IL-1β-индуцированной активации р38 способствует метастазированию в аденокарциномы желудка с помощью повышающей регуляции АР-1 /C-FOS, ММР2 и MMP9

IL-1β-индуцированной активации р38 способствует метастазированию в аденокарциномы желудка с помощью повышающей регуляции АР-1 /C-FOS , ММР2 и ММР9
Аннотация
Справочная информация
интерлейкин-1β (IL-1β) участвует в прогрессии аденокарциномы желудка (ГА); Однако, молекулярные механизмы действия IL-1 в ГА плохо охарактеризованы. P38 и JNK являются основными членами МАРК семьи, которые регулируют IL-1 сигнальных путей. Здесь мы исследовали роль как р38 и JNK в IL-1β-индуцированной миграции клеток GA, инвазию и метастатическим потенциалом.
Методы
Эффекты IL-1β-индуцированной р38 и активации JNK в клетках ГА были определены используя в пробирке Transwell миграции и инвазии анализы MKN-45 и AGS клеток, или естественных условиях метастаз в анализе у голых мышей. IL-1β-индуцированной сигнализации р38 путь дополнительно характеризовали в клетках GA. Активация сигнального пути IL-1β /p38 также оценивали в первичных тканях GA человека иммуногистохимическим.
Результаты
IL-1β-индуцированной активации р38 усиление миграции клеток GA и вторжение в пробирке и способствовал метастатического потенциала клетки GA в естественных условиях; эти эффекты были ослабляется p38 миРНК или ингибитором р38 SB202190. MMP2 или ММР9 миРНК и ингибитор Bips MMP2 /9 также ингибирует IL-1β-индуцированной миграции клеток GA и вторжение в пробирке. IL-1β-индуцированной активации р38 значительно увеличилась ММР2 и мРНК ММР9 и экспрессию белка и активность. Люциферазы анализы показали, что активатор протеина-1 (AP-1) и сайты связывания АР-1 ММР9
промотора (-670 /MMP9) активировали IL-1β-индуцированной активации p38. Фосфо-р38 значительно усиливает свою активность в тканях человека GA (по сравнению с согласованными неопухолевых тканей), а также в значительной степени связано с метастазов в лимфатических узлах и инвазии за пределы серозной. Экспрессия фосфо-р38 достоверно коррелирует с IL-1, ММР2, ММР9 и С-FOS выражение в обеих тканях человека ГВ и метастазов GA клеток в легких голых мышей. IL-1β был также способен активировать JNK в клетках Г.А., но активация JNK не была связана с клеточной миграции GA и вторжения. Таким образом, IL-1β-индуцированной миграции и инвазии в клетках GA регулируются р38, но не JNK.
Выводы
IL-1β-индуцированной активации р38 и IL-1β /p38 /AP-1 ( с-ФОС) /MMP2 &Amp; ММР9 пути играют важную роль в метастазировании в ГА; этот путь может обеспечить новую терапевтическую мишень для ГА.
Ключевые слова
IL-1β р38 Желудочный аденокарциномы ММР2 и ММР9 AP-1 Метастазы Фон
все больше доказательств указывает на то, что опухоли повышено и поддерживается воспалительными сигналами от опухоли микросреда и микросреды опухоли играет важную роль в развитии рака [1, 2]. Цитокины, особенно цитокины, секретируемые опухолевыми клетками, являются важными компонентами микроокружения опухоли. Фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), интерлейкин-1β (IL-β) и IL-6 являются наиболее хорошо охарактеризованы цитокины, которые были продемонстрированы, чтобы быть тесно связано с прогрессированием рака. Многие исследования показали, что воспаление индуцируется цитокинами, играет важную роль в развитии рака желудка [3]. Хорошо установлено, что инфекции, особенно те, индуцированный Helicobacter Pylori,
способны индуцировать слизистой оболочки желудка воспалительные реакции, что приводит к усилению активности IL-1, который, в свою очередь, может способствовать воспалению ассоциированного канцерогенеза [4]. Тем не менее, основные молекулярные механизмы роли передачи сигналов IL-1 β в желудочном канцерогенезе остаются в значительной степени неизвестными, и в настоящее время представляют интерес.
