IL-induzido-1β activação de p38 promove a metástase no adenocarcinoma gástrico através de regulação positiva de AP-1 /C-fos, MMP2 e MMP9

activação de p38 promove a metástase no adenocarcinoma gástrico através de regulação positiva de AP-1 /C-fos IL-induzido-1β , MMP2 e MMP9
Resumo
fundo
Interleucina-1β (IL-1β) tem sido implicado na progressão do adenocarcinoma gástrico (GA); No entanto, os mecanismos moleculares da acção da IL-1β em GA são mal caracterizadas. P38 e JNK são os principais membros da família de MAPK que regulam a IL-1β vias de sinalização. Aqui, nós investigamos o papel de p38 e JNK na migração de células GA induzida por IL-1β, invasão e potencial metastático.
Métodos
Os efeitos de p38 induzida por IL-1β e activação de JNK em células GA foram determinados usando in vitro Transwell migração e invasão ensaios de células MKN-45 e AGS, ou um ensaio in vivo de metástase em em ratinhos nus. A via de sinalização de p38 induzida por IL-1β foi adicionalmente caracterizado por as células de GA. A activação da via de sinalização de IL-1β /p38 também foi avaliada em tecidos GA primários humanos por imuno-histoquímica.

Resultados da activação induzida por IL-1β de p38 aumento da migração de células de GA e invasão in vitro e promovida a potencial metastático de células GA in vivo; estes efeitos foram atenuados pelo siARN p38 ou o SB202190 inibidor de p38. MMP2 MMP9 ou ARNic e o inibidor de MMP2 /9 SIN também inibiram a migração de células GA induzida por IL-1β e invasão in vitro. activação p38 IL-induzida-1β aumentou significativamente MMP2 e MMP9 mRNA e expressão de proteínas e atividade. Os ensaios de repórter de luciferase demonstrado que a proteína-1 do activador (PA-1) e os sítios de ligação de AP-1 da MMP9
promotor (-670 /MMP9) foram activadas por activação de p38 induzida por IL-1β. Fosfo-p38 foi significativamente regulada positivamente em tecidos humanos GA (em comparação com tecidos não neoplásicas combinados), e significativamente associada com metástases em linfonodos e invasão além da serosa. A expressão de fosfo-p38 significativamente correlacionada com a IL-1β, MMP2, MMP9, e a expressão de c-fos em ambos os tecidos humanos GA e GA metástases de células nos pulmões de ratinhos nus. IL-1β também foi capaz de activar de JNK em células GA, mas a activação de JNK não foi associado com a migração celular e invasão GA. Portanto, a IL-1β-induziu a migração e invasão em células GA foram regulados por p38, mas não por JNK.
Conclusões de Il-1β induzida por activação de p38 e IL-1β /p38 /AP-1 ( c-fos) /MMP2 & via MMP9 desempenhar um papel importante na metástase no GA; esta via pode fornecer um novo alvo terapêutico para GA.
Palavras-chave
IL-1β p38 gástrica adenocarcinoma MMP2 e MMP9 AP-1 Metástase fundo
Crescentes evidências indicam que os tumores são promovidos e sustentados por sinais inflamatórios do tumor microambiente, e o microambiente do tumor desempenha um papel importante na promoção de cancro [1, 2]. As citocinas, especialmente as citocinas secretadas por células tumorais, são componentes essenciais do microambiente do tumor. factor de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-1β (IL-β) e IL-6 são os mais citocinas bem caracterizadas que se demonstrou estar estreitamente relacionado com a progressão do cancro. Um grande número de estudos têm demonstrado que a inflamação induzida por citocinas desempenham um papel importante no desenvolvimento do cancro gástrico [3]. Está bem estabelecido que as infecções, especialmente as provocadas por Helicobacter pylori,
são capazes de induzir respostas inflamatórias da mucosa gástrica, resultando em sobre-regulação de IL-1β, que por sua vez podem promover a carcinogénese associada à inflamação [4]. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes para o papel da sinalização de IL-1β na carcinogênese gástrica permanecem largamente desconhecidos, e são atualmente de interesse.
