan, onko IL-1β pystyi aktivoimaan p38 signalointi GA soluissa. Kuten on esitetty kuviossa 1, aktivointi p38 (p-p38) havaittiin sekä GA solulinjoissa (AGS ja MKN-45-solut) käsittelyn jälkeen IL-1β: ssa 30 minuuttia; IL-1β-indusoidun aktivaation p38 inhiboi p38-estäjän SB202190 (kuvio 1A). Kuva 1 IL-1β edistää GA solumigraation ja invaasiota aktivoimalla p38. V: Western blotit vahvisti, että p-p38 voi indusoida 30 minuuttia stimulaation IL-1β in AGS ja MKN-45 solulinjoissa; aktivoituminen p38 IL-1β estyi p38-estäjän SB202190. B: n transfektointi p38 siRNA pudotti p38 ilmentymistä sekä kaksi GA solulinjoista. C-F: käsittely GA solujen IL-1β lisääntynyt solujen muuttoliikkeen ja invaasiota in vitro; nämä vaikutukset inhiboi p38 siRNA tai p38-reitin estäjä SB202190. ** P
< 0,05 vs. ryntäily siRNA (ohjaus siRNA) -transfected soluja stimuloidaan IL-1β; △△ P
< 0,05 vs. transfektoimattomissa soluissa (villityypin soluja) stimuloidaan IL-1β. Palkit osoittavat keskiarvo ± SD määrä kennoja näkökentän (x 400 suurennus) siirtymien ja invaasion määrityksissä. G: Edustavia valomikroskooppi kuvia AGS ja MKN-45 solumigraatio ja miehityksen TranswellTM määrityksissä.
P38 voi edistää muuttoliikettä ja hyökkäys eri syöpäsoluja [15]. Sen tutkimiseksi, IL-1β voi edistää muuttoliikettä ja invaasion GA soluihin aktivoimalla p38 signaloinnin, GA solut transfektoitu salatun siRNA (kontrolli siRNA) tai p38 siRNA, tai GA solut esikäsiteltiin tai ilman p38-reitin estäjä SB202190 olivat stimuloidaan IL-1β. TranswellTM muuttoliike ja hyökkäys analyysit osoittivat, että IL-1β stimulaation lisäsi muuttoa ja hyökkäys sekä AGS ja MKN-45-solut; kuitenkin, IL-1β aiheuttaman GA solumigraation ja invaasiota merkittävästi heikennetty knockdovvn p38 käyttämällä siRNA (kuvio 1 B-G) tai esikäsittelemällä SB202190 (kuvio 1 C-G). Yhdessä nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että IL-1β edistänyt GA solumigraatioon ja invaasiota välittävät p38.
IL-1β aiheuttama aktivointi p38 ylössäätelee MMP2 ja MMP-9 ilmaisun ja aktiivisuuden GA soluissa
MMP2 ja MMP-9 on osoitettu olevan tärkeitä rooleja syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäkkeiden [16]. Tutkia, onko MMP2 ja MMP-9 osallistuu myös IL-1β aiheuttama p38-säänneltyjen metastaattisen potentiaalin GA solujen, RT-PCR, immunosytokemia ja konfokaalimikroskopialla ja zymografian määritys suoritettiin määrittämään MMP2 ja MMP-9 ilmaisun ja toiminnan GA solulinjat transfektoitiin kontrolli-siRNA tai p38 siRNA, tai esikäsitelty kanssa tai ilman p38-inhibiittoria SB202190, ja