IL-1β inducida por la activación de p38 promueve la metástasis en el adenocarcinoma gástrico a través de la regulación positiva de la AP-1 /c-fos, MMP2 y MMP9

IL-1β inducida por la activación de p38 promueve la metástasis en adenocarcinoma gástrico a través de la regulación positiva de AP-1 /c-fos, MMP2 y MMP9
Abstract
Antecedentes
interleucina-1β (IL-1β) ha sido implicado en la progresión de adenocarcinoma gástrico (GA); sin embargo, los mecanismos moleculares de la acción de IL-1β en GA están mal caracterizados. P38 y JNK son los principales miembros de la familia MAPK que regulan las vías de señalización de IL-1β. A continuación, se investigó el papel de ambos p38 y JNK en la migración celular GA inducida por IL-1β, la invasión y el potencial metastásico.
Métodos
Los efectos de p38 inducida por IL-1β y la activación de JNK en células GA se determinaron utilizando in vitro Transwell migración y la invasión ensayos de células MKN-45 y AGS, o un ensayo de metástasis in vivo en ratones desnudos. La vía de señalización p38 inducida por IL-1β se caracterizó adicionalmente en células GA. La activación de la vía de señalización de IL-1β /p38 también se evaluó en los tejidos GA primarios humanos por inmunohistoquímica.
Resultados
la activación inducida por IL-1β de p38 aumentaron la migración celular y la invasión GA in vitro y promueve el potencial metastásico de GA células in vivo; estos efectos fueron atenuados por siRNA p38 o el inhibidor de p38 SB202190. MMP2 o MMP9 siRNAs y el inhibidor de MMP2 /9 PIF también inhibieron la migración de células GA inducida por IL-1β y la invasión in vitro. IL-1β inducida por la activación de p38 aumentó significativamente MMP2 y MMP9 ARNm y la expresión de proteína y actividad. ensayos de reportero de luciferasa demostraron que la proteína-1 activador (AP-1) y los sitios de unión AP-1 de la MMP9
promotor (-670 /MMP9) se activa mediante la activación de p38 inducida por IL-1β. Fosfo-p38 se reguló de manera significativa en los tejidos humanos GA (en comparación con los tejidos no neoplásicos emparejados), y se asocia significativamente con metástasis en los ganglios linfáticos y la invasión más allá de la serosa. La expresión de fosfo-p38 correlacionó significativamente con la IL-1β, MMP2, MMP9, y la expresión de c-fos en ambos tejidos GA humanos y metástasis de células GA en los pulmones de ratones desnudos. IL-1β también era capaz de activar JNK en células de Ga, pero la activación de JNK no se asoció con la migración celular y la invasión GA. Por lo tanto, IL-1β inducida por la migración y la invasión en las células de GA estaban regulados por p38, pero no por JNK.
Conclusiones
IL-1β inducida por la activación de p38 y de la IL-1β /p38 /AP-1 ( c-fos) /MMP2 & vía MMP9 juegan un papel importante en la metástasis en GA; esta vía puede proporcionar una nueva diana terapéutica para el GA.
Palabras clave hotels, IL-1β p38 gástrico MMP2 y MMP9 adenocarcinoma AP-1 Metástasis Antecedentes
aumento de la evidencia indica que los tumores son promovidos y sostenidos por las señales inflamatorias del tumor microambiente, y el microambiente tumoral juega un papel importante en la promoción del cáncer [1, 2]. Las citoquinas, especialmente las citoquinas secretadas por las células tumorales, son componentes esenciales de la microambiente tumoral. factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), la interleucina-1β (IL-β) y la IL-6 son los más citoquinas bien caracterizados que se ha demostrado que estar estrechamente relacionada con la progresión del cáncer. Una gran cantidad de estudios han demostrado que la inflamación inducida por citoquinas juega un papel importante en el desarrollo del cáncer [3] gástrico. Está bien establecido que las infecciones, especialmente las provocadas por Helicobacter pylori,
son capaces de inducir respuestas inflamatorias de la mucosa gástrica, dando como resultado la regulación positiva de IL-1β, que a su vez puede promover la carcinogénesis asociada con la inflamación [4]. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes para el papel de la señalización de IL-1β en la carcinogénesis gástrica siguen siendo en gran parte desconocidos, y son actualmente de interés.
