IL-1β-indusert aktivering av p38 fremmer metastaser i adenokarsinom i ventrikkel via oppregulering av AP-1 /c-fos, MMP2 og MMP9

IL-1β-indusert aktivering av p38 fremmer metastaser i adenokarsinom i ventrikkel via oppregulering av AP-1 /c-fos , MMP2 og MMP9
Abstract
Bakgrunn
interleukin-1β (IL-1β) har vært innblandet i utviklingen av adenokarsinom i ventrikkel (GA); derimot, er de molekylære virkningsmekanismer av IL-1β i GA dårlig karakterisert. P38 og JNK er de viktigste MAPK familiemedlemmer som regulerer IL-1β signalveier. Her undersøkte vi rollen til både p38 og JNK i IL-1β-indusert cellemigrering GA, invasjon og metastatisk potensiale.
Methods
Virkningene av IL-1β-indusert p38 og JNK-aktivering i GA-celler ble bestemt ved hjelp av in vitro Transwell migrasjon og invasjonsanalyser av MKN-45 og AGS-celler, eller en in vivo-assay metastaser i nakne mus. IL-1β-indusert p38 signalveien ble videre karakterisert i GA-celler. Aktivering av IL-1β /p38 signalveien ble også vurdert i humane primære GA vev ved immunhistokjemi.
Resultater
IL-1β-indusert aktivering av p38 økt GA celle migrasjon og invasjon in vitro og fremmet metastatisk potensial for GA celler in vivo; disse effektene ble svekket av p38 siRNA eller p38 inhibitor SB202190. MMP2 eller MMP9 siRNAs og MMP2 /9-hemmer BIP også hemmet IL-1β-indusert GA celle migrasjon og invasjon in vitro. IL-1β-indusert aktivering av p38 betydelig øket MMP2 og MMP9 mRNA og protein ekspresjon og aktivitet. Luciferase reporter-analyser viste at aktivatoren protein-1 (AP-1) og AP-1-bindingssetene av MMP9
promoter (-670 /MMP9) ble aktivert ved hjelp av IL-1β-indusert p38-aktivering. Fosfo-p38 var signifikant oppregulert på humane vev GA (sammenlignet med matchede ikke-neoplastiske vev), og signifikant assosiert med lymfeknutemetastase, invasjon og utover serosa. Ekspresjon av fosfo-p38 signifikant korrelert med IL-1β, MMP2, MMP9, og c-fos-ekspresjon i både menneskelige vev og GA GA cellemetastaser i lungene av nakne mus. IL-1β var også i stand til å aktivere JNK i GA-celler, men aktivering av JNK var ikke assosiert med GA cellemigrering og invasjon. Derfor, IL-1β-indusert migrering og invasjon i GA-celler ble regulert av p38, men ikke av JNK.
Konklusjoner
IL-1β-indusert aktivering p38 og IL-1β /p38 /AP-1 ( c-fos) /MMP2 & MMP9 pathway spiller en viktig rolle i metastaser i GA; denne veien kan gi en ny terapeutisk mål for GA.
nøkkelord
IL-1β p38 Gastric adenokarsinom MMP2 og MMP9 AP-en metastaser Bakgrunn
Økende bevis indikerer at svulster er fremmet og opprettholdes av inflammatoriske signaler fra svulsten mikromiljøet, og svulsten mikromiljøet spiller viktige roller i markedsføringen av kreft [1, 2]. Cytokiner, spesielt cytokiner utskilt av tumorceller, er essensielle komponenter av svulsten mikromiljøet. Tumornekrosefaktor alfa (TNF-α), interleukin-1β (IL-β) og IL-6 er de mest godt karakterisert cytokiner som har vist seg å være nært knyttet til kreft progresjon. Mange studier har vist at inflammasjon indusert av cytokiner spiller en viktig rolle i utviklingen av magekreft [3]. Det er godt etablert at infeksjoner, spesielt de forårsaket av Helicobacter pylori, etter er i stand til å indusere gastrisk mucosal inflammatoriske responser, noe som resulterer i oppregulering av IL-1β, som i sin tur kan fremme betennelses forbundet karsinogenese [4]. Men de underliggende molekylære mekanismer for rollen som IL-1β signalisering i magekreft fortsatt i stor grad ukjent, og er for tiden av interesse.