sitten käsiteltiin kanssa tai ilman IL-1β. Kuten odotettua, MMP2 ja MMP9 ilmentyminen ja aktiivisuus olivat koholla vasteena IL-1β hoitoa (kuvio 2A C). Knockdown p38 käyttämällä siRNA, tai esikäsittelyä kanssa p38-estäjän SB202190 merkittävästi vähentynyt Il-1β aiheuttama MMP2 ja MMP-9 mRNA: n ilmentymisen ja aktiivisuuden molemmissa GA solulinjoissa (kuvio 2A C). Kuvio 2 IL-1β ylössäätelee MMP2 ja MMP-9 ilmaisun ja toimintaa aktivoimalla p38. V: RT-PCR-analyysi osoitti, että MMP2
ja MMP-9
mRNA yläreguloituja sekä AGS ja MKN-45 solujen hoitovasteen IL-1β; tämä vaikutus esti p38 siRNA tai p38-estäjän SB202190. B: kvantifiointi ilmaus MMP2
ja MMP-9
mRNA normalisoitiin GAPDH
mRNA. ** P
< 0,05 vs. ryntäily siRNA-transfektoiduissa soluissa stimuloidaan IL-1β. △△ P
< 0,05 vs. transfektoimattomiin soluja stimuloidaan IL-1β. C: geelitsymografiaa osoittivat, että MMP2 ja MMP-9 aktiivisuutta yläreguloituja sekä AGS ja MKN-45 solujen hoitovasteen IL-1β; tämä vaikutus esti p38 siRNA tai p38-estäjän SB202190. D: immunosytokemiallinen värjäys ja konfokaalimikroskopialla vahvisti, että IL-1β aktivoitunut p38 (punainen), ja MMP2 ja MMP9 (vihreä) ilmentyminen MKN-45 GA-solut; nämä vaikutukset esti p38 siRNA tai p38-estäjän SB202190.
Immunosytokemia ja konfokaalimikroskopialla osoittivat, että p-p38 oli heikosti ilmaistu hoitamattomilla MKN-45 soluja, jotka ilmaisivat myös hyvin alhainen MMP2 ja MMP-9. Stimulaation jälkeen IL-1β, merkittävästi kohonneet p-p38, MMP2 ja MMP9 havaittiin MKN-45-solut; nämä IL-1β aiheuttama vaikutuksia inhiboi p38 siRNA ja SB202190 (kuvio 2D). Yhdessä nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että IL-1β kautta p38-indusoidun invaasion ja migraation GA solujen välittyy kyky p-p38 upregulate MMP2 ja MMP9 ilmentyminen ja aktiivisuus.
IL-1β-indusoidun aktivaation p38 säätelee lisäävästi MMP2 ja MMP9 aktivoimalla AP-1-riippuvaisen transkription in GA-soluissa
on hyvin dokumentoitu, että transkriptiotekijän aktivaattori proteiini-1 (AP-1) voi säädellä ilmentymistä MMP2 ja MMP9 [17], ja aktivointi p38 pystyy säätelemään AP-1 aktivaatio [18]. Jotta voidaan tutkia, onko IL-1β aiheuttama p38-välitteisten kohonnut MMP2 ja MMP-9 ilmaisun ja toiminta ovat riippuvaisia ​​AP-1, aktivointi AP-1-riippuvaisen transkription tutkittiin GA käsitellyissä soluissa tai ilman IL-1β, vuonna läsnäolo tai puuttuminen p38 inhibition, käyttäen AP-1 lusiferaasireportterilla määrityksessä. IL-1β lisäsi aktiivisuutta AP-1 sekä GA solulinjoissa (kuvio 3A); kuitenkin, p38 käyttäen p38 siRNA tai esikäsitelty solujen