Р38 является членом митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК) надсемейства. МАРК сигнальные пути были хорошо изучены, и состоят из по меньшей мере трех надсемейств МАРК, которые регулируют различные клеточные активности [5]. Хорошо известно, что р38 МАРК способен регулировать множество клеточных реакций на цитокинов и стресса, в том числе IL-1 [6]; Тем не менее, последние данные показали, что p38 также тесно связана с развитием различных видов рака человека через его способность поднять миграцию раковых клеток и вторжение в ответ на различные стимулы, в том числе воспалительных факторов [6]. Кроме того, р38 также участвует в регуляции клеточной дифференцировки и апоптоза. Четыре изоформы р38 были идентифицированы до сих пор: p38-а, р38-бета, Р38-gamma и p38-б [7]. Хотя аминокислотные последовательности этих р38 МАРК в основном идентичны, паттерн экспрессии каждой изоформы изменяется [8]. Р38-α является основным р38 МАРК и выражается Повсеместно, р38-β в основном экспрессируется в головном мозге, в то время как p38γ в большом количестве экспрессируется в скелетных мышцах [9] и p38-дельта, в основном экспрессируется в эндокринных железах [10]. Многие исследования также показали, что р38 участвует в IL-1 сигнальных каскадов в наборе типов клеток, особенно в мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) клетки и макрофаги, клетки [11, 12]; Тем не менее, очень мало известно о функции ИЛ-1β-активированной р38 при раке желудка.
C-Jun N-концевой киназы (JNK) является другой член семьи МАРК, который также хорошо известно, играет важную роль в регуляции IL-1β сигнального пути [13]. В дополнение к участию в регуляции воспалительного сигнального пути, JNK выполняет ряд других важных клеточных функций, в том числе регуляции клеточного роста, дифференцировки, выживания и апоптоза. Кроме того, недавние исследования показывают, что JNK, часто сверхвыражен в различных раковых тканях, и повышающей регуляции JNK может быть тесно связано с вторжением рака [14]; Вместе с тем, участвует ли JNK, в регуляции ИЛ-1β-индуцированной миграции клеток желудка рака и инвазии остается в значительной степени неизвестными
аденокарциномы желудка (GA) является наиболее распространенным неопластических опухолей желудка. Поэтому, мы сосредоточились на ГА в данном исследовании. Здесь мы исследовали активацию р38 и JNK в ответ на IL-1, и их влияние на ИЛ-1β-индуцированной метастатический потенциал клеток GA в пробирке или естественных условиях.
Кроме того, выражение фосфо-р38 (p- р38) в ГА, его отношения к клиникопатологическими особенностей ГА, а также корреляция между экспрессией IL-1 и п-p38 были исследованы в парафиновых срезах тканей человека GA с помощью иммуногистохимии. Наконец, мы также характеризовали молекулярные механизмы, которые регулируют IL-1β-индуцированной р38-опосредованное метастатического потенциала клеток GA.
Результаты
IL-1β-индуцированной активации р38 способствует миграции клеток GA и вторжение в пробирке <бр> во-первых, мы исследовали, был ли ИЛ-1β способен активировать сигнализацию p38 в клетках GA. Как показано на рисунке 1, активация р38 (р-р38) был обнаружен в обеих клеточных линиях, GA (AGS и MKN-45 клеток), после обработки IL-1 в течение 30 мин; ИЛ-1β-индуцированную активацию р38 ингибируется ингибитором р38 SB202190 (Рис. 1А) Рисунок 1 IL-1β способствует миграции клеток GA и вторжение путем активации p38. А: Вестерн-блоттинг подтвердил, что р-р38 может быть индуцирован 30 мин стимуляции с IL-1, в AGS и MKN-45 клеточных линий; активация p38 с помощью IL-1 ингибируетс ингибитором р38 SB202190. B: Трансфекция p38 миРНК нокдауне экспрессию р38 в обоих этих двух клеточных линий GA. C-F: Обработка клеток GA с IL-1 увеличили клеточную миграцию и инвазию в пробирке; эти эффекты тормозится p38 миРНК или ингибитора р38 затрагивающего пути SB202190. ** P
&л; 0,05 по сравнению с скремблирования миРНК (миРНК управления) -transfected клетки, стимулированные IL-1; △△ P
&л; 0,05 по сравнению с нетрансфицированные клетки (клетки дикого типа), стимулированных IL-1. Бары показывают среднее ± стандартное отклонение количества клеток на поле зрения (увеличение × 400) в миграции и инвазии анализов. G:. Представительные световым микроскопом изображения AGS и миграции MKN-45 клеток и вторжения в анализах Transwell
P38 может способствовать миграции и инвазии различных раковых клеток [15]. Для того, чтобы исследовать, могут ли ИЛ-1β способствовать миграции и инвазии клеток GA посредством активации сигнализации р38, GA-клетки, трансфецированные зашифрованным миРНК (контроль миРНК) или р38 siРНК, или клетки GA предварительно обработанных с использованием или без р38 затрагивающего пути ингибитора SB202190 были стимулированных IL-1. Transwell миграции и инвазии анализы показали, что IL-1β стимуляция увеличила миграцию и вторжение в обоих AGS и MKN-45 клеток; Тем не менее, IL-1β-индуцированной миграции клеток GA и вторжения были значительно ослабляется нокдауна p38 с помощью миРНК (рис 1В G) или предварительной обработки с SB202190 (Рисунок 1С для G). Взятые вместе, эти данные убедительно показывают, что IL-1β способствует миграции клеток ГА и инвазия опосредованы р38.