P38 é um membro da MAP quinase (MAPK) superfamília. As vias de sinalização MAPK têm sido bem investigadas e são constituídas por, pelo menos, três superfamílias de MAPKs que regulam diversas actividades celulares [5]. É bem conhecido que a p38 MAPK é capaz de regular um grande número de respostas celulares a citocinas e stress, incluindo IL-1β [6]; No entanto, dados recentes demonstraram que a p38 está também intimamente relacionada com o desenvolvimento de diferentes tipos de cancro humano através da sua capacidade de elevar a migração de células de cancro e invasão em resposta a vários estímulos, incluindo factores inflamatórios [6]. Além disso, a p38 também está envolvido na regulação da diferenciação celular e apoptose. Quatro isoformas de p38 foram identificados até agora: p38-α, p38-β, p38-γ, e p38-δ [7]. Embora as sequências de aminoácidos de p38 MAPK estas são na sua maioria idêntico, o padrão de expressão de cada isoforma varia [8]. P38-α é o principal p38 MAPK e é expressa ubiquamente, p38-β é expressa predominantemente no cérebro, ao passo que p38γ é expressa abundantemente no músculo esquelético [9] e p38-δ é expresso principalmente nas glândulas endócrinas [10]. Muitos estudos demonstraram também que a p38 participam nas cascatas de sinalização de IL-1 num conjunto de tipos de células, especialmente em fibroblastos de rato embrionário (MEF) e macrófagos células [11, 12]; No entanto, muito pouco se sabe sobre a função de p38 de IL-1β-activados em cancro gástrico.
quinase c-Jun N-terminal (JNK) é outro membro da família de MAPK que também é bem conhecida por desempenhar um papel importante na regulação via de sinalização de IL-1β [13]. Além disso a via de participação no regulamento sinal inflamatório, JNK desempenha várias outras funções celulares importantes incluindo a regulação do crescimento celular, diferenciação, a sobrevivência e a apoptose. Além disso, estudos recentes demonstram que JNK é frequentemente sobre-expressos em diferentes tecidos de câncer, e up-regulação da JNK podem estar intimamente associado com a invasão de câncer [14]; No entanto, se a JNK participa na regulação da migração de células de cancro gástrico induzida por IL-1β e invasão permanece largamente desconhecido
adenocarcinoma gástrico (GA) é a neoplasia mais comum do estômago.; Portanto, focada em GA neste estudo. Aqui, nós investigamos a activação de p38 e JNK em resposta a IL-1β, e o seu efeito na produção de IL-1β induzida pelo potencial metastático das células GA in vitro ou in vivo.
Além disso, a expressão de fosfo-p38 (P- p38) em GA, a sua relação com as características clinicopatológicas de GA, e a correlação entre a expressão de IL-1β e p-p38 foram investigados em tecidos embebidos em parafina GA humanos usando imuno-histoquímica. Finalmente, também caracterizados os mecanismos moleculares que regulam o potencial metastático mediada por p38 induzida por IL-1β de células GA.

Resultados da ativação de p38 promove a migração de células GA e invasão in vitro primeiro, nós investigamos se IL-1β foi capaz de ativar a sinalização p38 em células GA. Como mostrado na Figura 1, a activação de p38 (p-p38) foi detectada em ambas as linhas celulares GA (AGS e MKN-45 células) após tratamento com IL-1β durante 30 min; activação de p38 de IL-induzido-1β foi inibida pelo inibidor de SB202190 p38 (Figura 1A). Figura 1 IL-1β promove a migração de células GA e invasão através da activação p38. A: Western blot confirmou que a P-p38 poderia ser induzida por 30 minutos de estimulação com IL-1β em AGS e linhas celulares MKN-45; a activação de p38 por IL-1β foi inibida pelo inibidor da p38 SB202190. B: Transfecção de siRNA p38 derrubado expressão de p38 em ambas as duas linhas de células de GA. C-F: O tratamento de células com IL-GA 1β aumento da migração celular e invasão in vitro; estes efeitos foram inibidas por siARN p38 ou o inibidor da via do p38 SB202190. ** P Art < 0,05 versus precipitação siARN (siARN de controlo) -transfected células estimuladas com IL-1β; △△ P Art < 0,05 vs. células não transfectadas (células tipo selvagem) estimuladas com IL-1β. As barras indicam a média ± DP do número de células por campo de visão (400x de aumento) nos ensaios de migração e invasão. L:. Imagens de microscopia de luz representativos de AGS e migração de células MKN-45 e invasão nos ensaios Transwell
P38 pode promover a migração e a invasão de células cancerígenas diferentes [15]. Para investigar se a IL-1β podem promover a migração e a invasão de células GA através de activação de sinalização de p38, células GA transfectadas com um ARNsi (ARNsi de controlo) mexidos ou siRNA p38, ou células GA pré-tratadas com ou sem SB202190 inibidor da via do p38 eram estimuladas com IL-1β. Os ensaios de migração e invasão Transwell demonstrado que a estimulação IL-1β aumentou a migração e invasão de ambos os AGS e MKN-45 células; No entanto, a IL-1β induzida por migração celular e invasão GA foram significativamente atenuada por knockdown de p38 utilizando siRNA (Figura 1B a G) ou pré-tratamento com SB202190 (Figura 1C a G). Tomados em conjunto, estes dados sugerem fortemente que a IL-1β promovido a migração celular e invasão GA são mediados por p38.