P38 es un miembro de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) superfamilia. Las vías de señalización de MAPK se han investigado bien, y se componen de al menos tres superfamilias de MAPKs que regulan diversas actividades celulares [5]. Es bien sabido que p38 MAPK es capaz de regular una gran cantidad de respuestas celulares a las citocinas y el estrés, incluyendo IL-1β [6]; Sin embargo, datos recientes demostraron que p38 está también estrechamente relacionado con el desarrollo de diferentes tipos de cáncer humano a través de su capacidad para elevar la migración de células de cáncer y la invasión en respuesta a varios estímulos, incluyendo factores inflamatorios [6]. Además, p38 también está involucrado en la regulación de la diferenciación celular y la apoptosis. Cuatro isoformas de p38 se han identificado hasta el momento: p38-α, β-p38, p38-γ, y p38-δ [7]. Aunque las secuencias de aminoácidos de estas MAPKs p38 son en su mayoría idénticos, el patrón de expresión de cada isoforma varía [8]. P38-α es el principal MAPK p38 y se expresa de forma ubicua, p38-β se expresa principalmente en el cerebro, mientras que p38γ se expresa abundantemente en el músculo esquelético [9] y p38-δ se expresa principalmente en las glándulas endocrinas [10]. Muchos estudios también han demostrado que la p38 participa en cascadas de señalización de IL-1ß en un conjunto de tipos de células, especialmente en ratón de fibroblastos embrionarios (MEF) células y macrófagos células [11, 12]; Sin embargo, se sabe muy poco acerca de la función de p38 activada por IL-1β en el cáncer gástrico.
quinasa c-Jun N-terminal (JNK) es otro miembro de la familia MAPK que también es bien conocido por desempeñar un papel importante en la regulación IL-1β vía de señalización [13]. Además de la participación en la vía de señalización inflamatoria regulación, JNK realiza varias otras funciones celulares importantes, incluyendo la regulación del crecimiento celular, la diferenciación, la supervivencia y la apoptosis. Por otra parte, estudios recientes demuestran que JNK es con frecuencia sobre-expresan en diferentes tejidos de cáncer, y sobre regulación de JNK pueden estar estrechamente asociados con la invasión del cáncer [14]; sin embargo, si JNK participa en la regulación de la migración celular de cáncer gástrico inducida por IL-1β y la invasión sigue siendo en gran medida desconocido
adenocarcinoma gástrico (GA) es la neoplasia más común del estómago.; Por lo tanto, nos centramos en GA en este estudio. Aquí, se determinó la activación de p38 y JNK en respuesta a IL-1β, y su efecto sobre la IL-1β inducida por el potencial metastásico de las células de Ga In vitro o in vivo.
Además, la expresión de fosfo-p38 (p- p38) en GA, su relación con las características clínico-patológicas de GA, y la correlación entre la expresión de IL-1β y p-p38 se investigó en los tejidos incluidos en parafina GA humanos mediante inmunohistoquímica. Por último, también caracteriza los mecanismos moleculares que regulan el potencial metastásico p38 mediada inducida por IL-1β de células GA.
Resultados
IL-1β inducida por la activación de p38 promueve la migración celular y la invasión GA in vitro
en primer lugar, se investigó si la IL-1β fue capaz de activar la señalización de p38 en células GA. Como se muestra en la Figura 1, se detectó la activación de p38 (p-p38) en ambas líneas celulares GA (AGS y MKN-45 células) después del tratamiento con IL-1β de 30 min; IL-1β inducida por la activación de p38 fue inhibido por el inhibidor de p38 SB202190 (Figura 1A). Figura 1 IL-1β promueve la migración celular y la invasión GA mediante la activación de p38. A: transferencias Western confirmaron que p-p38 podría ser inducida por 30 min de la estimulación con IL-1β en AGS y líneas de células MKN-45; la activación de p38 por la IL-1β se inhibió por el inhibidor de p38 SB202190. B: La transfección de siRNA p38 derribado la expresión de p38 en ambos las dos líneas celulares GA. C-F: El tratamiento de células GA con IL-1β aumento de la migración celular y la invasión in vitro; estos efectos fueron inhibidas por siRNA p38 o el inhibidor de la vía p38 SB202190. ** P Hotel < 0,05 frente scramble siRNA (Control de siRNA) células transfectadas estimuladas con IL-1β; △△ P Hotel < 0,05 frente a células no transfectadas (células de tipo salvaje) estimuladas con IL-1β. Las barras indican la ± SD media del número de células por campo de visión (× 400 aumentos) en los ensayos de migración y la invasión. G:. Imágenes de microscopio de luz representativos de AGS y migración de las células MKN-45 y la invasión en los ensayos Transwell
P38 puede promover la migración y la invasión de las diferentes células del cáncer [15]. Para investigar si la IL-1β puede promover la migración y la invasión de las células de GA a través de la activación de la señalización de p38, las células GA transfectadas con un revueltos siRNA (siRNA control) o siRNA p38, o células GA pre-tratados con o sin el SB202190 inhibidor de la vía p38 eran estimuladas con IL-1β. migración y la invasión Transwell ensayos demostraron que la estimulación de IL-1β aumentó la migración y la invasión de ambos AGS-45 y las células MKN; sin embargo, inducida por IL-1β la migración celular y la invasión GA fueron significativamente atenuada por desmontables de p38 usando siRNA (Figura 1B a G) o el pretratamiento con SB202190 (Figura 1C a G). Tomados en conjunto, estos datos sugieren fuertemente que la IL-1β promueve la migración celular y la invasión GA están mediadas por p38.