p38-estäjän SB202129 vähensi IL-1β-indusoidun AP-1-aktiivisuutta sekä GA solulinjoissa (kuvio 3A). Nämä tulokset osoittavat, että IL-1β indusoiman p38-välitteisen ilmentymisen MMP2 ja MMP9 ovat riippuvaisia ​​AP-1. Kuva 3 IL-1β aktivoi AP-1 aktiivisuuden kautta p38-reitin. V: Molemmat GA solut transfektoitiin AP-1 reportteriplasmidilla tai AP-1 reportteriplasmidilla yhdessä scramble siRNA tai p38 siRNA. AP-1 lusiferaasireportterigeenillä aktiivisuus lisääntyi merkitsevästi IL-1β stimulaation sekä AGS ja MKN-45-solut; nämä vaikutukset olivat merkittävästi estivät p38-siRNA annoksesta riippuvaisella tavalla, ja myös estää p38-estäjän SB202190. ** P
< 0,05 vs. kontrolli siRNA (ryntäily siRNA) + AP-1 luc-transfektoituja soluja stimuloidaan IL-1β; ΔΔP
< 0,05 vs. AP-1 luc-transfektoituja soluja stimuloidaan IL-1β; suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus normalisoitiin B-gal. B: IL-1β aiheuttama p38-välitteisen MMP9
promoottorit on riippuvainen AP-1-sitoutumiskohtia. ** P
< 0,05 vs. transfektoitujen -670 /MMP-9 + ohjaus siRNA soluja stimuloidaan IL-1β; ΔΔP
< 0,05 vs. transfektoitujen -670 /MMP-9-solut stimuloidaan IL-1β; ▼▼ P
< 0,05 vs. transfektoitujen -570 /MMP-9-solut stimuloidaan IL-1β; suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus oli normalisoitu B-gal.
Jotta voitaisiin edelleen vahvistaa, että rooli AP-1: IL-1β aiheuttama p38-reitin, lusiferaasireportterigeenillä vektoreihin, jotka sisältävät AP-1-kohtiin MMP9
promoottorin alueet transfektoitiin GA soluihin. Mukaisesti AP-1 reportterigeenin määrityksissä lusiferaasiaktiivisuudet -670 /MMP-9
promoottorialueen (sisältää kaksi AP-1 sitoutumiskohdat [-533 ja -79] ja yksi NF-КB sitoutumiskohta [-600 ] [19-21]) lisäsi merkittävästi IL-1β-stimuloitujen solujen (kuvio 3B). Solujen transfektio p38-siRNA: lla tai esikäsitelty solujen p38-estäjän SB202129 vähensi IL-1β-indusoidun lusiferaasin aktiivisuus -670 /MMP-9
promoottorin reportterigeenin (kuvio 3B). Lusiferaasin aktiivisuus MMP-9
promoottori (-571 /MMP-9
) ei ole muutettu poistetaan NFKB-sitoutumiskohdan (-600). Lisäksi, kun AP-: 1 (-79 ja -533) ja MMP-9
promoottori oli poistettu (-73 /MMP-9
mutantit), lusiferaasin aktiivisuus reportterigeenin merkittävästi vähentynyt verrattuna vastaavaan luonnossa tyyppinen ohjaus reportterigeenit (kuvio 3B). Yhdessä nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että IL-1β indusoi aktivoitumisen p38 signalointireitin, joka edistää hyökkäyksen ja migraatio GA solujen kautta AP-1-riippuvaista säätelyä MMP2 ja MMP-9 ilmaisun ja toimintaa.