IL-1β induzida por activação de p38 regula positivamente a expressão de MMP2 e MMP9 e actividade em células GA
MMP2 e MMP9 têm foi demonstrado que desempenham papéis importantes na invasão de células de cancro e metástase [16]. Para explorar a possibilidade de MMP2 e MMP9 também participar no potencial metastático regulado por p38 induzida por IL-1β de células GA, RT-PCR, imunocitoquímica e microscopia confocal, e o ensaio de zimografia foram realizados para determinar a MMP2 e MMP9 expressão e actividade em GA as linhas celulares transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi p38, ou pré-tratadas com ou sem o inibidor de p38 SB202190, e, em seguida, tratadas com ou sem IL-1β. Como esperado, MMP2 e MMP9 expressão e actividade foram elevados em resposta a tratamento com IL-1β (Figura 2A a C). Knockdown de p38 utilizando ARNsi, ou pré-tratamento com o inibidor de p38 SB202190 diminuiu significativamente MMP2 induzida por IL-1β e a expressão de ARNm de MMP9 e actividade em ambas as linhas de células de GA (Figura 2A a C). Figura 2 IL-1β regula positivamente MMP2 e MMP9 expressão e da atividade ativando p38. A: análise de RT-PCR mostrou que a MMP2 e MMP9

ARNm foram regulados positivamente nas duas AGS e MKN-45 células em resposta ao tratamento com IL-1β; este efeito foi bloqueado por siRNA p38 ou o SB202190 inibidor de p38. B: Quantificação da expressão de MMP2 e MMP9

ARNm normalizadas para GAPDH mRNA
. ** P Art < 0,05 versus células transfectadas com ARNsi de encriptação estimuladas com IL-1β. △△ P Art < 0,05 versus células não transfectadas estimuladas com IL-1β. C: Gel de zimografia mostrou que a actividade de MMP2 e MMP9 foram regulados positivamente nas duas AGS e MKN-45 células em resposta ao tratamento com IL-1β; este efeito foi bloqueado por siRNA p38 ou o SB202190 inibidor de p38. D: coloração imunocitoquímica e microscopia confocal confirmou que a IL-1β de activação de p38 (vermelho) aumentada, e MMP2 e MMP9 expressão (verde) em células MKN-45 GA; estes efeitos foram bloqueados pelo siARN p38 ou o SB202190 inibidor de p38.
imunocitoquímica e microscopia confocal demonstram que p-p38 foi fracamente expresso em células não tratadas MKN-45, que também expressaram níveis muito baixos de MMP2 e de MMP9. Depois de estimulação com IL-1β, aumentou significativamente os níveis de p-p38, MMP2 e MMP9 foram detectados nas células MKN-45; estes efeitos induzidos pela IL-1β foram inibidas por p38 siRNA e SB202190 (Figura 2D). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem fortemente que a IL-1β através da invasão induzida por p38 e migração de células GA é mediada através da capacidade de p-p38 para regular positivamente de MMP2 e MMP9 de expressão e actividade.