P38 er et medlem av mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) super. MAPK-signalveier har blitt godt undersøkt, og består av minst tre familiene av MAPK som regulerer diverse cellulære aktiviteter [5]. Det er vel kjent at p38 MAPK er i stand til å regulere en rekke cellulære responser til cytokiner og stress, inkludert IL-1β [6]; imidlertid nyere data viste at p38 er også nært knyttet til utvikling av forskjellige typer av kreft hos mennesker via sin evne til å heve kreftcellemigrering og invasjon i respons til forskjellige stimuli, inkludert inflammatoriske faktorer [6]. I tillegg er p38 også involvert i regulering av celledifferensiering og apoptose. Fire isoformer av p38 er blitt identifisert hittil: p38-α, p38-β, p38-γ, og p38-δ [7]. Selv om aminosyresekvensene til disse p38 MAPK er stort sett identiske, uttrykket mønster av hver isoform varierer [8]. P38-α er den viktigste p38 MAPK og er uttrykt overalt, er p38-β hovedsakelig uttrykt i hjernen, mens p38γ er rikelig uttrykt i skjelettmuskulatur [9] og p38-δ er hovedsakelig uttrykt i endokrine kjertler [10]. Mange studier har også vist at p38 deltar i IL-1 p signale kaskader i et sett av celletyper, særlig i mus embryo fibroblast (MEF) celler og makrofager celler [11, 12]; imidlertid, er meget lite kjent om funksjonen av IL-1β-aktivert p38 i magekreft.
c-Jun N-terminal kinase (JNK) er en annen MAPK familiemedlem som også er vel kjent for å spille en viktig rolle i reguleringen IL-1β signalveien [13]. I tillegg til å delta i reguleringen inflammatoriske signalveien, utfører JNK flere andre viktige cellulære funksjoner inkludert regulering av cellevekst, differensiering, overlevelse og apoptose. Videre har nylige studier viser at JNK er ofte over-uttrykkes på forskjellige kreftvev, og oppregulering av JNK kan være nært forbundet med kreft invasjon [14]; imidlertid, om JNK deltar i regulering av IL-1β-indusert gastrisk kreft cellemigrering og invasjon forblir stort sett ukjent
gastrisk adenokarsinom (GA) er den mest vanlige neoplastisk tumor i magen.; Derfor fokuserte vi på GA i denne studien. Her undersøkte vi aktivering av p38 og JNK i respons til IL-1β, og deres virkning på IL-1β-indusert metastatisk potensial av GA-celler in vitro eller in vivo.
I tillegg, ekspresjon av fosfo-p38 (p- p38) i GA, ble dens forhold til de clinicopathologic trekk ved GA, og korrelasjonen mellom ekspresjonen av IL-1β og p-p38 undersøkt i humane parafininnstøpte GA vev ved hjelp av immunhistokjemi. Til slutt, vi også preget de molekylære mekanismene som regulerer IL-1β-indusert p38-mediert metastatisk potensial for GA celler.
Resultater
IL-1β-indusert aktivering av p38 fremmer GA celle migrasjon og invasjon in vitro
Først må vi undersøkt om IL-1β var i stand til å aktivere p38 signal i GA celler. Som vist i figur 1, ble aktivering av p38 (p-p38) detektert i begge GA cellelinjer (AGS og MKN-45-celler) etter behandling med IL-1β i 30 min; IL-1β-indusert aktivering av p38 ble hemmet av p38-inhibitor SB202190 (figur 1A). Figur 1 IL-1β fremmer GA cellemigrering og invasjon ved å aktivere p38. A: Western blot bekreftet at p-p38 kan være forårsaket av 30 min stimulering med IL-1β i AGS og MKN-45 cellelinjer; aktivering av p38 med IL-1β ble hemmet av p38-inhibitor SB202190. B: Transfeksjon av p38 siRNA slått ned p38 uttrykk i begge de to GA cellelinjer. C-F: Behandling av GA-celler med IL-1β øket cellemigrering og invasjon in vitro; disse effektene ble hemmet av p38 siRNA eller p38 pathway inhibitor SB202190. ** P
< 0,05 vs. rykke siRNA (kontroll siRNA) -transfected celler stimulert med IL-1β; △△ P
< 0,05 vs. ikke-transfekterte celler (vill-type-celler) stimulert med IL-1β. Linjene indikerer middelverdien ± SD antall celler per synsfelt (× 400 forstørrelse) i migrasjons- og invasjons analyser. G:. Representative lys mikroskop bilder av AGS og MKN-45 celle migrasjon og invasjon i Transwell analyser
P38 kan fremme migrasjon og invasjon av ulike kreftceller [15]. For å undersøke hvorvidt IL-1β kan fremme migrering og invasjon av GA-celler via aktivering av p38-signalering, GA celler transfektert med en egge siRNA (kontroll siRNA) eller p38 siRNA eller GA-celler forbehandlet med eller uten p38-reaksjonsveiinhibitor SB202190 var stimulert med IL-1β. Transwell migrasjon og invasjon analyser har vist at IL-1β stimulering økt migrasjon og invasjon av både AGS og MKN-45 celler; imidlertid, IL-1β-indusert GA celle migrering og invasjon ble betydelig svekket ved knockdown av p38 ved bruk av siRNA (figur 1 B til G) eller forbehandling med SB202190 (figur 1C til G). Samlet utgjør disse dataene sterkt at IL-1β forfremmet GA celle migrasjon og invasjon er mediert av p38.