Knockdovvn MMP2 tai MMP9 vähentää IL-1β aiheuttaman muuttoliikkeen ja hyökkäyksen GA soluissa
edelleen vahvistaa, että IL-1β aiheuttaman GA solumigraation ja invaasio liittyy säätelyä MMP2 ja MMP-9, AGS ja MKN-45-solut transfektoitiin siRNA: illa vastaan ​​MMP2
tai MMP9
, tai esikäsitelty kanssa tai ilman MMP2 /MMP-9 estäjä rajatarkastusasemien, ja sitten stimuloitiin IL-1β. Transwell muuttoliike ja hyökkäys analyysit osoittivat, että IL-1β aiheuttama muuttoliike ja invaasion GA solut merkittävästi heikennetty knockdovvn MMP2
tai MMP9,
tai esikäsittelyä rajatarkastusasemilla, verrattuna ohjata soluja (kuvio 4A C). Siksi säätelyä MMP2 ja MMP-9 ovat ratkaisevia IL-1β aiheuttaman GA solumigraation ja invaasiota. Kuva 4 knockdovvn MMP2 tai MMP9 tai esikäsittelyä kanssa MMP2 /9 estäjä Rajatarkastusasemat inhiboi IL-1β aiheuttaman GA solumigraatio ja invaasiota in vitro. V: RT-PCR vahvisti tehokkuutta MMP2 tai MMP9 siRNA: ita, joka merkittävästi vähentää MMP2
tai MMP9
ilmaisu, vastaavasti, jopa yli 75%. B: IL-1β kasvoi GA solujen vaeltamiseen ja invaasiota in vitro; nämä vaikutukset inhiboi MMP2 tai MMP9 siRNA tai MMP2 /9 estäjä rajatarkastusasemilla. ** P
< 0,05 vs. ryntäily siRNA (ohjaus siRNA) -transfected soluja stimuloidaan IL-1β. Bars ovat keskiarvo ± SD kertamuutoksia normalisoitu kontrolliryhmään maahanmuutto- ja invaasion määrityksissä. C: Havainnollinen valomikroskoopilla kuvia AGS ja MKN-45 solumigraatio ja miehityksen TranswellTM muuttoliike ja invaasion määrityksissä.
IL-1β aiheuttama aktivointi JNK ei osallistu säätelyyn GA solumigraation ja invaasiota
on tunnettua, että jäsenet MAPK tärkeitä rooleja säätelyyn soluvasteiden sytokiinien ja stressi ja P38 ja JNK ovat tärkeimmät MAPK perheenjäseniä, jotka säätelevät IL-1β signalointireitteihin. Ymmärtää onko JNK liittyy myös IL-1β aiheuttaman GA solumigraation ja invaasio, Western blot -analyysi suoritettiin havaitsemiseksi aktivaation JNK vastauksena IL-1β. Kuten esillä kuviossa 5A, p-JNK havaittiin sekä AGS ja MNK-45-solulinjojen stimulaation jälkeen IL-1β: ssa 30 minuuttia. Kuitenkin tulokset sekä Transwell muuttoliikkeen ja hyökkäys määritykset osoittivat, että lisääntynyt liikkuvuus ja hyökkäys sekä AGS ja MKN-45-solujen indusoiman IL-1β stimulaation eivät lieventyneet Knockdown JNK siRNA eikä heikennetty estämällä JNK-reitin kanssa JNK estäjän SP600125 kumpikaan (kuva 5B D); Määrä muuttivat ja invasiiviset solut melkein ei osoittivat muutoksia ennen tai jälkeen transfektion siRNA vastaan ​​JNK (P > 0,05) tai tai ilman esikäsitelty JNK estäjän SP600125 (P > 0,05). JNK ei liittynyt IL-1β-edistänyt GA solumigraatioon ja invaasiota jotka on edelleen todentaa AP-1 lusiferaasireportterilla määritys. Koska ylävirtaan kinaasi c-Jun (toinen tärkeä osa AP-1), JNK pystyy aktivoimaan AP-1, ja aktivointi AP-1 JNK liittyy läheisesti JNK: n toiminta sääntelyä erilaisten solureaktio kuten syöpää solujen migraation ja invaasion [22]; kuitenkin, IL-1β-indusoidun AP-1-aktivaation sekä AGS ja MKN-45-soluissa ei inhiboi