Activação induzida por IL-1β de p38 regula positivamente de MMP2 e MMP9 de activação de transcrição AP-1-dependente em células GA
está bem documentado que o factor de transcrição do activador de proteína 1 (AP-1) pode regular a expressão de MMP2 e MMP9 [17], e a activação de p38 é capaz de regular a activação de AP-1 [18]. A fim de analisar se induzida por IL-1β elevada de MMP2 e MMP9 de expressão e a actividade mediada por p38 são dependentes de AP-1, a activação da transcrição AP-1-dependente foi investigada em células GA tratados com ou sem IL-1β, em a presença ou ausência de inibição de p38, utilizando um ensaio de repórter de luciferase de AP-1. IL-1β aumentou a actividade do AP-1 em linhas celulares de GA (Figura 3A); No entanto, a inibição de p38 utilizando siRNA p38 ou células pré-tratadas com SB202129 inibidor de p38 reduzida induzida por IL-1β actividade de AP-1 em linhas celulares de GA (Figura 3A). Estes resultados indicam que a IL-1β induzida, a expressão de p38 mediada de MMP2 e MMP9 são dependentes de AP-1. Figura 3 IL-1β ativa AP-1 atividade por meio de via p38. A: Ambas as células GA foram transfectadas com AP-1 plasmídeo repórter ou AP-1 plasmídeo repórter em conjunto com precipitação siRNA ou p38 siRNA. AP-1 actividade do gene repórter da luciferase foi significativamente aumentada através da estimulação de IL-1β em ambos os AGS e MKN-45 células; estes efeitos foram significativamente inibidas por siARN de p38 de um modo dependente da dose, e também inibido pelo inibidor de p38 SB202190. ** P Art < 0,05 vs. controlo siARN (siARN precipitação) + AP-1 de células transfectadas-luc estimuladas com IL-1β; ΔΔP Art < 0,05 vs. AP-1 de células transfectadas-luc estimuladas com IL-1β; a actividade de luciferase relativa foi normalizada para B-gal. B: a activação mediada por p38 induzida por IL-1β da MMP9
promotores é dependente dos sítios AP-1 de ligação. ** P Art < 0,05 vs. transfectadas -670 /+ de controlo MMP9 células siRNA estimuladas com IL-1β; ΔΔP Art < 0,05 vs. transfectadas -670 células /MMP9 estimuladas com IL-1β; ▼▼ P Art < 0,05 vs. transfectadas -570 células /MMP9 estimuladas com IL-1β; a actividade de luciferase relativa foi normalizada para B-gal.
A fim de confirmar adicionalmente o papel do AP-1 na via de p38 induzida por IL-1β, vectores de genes repórter luciferase contendo os sítios AP-1 da MMP9
promotor regiões foram transf ectados para as células de GA. De acordo com os ensaios de gene repórter AP-1, as actividades da luciferase de região promotora -670 /MMP9
(contendo dois sítios de ligação de AP-1 [-533 e -79] e um local de ligação de NF-КB [-600 ] [19-21]) aumentou significativamente em células estimuladas com IL-1β (Figura 3B). A transfecção das células com ARNsi de p38 ou células pré-tratadas com SB202129 inibidor de p38 reduziu a actividade de luciferase induzida por IL-1β do -670 /MMP9
gene repórter promotor (Figura 3B). A actividade da luciferase da MMP9
promotor (-571 /MMP9
) não foi alterada pela supressão do sítio de ligação de NFkB (-600). Além disso, quando os sítios AP-1 (-79 e -533) do promotor de MMP9
foram suprimidos (-73 /MMP9
mutantes), a actividade de luciferase do gene repórter significativamente diminuída, em comparação com o respectivo selvagem -tipo genes repórter de controlo (Figura 3B). Colectivamente, estes dados indicam fortemente que a IL-1β induz a activação da via de sinalização de p38, o que promove a invasão e a migração de células através de regulação positiva GA AP-1 dependente de MMP2 e MMP9 de expressão e actividade.