IL-1β inducida por la activación de p38 regula al alza MMP2 y MMP9 expresión y actividad en las células GA
MMP2 y MMP9 tienen ha demostrado que desempeñan papeles importantes en la invasión de células de cáncer y la metástasis [16]. Para explorar si MMP2 y MMP9 también participan en el potencial metastásico p38 regulada inducida por IL-1β de las células de Ga, RT-PCR, inmunocitoquímica y microscopía confocal, y el ensayo de zimografía se llevaron a cabo para determinar la expresión MMP2 y MMP9 y la actividad en GA líneas de células transfectadas con ARNsi de control o siRNA p38, o pretratadas con o sin el inhibidor de p38 SB202190, y luego tratadas con o sin IL-1β. Como era de esperar, MMP2 y MMP9 expresión y la actividad fueron elevados en respuesta a tratamiento con IL-1β (Figura 2A a C). Desmontables de p38 usando siRNA, o el tratamiento previo con el inhibidor de p38 SB202190 disminuyó significativamente MMP2 inducida por IL-1β y expresión MMP9 ARNm y la actividad en ambas líneas celulares GA (Figura 2A a C). Figura 2 IL-1β regula al alza MMP2 y MMP9 expresión y la actividad mediante la activación de p38. A: análisis RT-PCR mostró que MMP2
y MMP9
mRNA se upregulated en ambos AGS y 45-MKN células en respuesta al tratamiento con IL-1β; este efecto fue bloqueado por siRNA p38 o el inhibidor de p38 SB202190. B: Cuantificación de la expresión de MMP2
y MMP9
mRNA normalizó a GAPDH
mRNA. ** P Hotel < 0,05 frente a células revueltos siRNA transfectadas estimuladas con IL-1β. △△ P Hotel < 0,05 frente a células no transfectadas estimuladas con IL-1β. C: Gel zimografía mostró que la actividad de MMP2 y MMP9 se upregulated en ambos AGS y MKN 45 células en respuesta al tratamiento con IL-1β; este efecto fue bloqueado por siRNA p38 o el inhibidor de p38 SB202190. D: La tinción inmunocitoquímica y microscopia confocal confirmaron que la IL-1β aumento de la activación de p38 (rojo), y MMP2 y MMP9 expresión (verde) en células MKN-45 GA; estos efectos fueron bloqueados por siRNA p38 o el inhibidor de p38 SB202190.
inmunocitoquímica y microscopia confocal demostraron que p-p38 se expresó débilmente en células no tratadas MKN-45, que también expresan niveles muy bajos de MMP2 y MMP9. Después de la estimulación con IL-1β, aumentó significativamente los niveles de p-p38, MMP2 y MMP9 se detectaron en las células MKN-45; estos efectos inducidos por IL-1β fueron inhibidos por p38 siRNA y SB202190 (Figura 2D). En conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que la IL-1β a través de la invasión y migración de las células GA p38 inducida está mediada a través de la capacidad de la p-p38 para regular positivamente la expresión y la actividad de MMP2 y MMP9.