ИЛ-1β-индуцированную активацию р38 активирует экспрессию ММР2 и ММР9 и активность в клетках GA
ММР2 и ММР9 есть было показано, играют важную роль в инвазии и метастазирование раковых клеток [16]. Для того, чтобы выяснить, является ли ММР2 и ММР9 также участвуют в IL-1β-индуцированной р38-регулируемых метастатического потенциала клеток GA, RT-PCR, иммуноцитохимия и конфокальной микроскопии и анализа зимографии были проведены для определения экспрессии и активности ММР2 и ММР9 в ГА клеточные линии, трансфицированные контрольной миРНК или р38 siРНК, или предварительно обработанных с использованием или без ингибитора р38 SB202190, а затем обрабатывают с использованием или без IL-1. Как и ожидалось, экспрессия и активность ММР2 и ММР9 были повышены в ответ на IL-1 лечения (рис 2А-С). Нокдаун p38 с помощью миРНК или предварительной обработки с ингибитором р38 SB202190 значительно уменьшилось ИЛ-1β-индуцированной ММР2 и экспрессию ММР9 мРНК и активность в обеих клеточных линиях GA (рис 2A-C). Рисунок 2 IL-1β активирует ММР2 и экспрессию ММР9 и активности путем активации p38. A: ОТ-ПЦР анализ показал, что ММР2
и ММР9
мРНК были позитивно регулируется в обоих AGS и MKN-45 клеток в ответ на лечение с IL-1; этот эффект был заблокирован p38 миРНК или ингибитором р38 SB202190. Б: Количественное выражение ММР2
и ММП-9
мРНК нормированная на GAPDH
мРНК. ** P
&л; 0,05 по сравнению с скремблирования миРНК-трансфецированных клеток, стимулированных IL-1. △△ P
&л; 0,05 по сравнению с нетрансфецированных клеток, стимулированных IL-1. С: Гель зимографии показал, что ММР2 и ММР9 активность были повышающей регуляции в обоих AGS и MKN-45 клеток в ответ на лечение с IL-1; этот эффект был заблокирован p38 миРНК или ингибитором р38 SB202190. D: Иммуноцитохимическая окрашивание и конфокальной микроскопии подтвердили, что ИЛ-1β увеличение активации р38 (красный), и ММР2 и ММР9 выражение (зеленый) в клетках MKN-45 GA; Эти эффекты были блокированы р38 siРНК, или ингибитора р38 SB202190.
иммуноцитохимию и конфокальной микроскопии показано, что р-р38 был слабо выражен в необработанных клетках MKN-45, который также выразил очень низкие уровни ММР2 и ММР9. После стимуляции с IL-1, что значительно повышенные уровни р-р38, ММР2 и ММР9 были обнаружены в клетках MKN-45; эти IL-1β-индуцированных эффектов тормозились p38 миРНК и SB202190 (рис 2D). Взятые вместе, эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что ИЛ-1β через р38-индуцированный инвазии и миграции клеток GA опосредовано через способность р-р38 повышать экспрессию и активность ММР2 и ММР9.