Knockdown de MMP2 ou MMP9 diminui a migração induzida por IL-1β e invasão em células GA
Para confirmar ainda que a migração de células GA-IL-1β induzida e invasão estão associados com a regulação positiva de MMP2 e MMP9, AGS e células MKN-45 foram transfectadas com ARNsi contra MMP2
ou MMP9
, ou pré-tratadas com ou sem o inibidor de MMP2 /MMP9 bips, e em seguida estimuladas com IL-1β. Os ensaios de migração e invasão Transwell demonstrou que a migração induzida por IL-1β-e invasão de células GA foram significativamente atenuada por knockdown de MMP2
ou MMP9,
ou pré-tratamento com PIF, em comparação com células de controlo (Figura 4A para C). Portanto, a regulação positiva de MMP2 e MMP9 são cruciais para a migração celular GA induzida por IL-1β e invasão. Figura 4 knockdown de MMP2 ou MMP9 ou pré-tratamento com o MMP2 /9 inibidor SIN inibe a migração celular GA induzida por IL-1β e invasão in vitro. A: RT-PCR confirmou a eficiência do MMP2 MMP9 ou ARNsi, o que reduziu significativamente a MMP2 MMP9

ou expressão, respectivamente, por cima de mais do que 75%. B: IL-1β aumentou a migração de células GA e invasão in vitro; estes efeitos foram inibidos por MMP2 ou MMP9 siRNA ou o inibidor de MMP2 /9 SIN. ** P Art < 0,05 vs. corrida siRNA (controle siRNA) células -transfected estimuladas com IL-1β. Barras representam a média ± DP vezes muda normalizados para o grupo de controlo nos ensaios de migração e invasão. C: imagens de microscopia de luz representativos de migração de células AGS e MKN-45 e invasão nos ensaios de migração e invasão Transwell
IL-1β induzida por ativação de JNK não participa na regulação da migração celular GA e invasão
. é bem conhecido que os membros da MAPK desempenham papéis importantes na regulação de respostas celulares a citocinas e estresse e p38 e JNK são os principais membros da família de MAPK que regulam a IL-1β vias de sinalização. Para compreender se a JNK é também associado com a migração de células GA induzida por IL-1β e invasão, a análise por Western blot foi realizada para detectar a activação de JNK em resposta à IL-1β. Como exibido na Figura 5A, p-JNK foi detectado em ambas as linhas celulares AGS e MNK-45 após a estimulação com IL-1β durante 30 min. No entanto, os resultados de ambos os ensaios de migração e invasão Transwell mostraram que o aumento da migração e invasão de ambos os AGS e MKN-45 células induzidas por estimulação de IL-1β não foram atenuadas por JNK knockdown com ARNsi nem atenuada por via JNK inibição com SP600125 inibidor de JNK nem (Figura 5B a D); O número de células que migraram e invasivos quase não mostraram alteração antes ou após a transfecção com ARNsi contra JNK (P > 0,05) ou com ou sem pré-tratamento com inibidor de JNK SP600125 (P > 0,05). JNK não foi associado com IL-1β-promoveu a migração celular e invasão GA tendo sido verificados adicionalmente por AP-1 ensaio de repórter de luciferase. À medida que a quinase a montante de c-Jun (outro componente importante de AP-1), a JNK é capaz de activar o AP-1, e a activação de AP-1 por JNK está estreitamente relacionado com a função da JNK na regulação de diversos reacção celular incluindo cancro migração celular e invasão [22]; No entanto, induzida por IL-1β AP-1 de activação em ambas as células AGS e MKN-45 não foi inibida por JNK siARN nem SP600125 nem inibidor da JNK (Figura 5E). Todos juntos, estes dados indicam fortemente que o aumento da migração GA e invasão promovida por IL-1β não são regulados pela JNK. A Figura 5 A activação de JNK não está associado com a migração de células GA induzida por IL-1β e invasão. A: p-JNK foi detectado por 30 minutos de estimulação com IL-1β em AGS e linhas celulares MKN-45. B: Transfecção de JNK siARN derrubado expressão de JNK em ambas as duas linhas de células de GA. C-D: O tratamento de células com IL-GA 1β aumento da migração celular e invasão in vitro; Estes efeitos não foram inibidas por JNK siARN SP600125 nem o inibidor da via de JNK. ** P Art < 0,05 células transfectadas com ARNsi contra embaralhamentos estimuladas com IL-1β; △△ P Art < 0,05 vs. células não transfectadas (células do tipo selvagem) estimuladas com IL-1β; ## Ou ●● nenhuma diferença significativa entre os dois grupos foi detectada (P Art > 0,05). Bares indicada a média ± SD número de células por campo de visão nos ensaios de migração e invasão. D: Imagens luz do microscópio representativos de AGS e migração celular MKN-45 e invasão nos ensaios Transwell. E: Ambas as células GA foram transfectadas com AP-1 plasmídeo repórter ou AP-1 plasmídeo repórter em conjunto com precipitação siRNA ou JNK siRNA. AP-1 actividade do gene repórter da luciferase foi significativamente aumentada através da estimulação de IL-1β em ambos os AGS e MKN-45 células; Estes efeitos não foram inibidas por JNK siARN nem inibida pelo inibidor de JNK SP600125 nem. ** P Art < 0,05 vs. controlo siARN (siARN precipitação) + AP-1 de células transfectadas-luc estimuladas com IL-1β; ΔΔP Art < 0,05 vs. AP-1 de células transfectadas-luc estimuladas com IL-1β; ## Ou ●● nenhuma diferença significativa entre os dois grupos foi detectada (P Art > 0,05). a actividade de luciferase relativa foi normalizada para B-gal.