JNK siRNA eikä JNK-inhibiittori SP600125 ole (kuvio 5E). Yhdessä nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että lisääntynyt GA muuttoliikkeen ja invaasio edistää IL-1β ei säädetä JNK. Kuva 5 aktivointi JNK ei liity IL-1β aiheuttaman GA solumigraation ja invaasiota. V: p-JNK havaittiin 30 minuutin stimulaation IL-1β in AGS ja MKN-45 solulinjoissa. B: n transfektointi JNK siRNA pudotti JNK ilmaisua sekä kaksi GA solulinjoista. C-D: käsittely GA solujen IL-1β lisääntynyt solujen muuttoliikkeen ja invaasiota in vitro; nämä vaikutukset eivät inhiboi JNK siRNA eikä JNK-reitin estäjä SP600125. ** P
< 0,05 vs. ryntäily siRNA-transfektoiduissa soluissa stimuloidaan IL-1β; △△ P
< 0,05 vs. transfektoimattomissa soluissa (villityypin soluja) stimuloidaan IL-1β; ## Tai ●● ole merkittävää eroa näiden kahden ryhmän havaittu (P
> 0,05). Bars ilmoitettu keskiarvo ± SD määrä kennoja näkökentän maahanmuuttoprosessissa ja invaasion määrityksissä. D: Havainnollinen valomikroskooppi kuvia AGS ja MKN-45 solumigraatio ja hyökkäyksen Transwell määrityksissä. E: Molemmat GA solut transfektoitiin AP-1 reportteriplasmidilla tai AP-1 reportteriplasmidilla yhdessä scramble siRNA tai JNK siRNA. AP-1 lusiferaasireportterigeenillä aktiivisuus lisääntyi merkitsevästi IL-1β stimulaation sekä AGS ja MKN-45-solut; nämä vaikutukset eivät inhiboi JNK siRNA eikä inhiboi JNK estäjä SP600125 kumpikaan. ** P
< 0,05 vs. kontrolli siRNA (ryntäily siRNA) + AP-1 luc-transfektoituja soluja stimuloidaan IL-1β; ΔΔP
< 0,05 vs. AP-1 luc-transfektoituja soluja stimuloidaan IL-1β; ## Tai ●● ole merkittävää eroa näiden kahden ryhmän havaittu (P
> 0,05). Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus oli normalisoitu B-gal.
Phospho-p38 on ylössäädelty ja korreloi IL-1β, MMP2, MMP9 ja c-fos ihmisen GA kudoksissa
ilmentyminen p-p38 on sarja 105 GA kudosten ja pariksi ei-neoplastisia mahalaukun kudoksissa tutkittiin immunohistokemiallisesti (IHC). On 105 syöpä näytteitä, 53 tapausta GA kudosten (50,48%) oli yli-ilmentyminen p-p38 verrattuna pariksi ei-neoplastisten mahalaukun kudoksissa (P
< 0,05; kuvio 6A). Positiivinen p-p38 ilmentymistä havaitaan usein sekä GA sytoplasmaan ja tuman. Kuva 6 Fosfory- p38 yli-ilmennetään ihmisen GA, ja ilmaus p-p38 positiivisesti korreloi IL-1β, MMP2, MMP9 ja c-fos ilmentymisen GA kudoksissa. V: n yli-ilmentyminen p-p38 havaitaan usein GA kudoksissa verrattuna pariksi ei-neoplastisia mahalaukun kudoksiin. a, P-p38 ei havaittu tai ilmentyy vain heikosti ei-neoplastisia mahalaukun kudoksissa. b e: eri voimakkuuksilla positiivista p-p38 ilmentymistä GA kudoksissa. B: Expression of p-p38 korreloi positiivisesti IL-1β, MMP2, MMP9, ja c-fos ilmentymisen ihmisen GA kudoksissa. GA kudosnäytteestä näytteille vahvempaa IL-1β ilme ja vahvempi p-p38, MMP2, MMP9 ja c-fos ilmaisu; ja heikompi IL-1β ilmaisun ja heikko p-p38, MMP2, MMP9 ja c-fos ilme. C: summa tulokset positiivista värjäytymistä intensiteetin IHC p-p38. ** P
< 0,05 vs. pariksi ei- neoplastisten mahan kudoksissa.