La activación inducida por IL-1β de p38 regula al alza MMP2 y MMP9 mediante la activación de la transcripción AP-1-dependiente en células GA
está bien documentado que el factor de transcripción activador de la proteína-1 (AP-1) se puede regular la expresión de MMP2 y MMP9 [17], y la activación de p38 es capaz de regular la activación de AP-1 [18]. Con el fin de examinar si inducida por IL-1β expresión MMP2 y MMP9 elevada p38 mediada y la actividad son dependientes de AP-1, la activación de la transcripción AP-1-dependiente se investigó en células GA tratados con o sin IL-1β, de la presencia o ausencia de la inhibición de p38, usando un ensayo de indicador de luciferasa de AP-1. IL-1β se incrementó la actividad de la AP-1 en ambas líneas celulares GA (Figura 3A); sin embargo, la inhibición de p38 usando siRNA p38 o células pretratadas con SB202129 inhibidor p38 redujo inducida por IL-1β actividad AP-1 en ambas líneas celulares GA (Figura 3A). Estos resultados indican que la IL-1β inducida, p38 mediada por la expresión de MMP2 y MMP9 son dependientes de AP-1. Figura 3 IL-1β activa la actividad AP-1 a través de la vía p38. R: Tanto las células fueron transfectadas con GA AP-1 plásmido reportero o AP-1 plásmido reportero junto con scramble siRNA o p38 siRNA. AP-1 actividad del gen indicador de luciferasa se incrementó significativamente por la estimulación de IL-1β en ambos AGS-45 y las células MKN; estos efectos se inhibieron significativamente por siRNA p38 de una manera dependiente de la dosis y también inhibido por el inhibidor de p38 SB202190. ** P Hotel < 0,05 frente a control siRNA (siRNA scramble) + 1 AP-luc células transfectadas estimuladas con IL-1β; ΔΔP Hotel < 0.05 vs. 1 AP-luc células transfectadas estimuladas con IL-1β; la actividad relativa de luciferasa se normalizó a B-gal. B: inducida por IL-1β la activación de p38 mediada de la MMP9
promotores depende de los sitios de AP-1 de unión. ** P Hotel < 0.05 vs. transfectadas -670 células siRNA /MMP9 + de control estimuladas con IL-1β; ΔΔP Hotel < 0.05 vs. transfectadas -670 células /MMP9 estimuladas con IL-1β; ▼▼ P Hotel < 0.05 vs. transfectadas -570 células /MMP9 estimuladas con IL-1β; la actividad de luciferasa relativa se normalizó a B-gal.
Para confirmar aún más la función de AP-1 en la vía de p38 inducida por IL-1β, los vectores de gen informador de luciferasa que contenían los sitios de AP-1 de la MMP9
promotor regiones se transfectaron en las células GA. De acuerdo con los ensayos de gen reportero AP-1, las actividades de luciferasa de la -670 /MMP9
región promotora (que contiene dos sitios de unión de AP-1 [-533 y -79] y un sitio de unión de NF-КB [-600 ] [19-21]) aumentó significativamente en células estimuladas con IL-1β (Figura 3B). La transfección de las células con siRNA p38 o células pretratadas con SB202129 inhibidor p38 redujo la actividad de luciferasa de IL-1β inducida de la -670 /MMP9
gen informador promotor (Figura 3B). La actividad de la luciferasa de la MMP9
promotor (-571 /MMP9
) no se modificó por deleción del sitio de unión NFkB-(-600). Además, cuando se eliminaron los sitios de AP-1 (-79 y -533) de la MMP9
promotor (-73 /MMP9
mutantes), la actividad de la luciferasa del gen indicador disminuyó significativamente, en comparación con el respectivo salvaje los genes de tipo de control reportero (Figura 3B). En conjunto, estos datos indican fuertemente que la IL-1β induce la activación de la vía de señalización de p38, que promueve la invasión y migración de células a través de la regulación positiva GA AP-1 dependiente de MMP2 y MMP9 expresión y actividad.