ИЛ-1β-индуцированную активацию р38 активирует ММР2 и ММР9 путем активации AP-1-зависимую транскрипцию в клетках GA
хорошо документировано, что фактор транскрипции активатор белка-1 (AP-1) может регулировать экспрессию ММР2 и ММР9 [17], и активация р38 способен регулировать AP-1 активации [18]. Для того чтобы исследовать ли зависимы ИЛ-1β-индуцированной р38-опосредованное повышенная экспрессия и активность ММР2 и ММР9 на AP-1, активация АР-1-зависимой транскрипции исследовалась в клетках GA, обработанных с использованием или без IL-1 в наличие или отсутствие ингибирования р38, используя АР-1-репортер люциферазы анализа. ИЛ-1β увеличивали активность АР-1 в обеих линиях клеток GA (рис 3А); Однако, ингибирование р38 с использованием p38 миРНК или предварительно обработанных клеток с ингибитором р38 SB202129 снижается ИЛ-1β-индуцированной АР-1 активность в обеих линиях клеток GA (Фиг.3А). Эти результаты указывают на то, что IL-1β индуцированный, р38 опосредованную экспрессию ММР2 и ММР9 зависят от AP-1. Рисунок 3 IL-1β активирует AP-1 активность через р38 пути. Ответ: Обе клетки GA трансфицировали АР-1 репортерной плазмидой или АР-1 репортерный плазмиды вместе с скремблирования миРНК или р38 миРНК. -1 AP активность гена люциферазы репортер был значительно увеличен с помощью IL-1 стимуляции в обоих AGS и MKN-45 клеток; Эти эффекты были значительно ингибировалась р38 siРНК, в зависимости от дозы, а также ингибируется ингибитором р38 SB202190. ** P
&л; 0,05 по сравнению с контролем миРНК (миРНК скремблирования) + AP 1-Luc-трансфицировали клетки, стимулированные IL-1; ΔΔP
&л; 0,05 по сравнению с AP 1-Luc-трансфецированных клеток, стимулированных IL-1; относительная активность люциферазы нормализовали к B-гал. Б: ИЛ-1β-индуцированной р38-опосредованное СРАБАТЫВАНиЮ ММР9
промоторов зависит от АП-1-связывающих сайтов. ** P
&л; 0,05 по сравнению с трансфицировали -670 /ММР9 + контроль миРНК клетки, стимулированные IL-1; ΔΔP
&л; 0,05 по сравнению с трансфицировали -670 /ММР9 клетки, стимулированные IL-1; ▼▼ P
&л; 0,05 по сравнению с трансфицировали -570 /ММР9 клетки, стимулированные IL-1; относительная активность люциферазы нормализовали к B-гал.
В целях дальнейшего подтверждения роли AP-1 в IL-1β-индуцированного p38 пути, люциферазы векторов репортерных генов, содержащих сайты AP-1 ММР9
промотора области были трансфицированы в клетки GA. В соответствии с репортером генных анализов AP-1, люциферазы деятельность в -670 /ММР9
промоторной области (содержащий два сайта связывания AP-1 [-533 и -79] и один сайт связывания NF-КБ [-600 ] [19-21]) значительно увеличилась в ИЛ-1β-стимулированных клеток (фигура 3В). Трансфекция клеток с р38 siРНК, или предварительно обработанных клеток с ингибитором р38 SB202129 уменьшило IL-1-индуцированной активности люциферазы в -670 /ММР9
промотора гена-репортера (рисунок 3б). Активность люциферазы в ММР9
промотора (-571 /ММР9
) не была изменена путем удаления сайта NFκB связывания (-600). Кроме того, когда сайты АР-1 (-79 и -533) НАСТОЯЩЕГО ММР9
промотора были удалены (-73 /ММР9
мутанты), активность люциферазы гена-репортера значительно снизилась, по сравнению с соответствующим диким -типа гены-репортеры управления (рис 3б). В совокупности эти данные убедительно свидетельствуют о том, что IL-1β индуцирует активацию сигнального пути р38, который способствует инвазию и миграцию клеток GA через AP-1-зависимой повышающей регуляции ММР2 и экспрессии MMP9 и активности.