IL-1β-indusert aktivering av p38 oppregulerer MMP2 og MMP9 uttrykk og aktivitet i GA celler
MMP2 og MMP9 ha vist seg å spille en viktig rolle i kreftcelle invasjon og metastasering [16]. For å undersøke om MMP2 og MMP9 også delta i IL-1β-indusert p38 regulert metastatisk potensial av GA-celler, ble RT-PCR, immunocytokjemi og konfokal mikroskopi, og zymografi analyse utføres for å bestemme MMP2 og MMP9 ekspresjon og aktivitet i GA cellelinjer transfektert med kontroll siRNA eller p38 siRNA eller forbehandlet med eller uten p38 inhibitor SB202190, og deretter behandlet med eller uten IL-1β. Som forventet, ble MMP2 og MMP9 ekspresjon og aktivitet forhøyet i respons til IL-1β behandling (figur 2A til C). Knockdown av p38 ved bruk av siRNA, eller forbehandling med den p38-inhibitor SB202190 signifikant redusert Il-1β-indusert MMP2 og MMP9 mRNA-ekspresjon og aktivitet i begge GA cellelinjer (figur 2A til C). Figur 2 IL-1β oppregulerer MMP2 og MMP9 uttrykk og aktivitet ved å aktivere p38. A: RT-PCR-analyse viste at MMP2 Hotell og MMP9
mRNA ble oppregulert i begge AGS og MKN-45 celler i respons på behandling med IL-1β; Dette ble blokkert av p38 siRNA eller p38 inhibitor SB202190. B: Kvantifisering av uttrykk for MMP2 Hotell og MMP9
mRNA normalisert til GAPDH
mRNA. ** P
< 0,05 vs. krafse siRNA-transfekterte celler stimulert med IL-1β. △△ P
< 0,05 vs. ikke-transfekterte celler stimulert med IL-1β. C: Gel zymografi viste at MMP2 og MMP9 aktiviteten ble oppregulert i begge AGS og MKN-45 cellene i respons til behandling med IL-1β; Dette ble blokkert av p38 siRNA eller p38 inhibitor SB202190. D: immunocytokjemisk farging og konfokal mikroskopi bekreftet at IL-1β økt aktivering av p38 (rødt), og MMP2 og MMP9 (grønn) ekspresjon i MKN-45 GA-celler; Disse effektene ble blokkert ved p38 siRNA eller p38-inhibitoren SB202190.
Immunocytochemistry og konfokal mikroskopi viste at p-p38 ble svakt uttrykt i ubehandlede MKN-45-celler, som også blir uttrykt meget lave nivåer av MMP2 og MMP9. Etter stimulering med IL-1β, betydelig økte nivåer av p-p38, ble MMP2 og MMP9 oppdaget i MKN-45 celler; disse IL-1β-induserte effekter ble hemmet av p38 siRNA og SB202190 (figur 2D). Samlet utgjør disse resultatene sterkeste at IL-1β gjennom p38-indusert invasjon og migrasjon av GA celler formidles via evnen til p-p38 å oppregulere MMP2 og MMP9 uttrykk og aktivitet.