fosfo-p38 é regulada positivamente e se correlaciona com a expressão de IL-1β, MMP2, MMP9 e c-fos em tecidos humanos GA
A expressão de p-p38 numa série de 105 GA tecidos e os tecidos gástricos não neoplásicas emparelhados foi examinada por imuno-histoquimica (IHC). Das amostras 105 do cancro, os 53 casos de tecidos GA (50,48%) exibiram sobre-expressão de P-p38 em comparação com os tecidos gástricos não neoplásicas emparelhado (P
< 0,05; Figura 6A). A expressão positiva p-p38 foi frequentemente observada no citoplasma da célula e do núcleo GA. Figura 6 p38 fosforilada é sobre-expresso em GA humana, e a expressão de p-p38 correlaciona-se positivamente com a IL-1β, MMP2, MMP9 e expressão de c-fos em tecidos GA. Um: A sobre-expressão de P-p38 foi frequentemente observada em tecidos GA, em comparação com os tecidos gástricos não neoplásicas emparelhados. A, P-p38 não foi detectada ou apenas fracamente expressa nos tecidos gástricos não neoplásicas. b para E: diferentes intensidades de expressão p-p38 positivo nos tecidos GA. B: Expressão de p-p38 positivamente correlacionada com a IL-1β, MMP2, MMP9, e a expressão de c-fos em tecidos humanos GA. amostra de tecido GA exibindo expressão forte de IL-1β mais forte e p-p38, MMP2, MMP9 e expressão de c-fos; e mais fraca expressão de IL-1β e fraco p-p38, MMP2, MMP9 e expressão de c-fos. C: A pontuação soma de intensidade de coloração positiva de IHC para p-p38. ** P Art < . 0,05 vs. emparelhado tecidos gástricos não-neoplásicas
Nenhuma associação significativa foi observada entre superexpressão de p-p38 na idade dos pacientes (< 50 ou ≥ 50 anos), sexo, tamanho do tumor (< 3 cm ou ≥ 3 cm), tipo histológico, ou grau de diferenciação. No entanto, a sobre-expressão de p-p38 exibido significativamente relacionada com metástase ganglionar (P Art < 0,05), ea invasão além da serosa (P Art < 0,05). Estes dados sugerem que a superexpressão da p-p38 está associada a metástases no GA humano.
Como exibido na Figura 6B, a expressão de p-p38 mostrou boa correlatividade com os níveis de IL-1β, MMP2, MMP9 e AP-1 (c-fos) em tecido GA, e uma correlação significativa entre a expressão elevada de p-p38 e supra-regulação de IL-1β, MMP2, MMP9 e c-fos no tecido GA (r = 0,72, p < 0,01; r = 0,63; p < 0,01; r = 0,58, p < 0,05 e r = 0,69, p < 0,01) foi detectado quando analisados ​​pelo método de Spearman
As pontuações soma de intensidade de coloração positiva de IHQ para p-p38 em ambos os 105 casos de GA. tecidos e tecidos gástricos neoplásicas não emparelhadas foram exibidas na Figura 6C.