Нокдаун ММР2 или ММР9 уменьшается IL-1-индуцированной миграции и инвазии в клетках GA
Чтобы дополнительно подтвердить, что IL-1-индуцированной миграции клеток GA и инвазии связаны с усилением активности ММР2 и ММР9, AGS и клеток MKN-45 были трансфицированы миРНК против ММР2
или ММР9
, или предварительно обрабатывают с использованием или без ингибитора ММР2 /MMP9 Bips, а затем стимулировали IL-1. Миграционные и инвазия анализы Transwell показали, что ИЛ-1β-индуцированной миграции и инвазии клеток GA были значительно ослаблены нокдауна ММР2
или ММП-9,
или предварительной обработки с Bips, по сравнению с контрольными клетками (рис 4A для C). Таким образом, регуляция ММР2 и ММР9 имеют решающее значение для IL-1β-индуцированной миграции клеток GA и вторжения. Рисунок 4 Нокдаун ММР2 или ММР9 или предварительной обработки с /ингибитором Bips ММР2 9 ингибирует IL-1β-индуцированной миграции клеток GA и вторжение в пробирке. A: ОТ-ПЦР подтвердили эффективность ММР2 или MMP9 миРНК, которое позволило значительно сократить ММР2
или ММР9
выражение, соответственно, вплоть до более чем 75%. B: IL-1β увеличил клеточную миграцию GA и вторжение в пробирке; эти эффекты были ингибируется ММР2 или MMP9 миРНК или ингибитора Bips в MMP2 /9. ** P
&л; 0,05 по сравнению с скремблирования миРНК (контроль миРНК) -transfected клетки, стимулированные IL-1. Столбики среднее ± SD раз меняет нормированы с контрольной группой в миграции и инвазии анализов. C: Представительные световой микроскопии изображения миграции клеток AGS и MKN-45 и вторжения в миграции и инвазии анализов Transwell
IL-1β-индуцированной активации JNK не участвует в регуляции клеточной миграции ГА и вторжения
. хорошо известно, что члены МАРК играют важную роль в регуляции клеточного ответа на цитокины и стресс, а также Р38 и JNK, являются основными членами МАРК семьи, которые регулируют IL-1 сигнальных путей. Для того, чтобы понять, является ли JNK, также связывается с IL-1β-индуцированной миграции клеток GA и инвазии, Вестерн-блот-анализ проводили для определения активации JNK в ответ на IL-1. Как выставлены на фиг.5А, п-JNK, была обнаружена в обоих AGS и MNK-45 клеточных линий, после стимуляции IL-1 в течение 30 мин. Тем не менее, результаты обоих Transwell миграции и инвазии анализов показали, что рост миграции и вторжение в обоих AGS и MKN-45 клеток, индуцированные IL-1 стимуляции не были ослаблены бросовой JNK с миРНК и не ослабляются путем ингибирования JNK пути с ингибитором JNK SP600125 ни (фиг.5В к D); Количество мигрировавших и инвазивных клеток практически не показали изменения до или после трансфекции миРНК против JNK (P > 0,05) или с или без предварительной обработке ингибитором JNK SP600125 (P > 0,05). JNK не был связан с IL-1β раскрученной миграции клеток GA и вторжение будучи дополнительно проверяется AP-1 репортера люциферазы анализа. В качестве входной киназы с-Цзюнь (еще один важный компонент AP-1), JNK, способен активировать АР-1, а также активацию АР-1, т.е. JNK тесно связана с функцией JNK по регулированию различных клеточных реакций, включая рак миграции клеток и вторжения [22]; Тем не менее, IL-1β-индуцированной активации AP-1 в обоих AGS и клетках MKN-45 не подавлялась JNK миРНК, ни ингибитором JNK SP600125 ни (рис 5E). Все вместе, эти данные убедительно свидетельствуют о том, что рост миграции GA и вторжение способствовало IL-1 не регулируются JNK. Рисунок 5 Активация JNK не связано с ИЛ-1β-индуцированной миграции клеток GA и инвазии. А: р-JNK, было обнаружено 30 мин стимуляции с IL-1, в AGS и MKN-45 клеточных линий. B: Трансфекция JNK миРНК нокдауне выражение JNK в обеих двух клеточных линий GA. C-D: Лечение GA клеток с IL-1β увеличением миграции клеток и вторжения в пробирке; эти эффекты не тормозились JNK миРНК ни JNK затрагивающего пути ингибитора SP600125. ** P
&л; 0,05 по сравнению с скремблирования миРНК-трансфецированных клеток, стимулированных IL-1; △△ P
&л; 0,05 по сравнению с нетрансфицированные клетки (клетки дикого типа), стимулированных IL-1; ## Или ●● никакого существенного отличается между этими двумя группами обнаружено не было (Р &
ГТ; 0,05). Бары указано среднее ± SD числа клеток на поле зрения в миграции и инвазии анализов. D: Представительные световым микроскопом изображения AGS и миграции клеток MKN-45 и вторжения в анализах Transwell. Е: Обе клетки GA трансфицировали АР-1 репортерной плазмидой или АР-1 репортерный плазмиды вместе с скремблирования миРНК или JNK миРНК. -1 AP активность гена люциферазы репортер был значительно увеличен с помощью IL-1 стимуляции в обоих AGS и MKN-45 клеток; эти эффекты не тормозились JNK миРНК и не ингибируется ингибитором JNK SP600125 ни. ** P
&л; 0,05 по сравнению с контролем миРНК (миРНК скремблирования) + AP 1-Luc-трансфицировали клетки, стимулированные IL-1; ΔΔP
&л; 0,05 по сравнению с AP 1-Luc-трансфецированных клеток, стимулированных IL-1; ## Или ●● никакого существенного отличается между этими двумя группами обнаружено не было (Р &
ГТ; 0,05). Относительная активность люциферазы нормализовали к B-гал.