IL-1β-indusert aktivering av p38 oppregulerer MMP2 og MMP9 ved aktivering av AP-1-avhengig transkripsjon i GA-celler
det er godt dokumentert at transkripsjonsfaktoren aktivator protein-1 (AP-1) kan regulere ekspresjonen av MMP2 og MMP9 [17], og aktivering av p38 er i stand til å regulere AP-1-aktivering [18]. For å undersøke hvorvidt IL-1β-indusert p38-mediert forhøyet MMP2 og MMP9 ekspresjon og aktivitet er avhengig av AP-1, ble aktivering av AP-1-avhengig transkripsjon undersøkt i GA-celler behandlet med eller uten IL-1β, i tilstedeværelse eller fravær av p38-hemming, ved hjelp av et AP-1 luciferase reporter-assay. IL-1β øket aktiviteten av AP-1 i begge GA cellelinjer (figur 3A); imidlertid, inhibering av p38 ved bruk av p38 siRNA eller forbehandlede celler med p38-inhibitor SB202129 redusert IL-1β-indusert AP-1-aktivitet i begge GA cellelinjer (figur 3A). Disse resultatene indikerer at IL-1β indusert, p38 mediert ekspresjon av MMP2 og MMP9 er avhengig av AP-1. Figur 3 IL-1β aktiverer AP-1 aktivitet gjennom p38 veien. A: Begge GA celler ble transfektert med AP-en reporter plasmid eller AP-en reporter plasmid sammen med krafse siRNA eller p38 siRNA. AP-1 luciferasereportergenet aktivitet var signifikant økt med IL-1β stimulering i begge AGS og MKN-45 celler; Disse effektene ble signifikant hemmet av p38-siRNA på en doseavhengig måte og også hemmet av p38-inhibitor SB202190. ** P
< 0,05 vs. kontroll siRNA (rykke siRNA) + AP-1 Luc-transfektert celler stimulert med IL-1β; ΔΔP
< 0,05 vs. AP-1 luc-transfekterte celler stimulert med IL-1β; relativ luciferaseaktivitet ble normalisert til B-gal. B: IL-1β-indusert p38-mediert aktivering av MMP9
promotorer er avhengig av AP-1-bindingssteder. ** P
< 0,05 vs. transfektert -670 /MMP9 + kontroll siRNA celler stimulert med IL-1β; ΔΔP
< 0,05 vs. transfektert -670 /MMP9 celler stimulert med IL-1β; ▼▼ P
< 0,05 vs. transfektert -570 /MMP9 celler stimulert med IL-1β; relativ luciferaseaktivitet ble normalisert til B-gal.
For ytterligere å bekrefte rollen til AP-1 i IL-1β-indusert p38 vei, luciferasereportergenet Vektorer som inneholder AP-1 områder av MMP9
promoteren regioner ble transfektert inn i GA celler. I samsvar med AP-1 reporter genet analyser, luciferase aktiviteter -670 /MMP9
promoter-regionen (som inneholder to AP-en bindingsseter [-533 og -79] og en NF-КB bindende språk [-600 ] [19-21]) en signifikant økning i IL-1β-stimulerte celler (figur 3B). Transfeksjon av cellene med p38 siRNA eller forbehandlede celler med p38-inhibitor SB202129 redusert IL-1β-indusert luciferase aktiviteten til -670 /MMP9
promoter reporter-gen (figur 3B). Luciferaseaktiviteten av MMP9
promoter (-571 /MMP9
) ble ikke endret ved sletting av NFkB-bindingssetet (-600). Videre, når det AP-1 steder (-79 og -533) av MMP9
promotoren ble slettet (-73 /MMP9
mutanter), luciferaseaktiviteten av reportergenet betydelig redusert, sammenlignet med de respektive vill -type kontrollrapportørgener (figur 3b). Sammen er disse data indikerer sterkt at IL-1β induserer aktivering av p38 signalveien, som fremmer invasjon og migrering av GA-celler via AP-1-avhengig oppregulering av MMP2 og MMP9 ekspresjon og aktivitet.