Mitään merkittäviä yhdistysten välillä ei havaittu yli-ilmentymisen p-p38 että potilaiden ikä (< 50 tai ≥ 50 vuotta), sukupuoli, kasvaimen koko (< 3 cm tai ≥ 3 cm), histologinen tyyppi tai laatu erilaistumista. Kuitenkin yli-ilmentyminen p-p38 näytetä merkittävästi liittyvät imusolmuke etäpesäke (P
< 0,05), ja invaasio jälkeen herakalvojen (P
< 0,05). Nämä tiedot viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen p-p38 liittyy etäpesäkkeitä ihmisen GA.
Kuten esillä kuviossa 6B, ilmentymisen p-p38 oli hyvä correlativity tasojen kanssa IL-1β, MMP2, MMP9 ja AP-1 (c-fos) in GA kudokseen, ja merkittävä korrelaatio kohonnut p-p38 ilmaisua ja säätelyä IL-1β, MMP2, MMP9 ja c-fos GA kudoksessa (r = 0,72, p < 0,01; r = 0,63, p < 0,01; r = 0,58, p < 0,05 ja r = 0,69, p < 0,01) havaittiin, kun analysoitiin Spearmanin menetelmällä.
summa tulokset positiivista värjäytymistä intensiteetin IHC p-p38 molemmissa 105 tapauksissa GA kudosten ja pariksi ei-neoplastisia mahalaukun kudoksia esillä kuvio 6C.
Invasion määritys nude-hiirissä
MKN-45-soluja transfektoitiin salattu siRNA tai p38 siRNA injektoitiin häntälaskimoon BALB /c nu /nu hiirillä; IL-1β tai PBS: ää myös intraperitoneaalisesti ruiskutetaan päivänä solut injektoitiin 14 päivää. Ryhmä 1 injektoitiin PBS: llä ja salatun siRNA-transfektoiduissa MKN-45-solut; ryhmä 2 injektoitiin IL-1β ja salattuja siRNA-transfektoiduissa MKN-45-solut; ja ryhmä 3 injektoitiin p38 siRNA-transfektoiduissa MKN-45-soluja ja IL-1β.
At 45 päivää injektion jälkeen solut, kaikki eläimet (6/6; 100%), IL-1β-käsitellyssä ryhmässä oli kehittynyt keuhkoetäpesäkkeet (kuvio 7A D) (ryhmä 2; keskimäärin etäispesäkkeitä 6 keuhkoleikkeissä oli 14 per keuhko). Sitä vastoin vähemmän eläimiä (2 /6,33.33%) kontrolliryhmässä, joka oli injektoitu IL-1β oli kehittynyt keuhkojen etäpesäkkeiden (ryhmä 1, keskimäärin 6 etäpesäkkeiden 6 keuhkoleikkeissä per keuhko). Kun taas vain kaksi eläimiä p38 siRNA plus IL-β-hoidetussa ryhmässä kehittyi keuhkojen etäpesäkkeet ja keuhko- metastaasien lukumäärä tässä ryhmässä oli merkitsevästi alempi (ryhmä 3, keskimäärin 4 etäpesäkkeitä 6 keuhkoleikkeissä per keuhko) ja huomattavasti pienemmät kuin vastaavan ryhmän käsiteltiin IL-1β (ryhmä 2) (kuvio 7A ja D). Kuva 7 IL-1β stimulaation kasvattaa metastaattisen potentiaalin GA solujen in vivo p38-riippuvaisen mekanismin. V: Edustavia keuhkoetäpesäkkeet muotoilla eri ryhmään hiirellä. B: Bars osoitti eläinten lukumäärä kehittyi keuhkojen etäpesäkkeet. C: Havainnollinen tulokset HE värjäytymistä keuhkometastaaseista. D: Bars ilmoitettu keskiarvo ± SD useita etäispesäkkeitä 6 keuhkoleikkeissä /per keuhko hiirillä, jotka olivat kehittäneet keuhkometastaaseja. △△ P
< 0,05 vs. pistetään scramble siRNA transfektoituja soluja plus IL-1β stimulaatiota. E: RT-PCR-analyysi p38, MMP2, MMP9
ja c-fos
mRNA-ekspressio keuhkoissa etäpesäkkeet eri hiirillä. F: IHC analyysi p-p38, MMP2, MMP9 ja c-fos-proteiinin ilmentyminen keuhkoissa etäpesäkkeet; IL-1β aiheuttama kohonnut p-p38, MMP2, MMP9 ja c-fos-proteiinin ilmentymisen.