Desmontables de MMP2 o MMP9 disminuye la migración IL-1β inducida y la invasión en las células GA
Para confirmar aún más que la migración de células GA IL-1β inducida y la invasión están asociados con la regulación positiva de MMP2 y MMP9, AGS y MKN-45 células fueron transfectadas con siRNAs contra MMP2
o MMP9
, o pretratadas con o sin el inhibidor de MMP2 /MMP9 bips, y después se estimularon con IL-1β. Los ensayos de migración y la invasión Transwell demostraron que la migración de IL-1β inducida y la invasión de las células GA fueron significativamente atenuada por la caída de la MMP-2
o MMP9, España o pre-tratamiento con PIF, en comparación con las células control (Figura 4A a C). Por lo tanto, la regulación positiva de MMP2 y MMP9 son cruciales para la migración celular GA inducida por IL-1β y la invasión. Figura 4 Desmontables de MMP2 o MMP9 o el tratamiento previo con la MMP2 /9 inhibidor SIN inhibe la migración de células GA inducida por IL-1β y la invasión in vitro. A: RT-PCR confirmó la eficacia de la MMP2 o MMP9 siRNAs, lo que redujo significativamente MMP2
o MMP9
expresión, respectivamente, hasta en más de 75%. B: IL-1β se incrementó la migración celular y la invasión GA in vitro; estos efectos fueron inhibidos por MMP2 o MMP9 siRNA o el inhibidor de la MMP-2/9 del SIN. ** P Hotel < 0,05 frente scramble siRNA (siRNA control) las células transfectadas estimuladas con IL-1β. Las barras son la media ± SD pliegue cambia normalizada con el grupo control en los ensayos de migración e invasión. C: Imágenes de microscopía de luz representativos de la migración de células AGS y MKN-45 y la invasión en los ensayos de migración e invasión Transwell inducida por IL-1β
activación de JNK no participa en la regulación de la migración celular y la invasión GA
. es bien conocido que los miembros de MAPK juegan un papel importante en la regulación de las respuestas celulares a las citocinas y el estrés, y P38 y JNK son los principales miembros de la familia MAPK que regulan las vías de señalización de IL-1β. Para entender si JNK también se asocia con la migración de células GA inducida por IL-1β y la invasión, se realizó el análisis de transferencia Western para detectar la activación de JNK en respuesta a IL-1β. Como mostrado en la Figura 5A, p-JNK se detectó en ambos AGS y líneas celulares MNK-45 después de la estimulación con IL-1β de 30 min. Sin embargo, los resultados de ambos ensayos de migración y de invasión Transwell mostraron que el aumento de la migración y la invasión de ambos AGS y 45-MKN células inducidas por la estimulación de IL-1β no fueron atenuadas por JNK desmontables con siRNA ni atenuadas por vía de JNK inhibición con SP600125 inhibidor de JNK ni (Figura 5B a D); El número de células migradas y invasivos casi no mostró cambio antes o después de la transfección con siRNA contra JNK (P > 0,05) o con o sin pre-tratados con SP600125 inhibidor de JNK (P > 0,05). JNK no se asoció con promovida por IL-1β la migración celular y la invasión GA haber sido verificado aún más por la AP-1 ensayo indicador de luciferasa. A medida que la quinasa aguas arriba de c-jun (otro componente importante de AP-1), JNK es capaz de activar AP-1, y la activación de AP-1 por JNK está estrechamente relacionada con la función de JNK en la regulación de varios reacción celular incluyendo el cáncer la migración celular y la invasión [22]; sin embargo, inducida por IL-1β la activación de AP-1 en ambos AGS y MKN-45 células no se inhibió por JNK siRNA ni SP600125 inhibidor de JNK ni (Figura 5E). En conjunto, estos datos indican fuertemente que el aumento de la migración y la invasión GA promovido por la IL-1β no están regulados por JNK. Figura 5 La activación de JNK no está asociada con la migración de células GA inducida por IL-1β y la invasión. A: p-JNK fue detectado por 30 minutos de estimulación con IL-1β en AGS y líneas de células MKN-45. B: Transfección de JNK siRNA derribado expresión JNK tanto en las dos líneas celulares de GA. C-D: El tratamiento de células GA con IL-1β aumento de la migración celular y la invasión in vitro; estos efectos no fueron inhibidas por JNK siRNA ni el SP600125 inhibidor de la vía de JNK. ** P Hotel < 0.05 células siRNA transfectadas vs. scramble estimuladas con IL-1β; △△ P Hotel < 0,05 frente a células no transfectadas (células de tipo salvaje) estimuladas con IL-1β; ## O ●● se detectó ninguna diferencia significativa entre los dos grupos (P Hotel > 0,05). Barras indican el ± desviación estándar media del número de células por campo de visión en los ensayos de migración e invasión. D: imágenes de microscopio de luz representativos de AGS y la migración de las células MKN-45 y la invasión en los ensayos Transwell. E: Tanto las células fueron transfectadas con GA AP-1 plásmido reportero o AP-1 plásmido reportero junto con scramble siRNA o JNK siRNA. AP-1 actividad del gen indicador de luciferasa se incrementó significativamente por la estimulación de IL-1β en ambos AGS-45 y las células MKN; estos efectos no fueron inhibidas por JNK siRNA ni inhibidas por el inhibidor de JNK SP600125 ninguno. ** P Hotel < 0,05 frente a control siRNA (siRNA scramble) + 1 AP-luc células transfectadas estimuladas con IL-1β; ΔΔP Hotel < 0.05 vs. 1 AP-luc células transfectadas estimuladas con IL-1β; ## O ●● se detectó ninguna diferencia significativa entre los dos grupos (P Hotel > 0,05). la actividad de luciferasa relativa se normalizó a B-gal.