Knockdown av MMP2 eller MMP9 reduserer IL-1β-indusert migrasjon og invasjon i GA celler
for ytterligere å bekrefte at IL-1β-indusert GA celle migrasjon og invasjon er forbundet med oppregulering av MMP2 og MMP9, AGS og MKN-45 celler ble transfektert med sirnas mot MMP2
eller MMP9
, eller forbehandlet med eller uten MMP2 /MMP9 inhibitor BIP, og deretter stimulert med IL-1β. Transwell migrasjon og invasjons analyser viste at IL-1β-indusert migrering og invasjon av GA-celler ble betydelig svekket ved knockdown av MMP2
eller MMP9, etter eller før behandling med Bips, sammenlignet med kontroll-celler (figur 4A til C). Derfor oppregulering av MMP2 og MMP9 er avgjørende for IL-1β-indusert GA celle migrasjon og invasjon. Figur 4 knockdown av MMP2 eller MMP9 eller forbehandling med MMP2 /9-hemmer BIP hemmer IL-1β-indusert GA celle migrasjon og invasjon in vitro. A: RT-PCR bekreftet effektiviteten av MMP2 eller MMP9 sirnas, som i betydelig grad redusert MMP2
eller MMP9
uttrykk, henholdsvis med opp til mer enn 75%. B: IL-1β økt GA celle migrasjon og invasjon in vitro; disse effektene ble hemmet av MMP2 eller MMP9 siRNA eller MMP2 /9 inhibitor BIP. ** P
< 0,05 vs. rykke siRNA (kontroll siRNA) -transfected celler stimulert med IL-1β. Barer er middelverdien ± SD fold endringer normalisert til å kontrollere gruppen i migrasjons- og invasjons analyser. C: Representative lys mikroskopi bilder av AGS og MKN-45 celle migrasjon og invasjon i Transwell migrasjon og invasjon analyser
IL-1β-indusert aktivering av JNK deltar ikke i reguleringen av GA celle migrasjon og invasjon
. det er velkjent at medlemmer av MAPK spiller viktige roller i regulering av cellulære responser på cytokiner og stress, og P38 og JNK er de viktigste MAPK familiemedlemmene som regulerer IL-1β signalveier. For å forstå hvorvidt JNK er også assosiert med IL-1β-indusert GA celle migrering og invasjon, ble Western blot-analyse utført for å detektere aktivering av JNK i respons til IL-1β. Som vist i figur 5A, ble p-JNK detektert i både AGS og MNK-45 cellelinjer etter stimulering med IL-1β i 30 min. Men resultatene fra begge Transwell migrasjon og invasjons analyser viste at den økede migrering og invasjon av både AGS og MKN-45 celler indusert ved hjelp av IL-1β stimulering ikke ble svekket ved knockdown JNK med siRNA eller dempes ved å hemme JNK-reaksjonsveien med JNK-inhibitor SP600125 ingen (figur 5B til D); Antallet migrerte celler og invasive nesten ikke viste endring før eller etter transfeksjon med siRNA mot JNK (P > 0,05), eller med eller uten forbehandling med JNK-inhibitor SP600125 (P 0,05). JNK var ikke forbundet med IL-1β-fremmet GA cellemigrering og invasjon etter å ha blitt ytterligere bekreftet av AP-1 luciferase reporter-assay. Etter hvert som oppstrøms kinase av c-Jun (en annen viktig komponent av AP-1), er JNK stand til å aktivere AP-1, og aktivering av AP-1 av JNK er nært beslektet med JNK-funksjon på regulering av en rekke cellereaksjoner inkludert cancer celle migrasjon og invasjon [22]; imidlertid, IL-1β-indusert AP-1-aktivering i både AGS og MKN-45-celler ble ikke hemmet av JNK siRNA eller JNK inhibitor SP600125 verken (figur 5E). Alle sammen, disse dataene indikerer sterkt at den økte GA migrasjon og invasjon fremmet av IL-1β ikke er regulert av JNK. Figur 5 Aktiveringen av JNK ikke er assosiert med IL-1β-indusert GA celle migrering og invasjon. A: p-JNK ble påvist ved 30 min stimulering med IL-1β i AGS og MKN-45 cellelinjer. B: Transfeksjon av JNK siRNA slått ned JNK uttrykk i begge de to GA cellelinjer. C-D: Behandling av GA-celler med IL-1β øket cellemigrering og invasjon in vitro; Disse virkninger ble ikke inhibert av JNK siRNA eller JNK-reaksjonsveien inhibitor SP600125. ** P
< 0,05 vs. krafse siRNA-transfekterte celler stimulert med IL-1β; △△ P
< 0,05 vs. ikke-transfekterte celler (villtype celler) stimulert med IL-1β; ## Eller ●● ingen signifikant forskjellig mellom disse to gruppene ble oppdaget (P
> 0,05). Barer indikerte gjennomsnitt ± SD antall celler per synsfelt i migrasjon og invasjon analyser. D: Representative lys mikroskop bilder av AGS og MKN-45 celle migrasjon og invasjon i Transwell analyser. E: Begge GA celler ble transfektert med AP-en reporter plasmid eller AP-en reporter plasmid sammen med krafse siRNA eller JNK siRNA. AP-1 luciferasereportergenet aktivitet var signifikant økt med IL-1β stimulering i begge AGS og MKN-45 celler; Disse virkninger ble ikke inhibert av JNK siRNA og heller ikke inhibert av JNK-inhibitor SP600125 verken. ** P
< 0,05 vs. kontroll siRNA (rykke siRNA) + AP-1 Luc-transfektert celler stimulert med IL-1β; ΔΔP
< 0,05 vs. AP-1 luc-transfekterte celler stimulert med IL-1β; ## Eller ●● ingen signifikant forskjellig mellom disse to gruppene ble oppdaget (P
> 0,05). Relativ luciferase aktiviteten ble normalisert til B-gal.