Edelleen vahvistaa, onko p38, MMP2 ja MMP-9 ovat mukana IL-1β aiheuttaman keuhkotulehduksen etäpesäke GA soluja, ja onko tämä prosessi säädellään AP-1-mRNA: n ekspressiotasot p38, MMP2, MMP9
ja c-fos
(yksi keskeinen osa AP-1) in metastasoitunut keuhkojen kvantitoitiin RT-PCR: llä, ja p-p38 , MMP2, MMP9 ja c-fos-proteiinin ilmentyminen keuhkoissa leikkeet tutkittiin käyttämällä IHC. Kuten kuviossa 7 on esitetty E ja F, ilmentymisen tasot p-p38, MMP2, MMP9 ja c-fos keuhkoissa metastaasipesäkkeiden olivat koholla vasteena IL-1β. Aktivointi p38 ja mRNA: n tai proteiinin ilmentymisen tasoja p38, MMP2, MMP9 ja c-fos olivat pienempiä etäpesäkkeitä muodostuu transfektoitujen solujen p38 siRNA plus IL-β-hoidetussa ryhmässä (group3) tai kontrolliryhmässä (group1 ) verrattuna etäpesäkkeitä muodostama scramble siRNA plus IL-β-hoidetussa ryhmässä (ryhmä 2) (Kuva 7E ja F). Yhdessä in vivo data vahvistaa myös, että IL-1β aiheuttama GA solun etäpesäke välittyy p38 signaloinnin kautta AP-1 riippuvainen säätelyä MMP2 ja MMP-9.
Keskustelu
Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että IL 1β kykenee aktivoimaan p38 ja JNK [11, 12], ja p38 ja JNK tärkeitä rooleja syöpäsolujen muuttoliike ja invaasiota [14, 23-26]. Siksi me hypoteesi, että IL-1β voi myötävaikuttaa GA invaasio ja metastaasi kautta aktivoimalla p38 ja JNK polkuja. Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi, arvioimme kyky IL-1β aktivoida p38 ja JNK, ja edistää muuttoliikkeen ja hyökkäyksen GA soluja. Tuloksemme osoittivat, että IL-1β voi aktivoida sekä p38, ja JNK ja lisätä GA solujen vaeltaminen ja invaasiota, ja että nämä vaikutukset voitiin estää p38 siRNA tai p38-estäjän SB 202190, mutta ei JNK siRNA tai JNK estäjä SP600125. Tämä on ensimmäinen osoitus siitä, että IL-1β voi aiheuttaa GA solumigraatioon ja invaasiota aktivoimalla p38; kuitenkin, taustalla molekyylitason mekanismit, joilla IL-β-välitteisen p38-signalointi säätelee aikana mahasyövän edelleen suureksi osaksi tuntemattomia.