ensaio de invasão em ratinhos nus
células MKN-45 transfectadas com um ARNsi ou p38 siARN mexidos foram injectados na veia da cauda de ratinhos Balb /c nu /nu ratos; IL-1β ou PBS foram também injectadas por via intraperitoneal a partir do dia das células foram injectados durante 14 dias. Grupo 1 foram injectados com PBS e mexidos células MKN-45 transfectadas com ARNsi; grupo 2 foram injectados com IL-1β e mexidos células MKN-45 transfectadas com ARNsi; e o grupo 3 foram injectados com p38 siRNA-transfectadas células MKN-45 e IL-1β
Aos 45 dias após a injecção das células, todos os animais. (6/6; 100%) no grupo tratado com IL-1β tinha desenvolvido metástases pulmonares (Figura 7a a D) (grupo 2; média de focos metastáticos em 6 de secções de pulmão era 14 por pulmão). Em contraste, menos animais (2 /6,33.33%) no grupo de controlo que não foram injectados com IL-1β desenvolveram metástases pulmonares (grupo 1; média de 6 metástases em 6 das secções de pulmão por pulmão). Considerando que, apenas dois animais do grupo de siRNA p38 mais IL-β tratados com desenvolveram metástases do pulmão e o número de metástases pulmonares neste grupo foi significativamente mais baixo (grupo 3, média de 4 metástases em 6 de secções de pulmão por pulmão) e significativamente menor do que a do correspondente grupo tratado com IL-1β (grupo 2) (Figura 7A a D). A Figura 7 a estimulação de IL-1β aumenta o potencial metastático de células GA in vivo através de um mecanismo dependente de p38. A: metástases pulmonares representativas formadas em diferentes rato grupo. B: Barras indicado o número de animais que desenvolveram metástases pulmonares. C: Os resultados representativos de HE coloração de metástases pulmonares. D: Bares indicada a média ± SD número de focos metastáticos em 6 de secções de pulmão /por pulmão em ratos que tinham desenvolvido metástases pulmonares. △△ P Art < 0,05 vs. injectados com células transfectadas disputa siRNA mais estimulação IL-1β. E: Análise de RT-PCR de p38, MMP2, MMP9
e c-fos
expressão de ARNm nas metástases pulmonares de ratinhos diferentes. análise IHC de p-p38, MMP2, MMP9 e expressão da proteína c-fos nas metástases pulmonares;: F IL-1β induzida elevada p-p38, MMP2, MMP9 e expressão da proteína de c-fos. Para confirmar ainda mais
se p38, MMP2 e MMP9 estão envolvidos em IL-1β induzida por metástases pulmonares de células GA, e determinar se este processo é regulada por AP-1, os níveis de p38, MMP2, MMP9
e c-fos
(um dos componentes chave de AP-1) no pulmão metastático foram quantificados por RT-PCR, e p-p38 de expressão de ARNm , MMP2, MMP9 e expressão da proteína c-fos em secções de pulmão foram examinadas utilizando IHC. Como mostrado na Figura 7, E e F, os níveis de p-p38, MMP2, MMP9 e c-fos nos focos metastáticos pulmonares de expressão foram elevados em resposta a IL-1β. A activação do p38 e do mRNA ou a expressão de proteínas níveis de p38, MMP2, MMP9 e c-fos foram menores nas metástases formadas pelas células transfectadas com ARNsi de p38 mais grupo-β tratados com IL (Grupo 3) ou no grupo de controlo (Grupo 1 ) em comparação com as metástases formadas por precipitação mais siARN grupo tratado com IL-β (grupo 2) (Figura 7E e F). Tomados em conjunto, os dados in vivo confirma ainda que a induzida por IL-1β metástase de células GA é mediado por via de sinalização de p38 AP-1 sobre-regulação dependente de MMP2 e de MMP9.