Фосфо-р38 усиливает свою активность и коррелирует с экспрессией IL-1, ММР2, ММР9 и C-FOS в тканях человека GA
Выражение п-p38 в серия из 105 тканей Г.А. и парными неопухолевых желудка ткани исследовали с помощью иммуногистохимии (IHC). Из 105 образцов рака, 53 случаев тканей GA (50,48%), показывает сверхэкспрессии р-р38 по сравнению с парными неопухолевых желудочных тканей (Р
≪ 0,05; 6А). Выражение Положительное р-р38 часто наблюдается и в цитоплазме клетки и ядра GA. На рисунке 6 фосфорилированный р38 избыточно экспрессируется в человеческом ГА, а выражение п-p38 положительно коррелирует с IL-1, ММР2, ММР9 и С-FOS экспрессии в тканях GA. О: Сверхэкспрессия р-р38 часто наблюдалась в тканях Г.А., по сравнению с парными неопухолевых желудочных тканей. а, Р-p38 не был обнаружен или слабо выраженный в неопухолевых желудка тканей. б на е: различные интенсивности положительной экспрессии р-р38 в тканях ГА. B: Выражение п-p38 положительно коррелирует с IL-1, ММР2, ММР9 и С-FOS выражение в тканях GA человека. GA образец ткани выставляется сильный IL-1β экспрессию и сильнее р-р38, ММР2, ММР9 и С-FOS выражение; и слабее IL-1β экспрессия и слабый р-р38, ММР2, ММР9 и C-FOS выражение. C: сумма баллов положительной интенсивности окрашивания IHC для р-р38. ** P
&л; . По сравнению с 0,05 в паре Непро- опухолевые ткани желудка не
заметной связи наблюдались между сверхэкспрессией р-р38 в возрасте пациентов (&л; 50 или 50 лет ≥), пол, размер опухоли (&л; 3 см или ≥ 3 см), гистологический тип, или степень дифференциации. Однако избыточная экспрессия р-р38 отображается в значительной степени связано с метастазов в лимфатических узлах (P &
л; 0,05), а также вторжение за пределы серозной (P &
л; 0,05). Эти данные свидетельствуют о том, что избыточная экспрессия р-р38 связан с метастазами в человеческом ГА.
Как выставлены на фиг.6В, экспрессия р-P38 показал хорошую коррелятивность с уровнем IL-1, ММР2, ММР9 и АР-1 (с-ФОС) в GA ткани, а также существенная корреляция между повышенной экспрессией р-р38 и повышающей регуляции IL-1, ММР2, ММР9 и с-FOS в GA ткани (г = 0,72, р &ЛТ; 0,01; г = 0,63, р &л; 0,01; г = 0,58, р &л; 0,05 и г = 0,69, р &л; 0,01) была обнаружена при анализе с помощью метода Спирмена
сумме баллов положительной интенсивности окрашивания IHC для р-р38 в обоих 105 случаев ГА. тканей и спаренные не- опухолевые ткани желудка экспонировались на фиг.6С.