Yksi mahdollinen mekanismi, jolla p38 voi lisätä hyökkäyksen ja migraation syöpäsolujen nostamalla tasot MMP [ ,,,0],27]. Se on vakiintunut, että eritystä MMP kanssa kapasiteetti soluväliaineen (ECM) hajoaminen on ominaista metastaattinen syöpäsolujen [28]. MMP2 ja MMP-9 ovat kaksi kaikkein hyvin tunnettu MMP ja liittyvät läheisesti syövän eteneminen ja metastaasit vuoksi vahvan proteolyyttisen aktiivisuuden ECM [29]. Raportoimme tässä myös ensimmäistä kertaa, että todennäköisesti molekyylitason mekanismi, jonka IL-1β edistää GA solumigraatioon ja invaasion voi liittyä IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & MMP-9 signalointireitin. Olemme osoittaneet, että molemmat MMP2 ja MMP-9 oli yläreguloituja GA soluissa reaktiona IL-1β stimulaation; nämä vaikutukset inhiboi siRNA: t vastaan ​​p38, MMP2
tai MMP9
, p38-estäjän SB202190, ja MMP2 /9 estäjä rajatarkastusasemilla. Lisäksi knockdovvn MMP2
tai MMP9
käyttämällä siRNA: t, tai esto MMP2 /9 aktiivisuuden avulla rajatarkastusasemilla, merkittävästi vähentynyt IL-1β aiheuttaman GA solumigraation ja invaasiota. Kuten seriini /treoniini proteiinikinaasi, p38 kykenee indusoimaan aktivaation transkriptiotekijän AP-1 [30]. Olemme lisäksi havainneet, että IL-1β-indusoidun, p38-välitteinen säätelyä MMP2 ja MMP9 olivat AP-1-riippuvainen. IL-1β pystyi aktivoimaan transkription MMP9
promoottorin alueista AP-1 sivustot, ja nämä vaikutukset olivat lieventyneet p38 siRNA ja p38-estäjän SB202190. Lisäksi, IL-1β-indusoidun aktivaation AP-1-riippuvaista transkriptiota estyi p38 siRNA.
Phospho-p38 (p-p38), aktivoitu muoto p38, voitiin havaita lähes 50% ihmisen GA kudosnäytteiden testataan IHC määrityksellä, ja ilmentyminen p-p38 oli merkitsevästi yhteydessä imusolmuke etäpesäke, ja invaasio pidemmälle herakalvojen potilailla, joilla GA. Lisäksi IL-1 p korreloi positiivisesti ilmentymisen p-p38, MMP2, MMP9 ja c-fos: n kliinisiä GA yksilöitä. Lisäksi in vivo tietoja etäpesäke määrityksessä osoitti, että muodostumista keuhkojen metastaasipesäkkeiden GA soluja, ja p38 /
p-p38, MMP2, MMP9 ja c-fos mRNA ja proteiinin ilmentyminen keuhkoissa metastaasipesäkkeiden olivat koholla by IL-1β, ja vähennetään solujen injektointia transfektoitu p38 siRNA. Yhdessä nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että IL-1β-indusoidun GA solumigraation ja invaasio tapahtuu aktivoimalla p38-signalointireitin, joka johtaa AP-1 aktivaatio ja säätelyä MMP2 ja MMP9. Siksi p38 on keskeinen rooli IL-1β aiheuttama etäpesäke GA.
JNK on toinen tärkeä MAPK olevan hyvin tiedossa tärkeitä rooleja asetuksessa IL-1β signalointi useissa eri soluissa [14, 31]. Kuitenkin tässä tutkimuksessa, JNK havaittiin eivät osallistu säätelyyn IL-1β aiheuttaman GA solumigraation ja invaasiota. JNK siRNA ja JNK estäjä ei vaimentanut IL-1β indusoi GA solumigraatioon ja invaasio, eikä vaimentavat aktivointi AP-1 indusoi IL-1β. Siksi IL-1β-edistänyt GA solumigraation ja invaasiota säätelee p38, mutta ei JNK.
Yhteenvetona olemme tunnistaneet ensimmäistä kertaa, että IL-1β on toiminnallisesti mukana säätelyssä etäpesäkkeiden GA kautta aktivointi p38. Tämä molekyyli mekanismi käsittää p38-välitteisten AP-1-riippuvaista säätelyä sekä MMP2 ja MMP9; ja tämä tutkimus viittaa vahvasti siihen, että IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Gastroparesis liittyvät gastroptosis esittää kuin alavatsan täyteaineena massa lapsi: tapaus report
• Influence of IL17A polymorfismien on poikkeava metyloinnin DAPK ja CDH1 in ei-syöpä mahalaukun mucosa