Phospho-p38 er oppregulert og korrelerer med uttrykk for IL-1β, MMP2, MMP9 og c-fos i menneske GA vev
uttrykk for p-p38 i en serie 105 GA vev og sammenkoblede røyk neoplastiske mage vev ble undersøkt ved immunhistokjemi (IHC). Av de 105 kreftprøver, 53 tilfeller av GA vev (50.48%) viste overekspresjon av p-p38 i forhold til de sammenkoblede røyk neoplastiske mage vev (P
< 0,05, figur 6A). Positive p-p38 uttrykk ble hyppig observert i både GA cellen cytoplasma og cellekjernen. Figur 6 Fosforylert p38 er overuttrykt i human GA, og ekspresjon av p-p38 positivt korrelerer med IL-1β, MMP2, MMP9 og c-fos ekspresjonen i GA vev. A: Overekspresjon av p-p38 ble hyppig observert i GA vev, sammenlignet med de sammenkoblede ikke-neoplastiske gastrisk vev. en, ble P-p38 ikke registrert eller bare svakt uttrykt i ikke-neoplastiske mage vev. b til e: forskjellige intensiteter av positive p-p38 uttrykk i GA vev. B: Uttrykk for p-p38 positivt korrelert med IL-1β, MMP2, MMP9, og c-fos uttrykk i menneskelige GA vev. GA vevsprøve stiller sterkere IL-1β uttrykk og sterkere p-p38, MMP2, MMP9 og c-fos uttrykk; og svakere IL-1β uttrykk og svake p-p38, MMP2, MMP9 og c-fos uttrykk. C: Summen score til positiv fargeintensitet av IHC for p-p38. ** P
< . 0,05 vs. paret ikke-neoplastiske mage vev
Ingen signifikante assosiasjoner ble observert mellom overekspresjon av p-p38 i pasientenes alder (< 50 eller ≥ 50 år), kjønn, tumorstørrelse (< 3 cm eller ≥ 3 cm), histologisk type eller grad av differensiering. Imidlertid overekspresjon av p-p38 vises signifikant relatert med lymfeknutemetastaser (P
< 0,05), og invasjon utover serosa (P
< 0,05). Disse data antyder at overekspresjon av p-p38 er forbundet med metastase i human GA.
Som vist på figur 6B, er ekspresjon av p-p38 viste god correlativity med nivåene av IL-1β, MMP2, MMP9 og AP-1 (c-fos) i GA vev, og en signifikant sammenheng mellom forhøyet p-p38 uttrykk og oppregulering av IL-1β, MMP2, MMP9 og c-fos i GA vev (r = 0,72, p < 0,01; r = 0,63, p < 0,01; r = 0,58, p < 0,05 og r = 0,69, p < 0,01) ble oppdaget ved analyse ved Spearman metode
summen score til positiv fargeintensitet av IHC for p-p38 i begge 105 tilfeller av GA. vev og sammenkoblede ikke-neoplastiske gastrisk vev ble vist i figur 6C.