Invasion пробирного голых мышей
клетках MKN-45, трансфицированных зашифрованным миРНК или р38 siРНК, вводили в хвостовую вену мышей линии BALB /C Nu /Nu мышей; IL-1β или PBS, также внутрибрюшинно вводили со дня из клетки вводили в течение 14 дней. Группа 1 вводили ПБС, а затем вскарабкался миРНК-трансфецированные клетки MKN-45; 2-й группы вводили IL-1 и пополз миРНК-трансфецированных клеток MKN-45; и группа 3 вводили р38 миРНК-трансфицированных MKN-45 клеток и IL-1
В течение 45 дней после инъекции клеток, всех животных. (6/6; 100%) в IL-1β-обработанной группы были разработаны метастазы в легких (рис 7А-D) (группа 2, средняя метастатических очагов в 6 секций легких было 14 в легких). В отличие от этого, меньше животных (2 /6,33.33%) в контрольной группе, которые не были введены с IL-1 β разработали легочные метастазы (группа 1, в среднем 6 метастазов в 6 из срезах легких в легких). Принимая во внимание, в р38 siРНК, плюс IL-β-группе, получавшей только два животных развивались метастазы в легких и количество легочных метастазов в этой группе было достоверно ниже (группа 3, в среднем 4 метастазов в 6 срезах легких в легких) и значительно меньше, чем у соответствующей группы, обработанной IL-1 (группа 2) (рис 7А D). Рисунок 7 ИЛ-1β стимуляция увеличивает метастатический потенциал клеток GA в естественных условиях через механизм р38-зависимой. A: Типичные метастазы в легких образуются в различной группе мыши. B: Bars указано количество животных, разработаны метастазы в легких. C: Представитель результаты окрашивания Его метастазов в легких. D: Bars указано среднее ± стандартное отклонение число метастатических очагов в 6 секций /в легких легких у мышей, которые разработали метастазы в легких. △△ P
&л; 0,05 по сравнению с впрыскивается скремблирования миРНК трансфекции клеток плюс IL-1 стимуляции. Е: ОТ-ПЦР анализ p38, ММР2, MMP9
и C-FOS
экспрессии мРНК в легочных метастазов разных мышей. F: IHC анализ р-р38, ММР2, ММР9 и С-FOS экспрессии белка в легочных метастазов; IL-1β индуцированной повышенной р-р38, ММР2, ММР9 и С-FOS экспрессию белка.
Для дальнейшего подтверждения того, р38, ММР2 и ММР9 участвуют в IL-1-индуцированного легкого метастазирование клеток GA, и определить, является ли этот процесс регулируется AP-1, уровни экспрессии мРНК р38, ММР2, MMP9
и C-FOS
(один из ключевых компонентов AP-1) в метастатической легких были количественно с помощью оТ-ПЦР и р-р38 , ММР2, ММР9 и C-FOS экспрессии белка в срезах легких были изучены с помощью IHC. Как показано на рисунке 7 Е и F, уровни экспрессии р-р38, ММР2, ММР9 и С-FOS в метастатических очагов в легких были повышены в ответ на IL-1. Активация р38 и мРНК или экспрессии белка уровни р38, ММР2, ММР9 и С-FOS были ниже, в метастазах, образованных клеток, трансфецированных р38 siРНК, плюс IL-бета-группе, получавшей (Group3) или в контрольной группе (группа 1 ) по сравнению с метастазами, образуемых скремблирования миРНК плюс IL-β-обработанной группе (группа 2) (рис 7E и F). Взятые вместе, данные в естественных условиях еще раз подтверждает, что IL-1β-индуцированных клеток метастазирование GA опосредуется сигнализации p38 с помощью АР-1 зависимой повышающей регуляции ММР2 и ММР9.
Обсуждение
Ряд исследований показали, что IL- 1β способен активировать р38 и JNK [11, 12], и р38 и JNK играют важную роль в миграции раковых клеток и вторжения [14, 23-26]. Поэтому мы предположили, что IL-1β может способствовать инвазии клеток GA и метастазирования через активацию р38 и JNK путей. Чтобы исследовать эту возможность, мы оценивали способность IL-1 для активации p38 и JNK, а также способствовать миграции и инвазии клеток GA. Наши результаты показали, что IL-1β может активировать как р38, JNK, и, и увеличить GA миграцию клеток и инвазию, и что эти эффекты можно ингибировать р38 siРНК, или ингибитор р38 SB 202190, но не JNK миРНК или ингибитор JNK SP600125. Это первая демонстрация того, что IL-1β может индуцировать клеточную миграцию и инвазию GA через активацию р38; Тем не менее, основные молекулярные механизмы, с помощью которых ИЛ-β-опосредованной передачи сигналов р38 регулируется во время рака желудка остаются в значительной степени неизвестными.