Discussão
Um número de estudos têm sugerido que a IL- 1β é capaz de activar a p38 e JNK [11, 12], e p38 e JNK, desempenham um papel importante na migração das células do cancro e invasão [14, 23-26]. Portanto, temos a hipótese de que a IL-1β podem contribuir para a invasão de células GA e metástases através de activação das vias de p38 e JNK. Para investigar esta possibilidade, foi avaliada a capacidade de IL-1β para ativar p38 e JNK, e promover a migração e invasão de células GA. Os nossos resultados mostraram que a IL-1β podia activar as p38 e JNK, e aumentar GA migração celular e invasão, e que esses efeitos podem ser inibidos por p38 siRNA ou o inibidor de p38 SB 202190, mas não de JNK ou siRNA SP600125 inibidor de JNK. Esta é a primeira demonstração de que a IL-1β pode induzir a migração celular e invasão GA através da activação de p38; No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes pelos quais a sinalização p38 IL-mediada por β é regulada durante a carcinogênese gástrica permanecem largamente desconhecidos.
um potencial mecanismo pelo qual p38 poderia aumentar a invasão e migração de células cancerosas está elevando os níveis de MMPs [ ,,,0],27]. Está bem estabelecido que a secreção de MMP, com a capacidade de degradação da matriz extracelular (ECM) é uma característica de células de cancro metastáticas [28]. MMP2 e MMP9 são duas das MMPs mais bem caracterizados e estão intimamente associados com invasão e metástase do cancro, devido à sua forte actividade proteolítica de ECM [29]. Relatamos aqui também pela primeira vez que o mecanismo molecular pelo qual provável IL-1β promove a migração celular e invasão GA pode envolver a IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & MMP9 via de sinalização. Foi demonstrado que tanto a MMP2 e MMP9 foram regulados positivamente em células GA em resposta ao estimulo com IL-1β; estes efeitos foram inibidas por ARNsi contra p38, MMP2 MMP9
ou
, SB202190 o inibidor de p38, e o inibidor de MMP2 /9 SIN. Além disso, knockdown de MMP2
ou MMP9
usando siRNAs, ou inibição da atividade MMP2 /9 usando SIN, diminuiu significativamente a migração de células GA induzida por IL-1β e invasão. Como uma proteína quinase serina /treonina, a p38 é capaz de induzir a activação do factor de transcrição AP-1 [30]. Descobrimos ainda que a sobre-regulação induzida por IL-1β, mediada por p38 de MMP2 e MMP9 eram AP-1-dependente. IL-1β só foi capaz de activar a transcrição de MMP9
regiões promotoras contendo locais AP-1, e estes efeitos foram atenuados pelo p38 siRNA ea SB202190 inibidor de p38. Além disso a activação, induzida por IL-1β de transcrição AP-1-dependente foi inibida por siARN p38.
fosfo-p38 (p38-P), a forma activada de p38, poderia ser detectado em quase 50% da GA humano amostras de tecido testados pelo ensaio IHC e expressão de p-p38 foi significativamente associada com metástases em linfonodos e invasão além da serosa em pacientes com GA. Além disso, a expressão de IL-1p positivamente correlacionada com a expressão de p-p38, MMP2, MMP9 e c-fos nos espécimes clínicos GA. Além disso, os dados in vivo a partir do ensaio de metástase demonstraram que a formação de focos metastáticos do pulmão de células GA, e p38 /Tablet p-p38, MMP2, MMP9 e o ARNm e proteína de expressão de c-fos nos focos metastáticos pulmonares foram elevados pela IL-1β, e reduzida pela injecção de células transfectadas com ARNsi de p38. Tomados em conjunto, estes dados sugerem fortemente que a induzida por IL-1β migração celular e invasão GA ocorrer através da activação da via de sinalização de p38 que conduz à activação de AP-1 e a regulação positiva de MMP2 e de MMP9. Portanto, a p38 desempenha um papel essencial na metástase induzida por IL-1β em GA.
JNK é uma outra MAPK importante a ser bem conhecido para desempenhar papéis importantes na regulação da sinalização de IL-1β em várias células diferentes [14, 31]. No entanto, neste estudo, a JNK foi encontrada para não estar envolvidos na regulação da migração de células GA induzida por IL-1β e invasão. JNK siRNA e inibidor de JNK não atenuou a IL-1β induzida migração celular e invasão GA, nem atenuar a activação de AP-1 induzida por IL-1β. Portanto, a IL-1β-promovido a migração celular e invasão GA são regulados por p38, mas não por JNK.
Em resumo, foram identificados pela primeira vez, que a IL-1β é funcionalmente envolvidos na regulação de metástases em GA através activação de p38. Este mecanismo molecular envolve PA-1-dependente sobre-regulação mediada por p38 de MMP2 e MMP9 ambos; e este estudo sugere fortemente que a IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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