Invasion assay i nakne mus
MKN-45-celler transfektert med en kodet siRNA eller p38 siRNA ble injisert i halevenen til BALB /c nu /nu mus; IL-1β eller PBS ble også injisert intraperitonealt fra dag til cellene ble injisert i 14 dager. Gruppe 1 ble injisert med PBS og egge siRNA-transfektert MKN-45 celler; gruppe 2 ble injisert med IL-1β og egge siRNA-transfektert MKN-45 celler; og gruppe 3 ble injisert med p38 siRNA-transfekterte MKN-45 celler og IL-1β
På 45 dager etter injeksjon cellene, alle dyr. (6/6; 100%) i IL-1β-behandlede gruppen hadde utviklet lungemetastaser (Figur 7A til D) (gruppe 2; gjennomsnitt av metastaser i seks av lunge seksjoner var 14 per lunge). I motsetning til dette hadde færre dyr (2 /6,33.33%) i kontrollgruppen som ikke ble injisert med IL-1β utviklet lungemetastaser (gruppe 1; gjennomsnitt av 6 metastaser i 6 av lungeseksjoner per lunge). Mens bare to dyr i p38 siRNA pluss IL-β-behandlede gruppen utviklet lungemetastaser og antallet lungemetastaser i denne gruppen var signifikant lavere (gruppe 3, gjennomsnittlig fra 4 metastaser i 6 av lungeseksjoner per lunge) og betydelig mindre enn den for den tilsvarende gruppen behandlet med IL-1β (gruppe 2) (figur 7A til D). Figur 7 IL-1β stimulering øker metastatisk potensial av GA-celler in vivo via en p38-avhengig mekanisme. A: Representative lungemetastaser dannet i annen gruppe mus. B: Bars indikerte antallet dyr som utviklet lungemetastaser. C: Representative resultater av HE farging av lungemetastaser. D: Barer indikerte gjennomsnitt ± SD antall metastaser i seks av lunge seksjoner /per lunge hos mus som hadde utviklet lungemetastaser. △△ P
< 0,05 vs. injisert med krafse siRNA transfekterte celler pluss IL-1β stimulering. E: RT-PCR analyse av p38, MMP2, MMP9 Hotell og c-fos
mRNA uttrykk i lungemetastaser av forskjellige mus. F: IHC analyse av p-p38, MMP2, MMP9 og c-fos protein uttrykk i lungemetastaser; IL-1β indusert forhøyet p-p38, MMP2, MMP9 og c-fos protein uttrykk.
For ytterligere å bekrefte om p38, MMP2 og MMP9 er involvert i IL-1β-indusert lungemetastase av GA celler, og finne ut om denne prosessen reguleres av AP-1, de mRNA uttrykk nivåer av p38, MMP2, MMP9 Hotell og c-fos
(en viktig del av AP-1) i metastatisk lunge ble kvantifisert ved RT-PCR, og p-p38 , MMP2, MMP9 og c-fos protein uttrykk i lunge seksjoner ble undersøkt ved hjelp av IHC. Som vist i figur 7 E og F, ble uttrykket nivåer av p-p38, MMP2, MMP9 og c-fos i lungemetastatiske foci forhøyet i respons til IL-1β. Aktivering av p38 og den mRNA eller proteinet uttrykket nivåer av p38, MMP2, MMP9 og c-fos var lavere i de metastaser som dannes av celler transfektert med p38 siRNA plus IL-β-behandlede gruppe (gruppe 3) eller i kontrollgruppen (gruppe 1- ) sammenlignet med metastaser som dannes ved krafse siRNA plus IL-β-behandlede gruppe (gruppe 2) (figur 7E og F). Til sammen in vivo data ytterligere bekrefter at IL-1β-indusert GA celle metastase medieres av p38 signal via AP-1 avhengig oppregulering av MMP2 og MMP9.
Diskusjon, En rekke studier har antydet at IL- 1β er i stand til å aktivere p38 og JNK [11, 12], og p38 og JNK spiller viktige roller i kreftcellemigrering og invasjon [14, 23-26]. Derfor hypotese vi at IL-1β kan bidra til GA celle invasjon og metastase via aktivering av p38 og JNK-reaksjonsveiene. For å undersøke denne muligheten, vurdert vi evnen til IL-1β å aktivere p38 og JNK, og fremme migrasjon og invasjon av GA celler. Våre resultater viste at IL-1β kunne aktivere både p38 og JNK, og øke GA cellemigrering og invasjon, og at disse effektene kan bli inhibert av p38 siRNA eller p38-inhibitoren SB 202190, men ikke JNK siRNA eller JNK inhibitor SP600125. Dette er den første demonstrasjon på at IL-1β kan indusere GA cellemigrering og invasjon via aktivering av p38; Men de underliggende molekylære mekanismer som IL-β-mediert p38-signalering blir regulert i løpet av gastrisk karsinogenese forblir stort sett ukjent.