Один потенциальный механизм, с помощью которого р38 может увеличить инвазию и миграцию раковых клеток путем повышения уровней ММР [ ,,,0],27]. Хорошо установлено, что секреция ММР со способностью к внеклеточного матрикса (ЕСМ) деградации является признаком метастатических раковых клеток [28]. ММР2 и ММР9 два из наиболее хорошо охарактеризованных ММР и тесно связаны с вторжением и метастазирование раковых из-за их сильной протеолитической активности ECM [29]. Мы сообщаем здесь также впервые, что, вероятно, молекулярный механизм, с помощью которого IL-1β способствует миграции клеток GA и инвазии могут включать в себя IL-1β /p38 /AP-1 (C-FOS) /MMP2 &Amp; ММР9 сигнального пути. Мы показали, что оба ММР2 и ММР9 были повышающей регуляции в клетках ГА в ответ на IL-1 стимуляции; эти эффекты были ингибируется миРНК против р38, ММР2
или MMP9
ингибитор р38 SB202190 и ингибитора Bips в MMP2 /9. Кроме того, нокдаун ММР2
или ММР9
с помощью миРНК или ингибирование ММР2 /9 активности с использованием БИП, значительно уменьшилось IL-1β-индуцированной миграции клеток GA и вторжения. В качестве протеинкиназы серин /треонин, р38 способен индуцировать активацию фактора транскрипции AP-1 [30]. Кроме того, мы обнаружили, что ИЛ-1β-индуцированный, р38-опосредованное повышающая регуляция ММР2 и ММР9 были АР-1-зависимыми. IL-1β был только способен активировать транскрипцию ММР9
промоторных областей, содержащих AP-1 сайты, и эти эффекты были ослабляется p38 миРНК и ингибитора р38 SB202190. Кроме того, ИЛ-1β-индуцированную активацию АР-1-зависимой транскрипции ингибировалась p38 миРНК.
Фосфо-р38 (п-p38), активированная форма р38, может быть обнаружен в почти 50% человеческого Г.А. образцы ткани, испытанные IHC анализа и экспрессию р-р38 в значительной степени связано с метастазов в лимфатических узлах, а также за его пределами инвазии серозной у пациентов с ГА. Кроме того, экспрессия IL-1 β положительно коррелирует с экспрессией р-р38, ММР2, ММР9 и С-FOS в клинических образцах, GA. Кроме того, in vivo на данные анализа показали, что метастазирование образование метастатических очагов легких клетками Г.А., и p38 /
р-р38, ММР2, ММР9 и экспрессии мРНК и белка с-FOS в метастатических очагов легких были повышены путем ИЛ-1β, и снижается путем инъекции клеток, трансфецированных р38 миРНК. Взятые вместе, эти данные убедительно показывают, что ИЛ-1β-индуцированной миграции клеток ГА и инвазия происходят за счет активации сигнального пути р38, что приводит к активации АР-1 и повышающей регуляции ММР2 и ММР9. Таким образом, р38 играет существенную роль в IL-1β-индуцированного метастазирования в ГА.
JNK является еще одним важным МАРК быть хорошо известно, играют важную роль в регуляции передачи сигналов IL-1 в нескольких различных клетках [14, 31]. Тем не менее, в этом исследовании, JNK, было обнаружено, что не участвует в регуляции ИЛ-1β-индуцированной миграции клеток GA и инвазии. JNK миРНК и ингибитор JNK не ослабляло IL-1β индуцированной миграции клеток GA и инвазии, ни затухать активацию АР-1, индуцированной IL-1. Таким образом, IL-1β раскрученной миграции клеток GA и вторжение регулируются р38, но не JNK.
Таким образом, мы определили в первый раз, что IL-1β функционально участвует в регуляции метастаза в ГА через активация р38. Этот молекулярный механизм включает p38-опосредованной АР-1-зависимой повышающую регуляцию обоих ММР2 и ММР9; и это исследование наводит на мысль о том, что IL-1β /р38 /АР-1 (C-FOS) /ММР2 &Amp; Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Гастропарез, связанный с гастроптоз представляю в данный момент в нижней части живота для увеличения объема …
• Влияние IL17A полиморфизмов на аберрантных метилирования DAPK и CDH1 в нераковая слизистую оболочку желудка