En mulig mekanisme ved hvilken p38 kan øke invasjon og migrering av kreftceller ved å heve nivåene av MMP [ ,,,0],27]. Det er godt etablert at sekresjon av MMP'er med kapasitet for ekstracellulære matriks (ECM) nedbrytning er en funksjon av metastatiske kreftceller [28]. MMP2 og MMP9 er to av de mest godt karakterisert MMP og er nært forbundet med kreft invasjon og metastase grunn av sin sterke proteolytisk aktivitet av ECM [29]. Vi rapporterer også her for første gang at den sannsynlige molekylære mekanismen som IL-1β fremmer GA cellemigrering og invasjon kan involvere IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & MMP9 signalveien. Vi har vist at både MMP2 og MMP9 ble oppregulert i GA-celler i respons til IL-1β stimulering; disse effektene ble hemmet av sirnas mot p38, MMP2
eller MMP9
, p38 inhibitor SB202190, og MMP2 /9 inhibitor BIP. Videre knockdown av MMP2
eller MMP9
bruker sirnas, eller hemming av MMP2 /9 aktivitet ved hjelp av BIP, betydelig redusert IL-1β-indusert GA celle migrasjon og invasjon. Som en serin /treonin proteinkinase, er p38 stand til å indusere aktivering av transkripsjonsfaktor AP-1 [30]. Vi har videre funnet at IL-1β-indusert, p38-mediert oppregulering av MMP2 og MMP9 ble AP-1-avhengig. IL-1β var bare i stand til å aktivere transkripsjon av MMP9
promoter regioner som inneholder AP-1 steder, og disse effektene ble svekket av p38 siRNA og p38 inhibitor SB202190. I tillegg har IL-1β-indusert aktivering av AP-1-avhengig transkripsjon ble hemmet av p38-siRNA.
Phospho-p38 (p-p38), den aktiverte form av p38, kunne påvises i nesten 50% av den menneskelige GA vevsprøver testet av IHC-analyse, og ekspresjon av p-p38 var signifikant assosiert med lymfeknutemetastase, invasjon og utover serosa i pasienter med GA. Videre er ekspresjon av IL-1 p positivt korrelert med ekspresjonen av p-p38, MMP2, MMP9 og c-fos i de kliniske prøvene GA. Videre er in vivo-data fra den metastase-analysen viste at dannelsen av lungemetastaser av GA-celler, og p38 /
p-p38, MMP2, MMP9 og c-fos mRNA og protein ekspresjon i lungemetastatiske foci ble forhøyet etter IL-1β, og redusert ved injeksjon av celler transfektert med p38 siRNA. Samlet utgjør disse dataene sterkt at IL-1β-indusert GA celle migrasjon og invasjon skje via aktivering av p38 signalveien som fører til AP-en aktivering og oppregulering av MMP2 og MMP9. Derfor spiller p38 en viktig rolle i IL-1β-indusert metastase i GA.
JNK er en annen viktig MAPK å være godt kjent for å spille en viktig rolle i regulering av IL-1β signalering i flere forskjellige celler [14, 31]. Men i denne studien, ble JNK funnet å være ikke er involvert i regulering av IL-1β-indusert GA celle migrering og invasjon. JNK siRNA og JNK-inhibitor ikke dempe IL-1β indusert GA cellemigrering og invasjon, og heller ikke dempe aktivering av AP-1 indusert av IL-1β. Derfor IL-1β-forfremmet GA celle migrasjon og invasjon er regulert av p38, men ikke av JNK.
Oppsummert vi har identifisert for første gang at IL-1β er funksjonelt involvert i reguleringen av metastaser i GA via aktivering av p38. Dette molekylære mekanismen involverer p38-mediert AP-1-avhengig oppregulering av både MMP2 og MMP9; og denne studien sterkt tyder på at IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Gastroparesis forbundet med Gastroptose presentere som en nedre mage bulking masse i et barn: en kasuistikk
• Påvirkning av IL17A polymorfismer på avvikende metylering av DAPK og CDH1 i ikke-kreft mageslimhinnen