fosfo-p38 está regulada positivamente y se correlaciona con la expresión de IL-1β, MMP2, MMP9 y c-fos en los tejidos humanos GA México La expresión de p-p38 en una serie de tejidos 105 GA y los tejidos gástricos no neoplásicas emparejadas fue examinado por inmunohistoquímica (IHC). De las muestras 105 de cáncer, 53 casos de tejidos GA (50,48%) exhibidos sobre-expresión de p-p38 en comparación con los tejidos gástricos no neoplásicas pareadas (P
< 0,05; Figura 6A). Expresión positiva p-p38 se observó con frecuencia tanto en el citoplasma de la célula GA y el núcleo. Figura 6 p38 fosforilada se sobreexpresa en GA humano, y la expresión de p-p38 se correlaciona positivamente con la IL-1β, MMP2, MMP9 y la expresión de c-fos en los tejidos GA. A: La sobreexpresión de p-p38 se observa con frecuencia en los tejidos GA, en comparación con los tejidos gástricos no neoplásicas pareadas. a, P-p38 no se detectó o sólo se expresa débilmente en los tejidos gástricos no neoplásicas. B a E: diferentes intensidades de expresión de p-p38 positivo en los tejidos GA. B: Expresión de p-p38 correlacionó positivamente con la IL-1β, MMP2, MMP9, y la expresión de c-fos en los tejidos humanos GA. muestra de tejido GA exhibiendo más fuerte expresión de IL-1β y más fuerte p-p38, MMP2, MMP9 y la expresión de c-fos; y más débil expresión de IL-1β y débil p-p38, MMP2, MMP9 y la expresión de c-fos. C: La suma de las puntuaciones de intensidad de la tinción positiva de IHC para p-p38. ** P Hotel < . 0,05 vs. emparejado tejidos gástricos no neoplásicas
asociaciones significativas se observaron entre la sobreexpresión de p-p38 en edad de los pacientes (< 50 o ≥ 50 años), el sexo, el tamaño del tumor (< 3 cm o ≥ 3 cm), el tipo histológico, o el grado de diferenciación. Sin embargo, la sobreexpresión de p-p38 muestran significativamente relacionado con la metástasis de los ganglios linfáticos (P
< 0,05), y la invasión más allá de la serosa (P
< 0,05). Estos datos sugieren que la sobreexpresión de p-p38 se asocia con metástasis en GA humano.
Como mostrado en la Figura 6B, la expresión de p-p38 mostraron buena correlatividad con los niveles de IL-1β, MMP2, MMP9 y AP-1 (c-fos) en el tejido GA, y una correlación significativa entre la elevada expresión de p-p38 y la regulación positiva de IL-1β, MMP2, MMP9 y c-fos en el tejido GA (r = 0,72, p < 0,01; r = 0,63, se detectó 0,01) cuando se analizaron por el método de Spearman México La suma puntuaciones de intensidad de la tinción positiva de IHC para p-p38 en ambos 105 casos de GA; p < 0,01; r = 0,58, p < 0,05 y r = 0,69, p <. tejidos y tejidos gástricos neoplásicas no emparejados fueron exhibidos en la Figura 6C.
ensayo de invasión en ratones desnudos
MKN-45 células transfectadas con un ARNsi o p38 siRNA revueltos se inyectaron en la vena de la cola de ratones BALB /c nu /nu ratones; IL-1β o PBS también se inyectaron intraperitonealmente desde el día de las células se inyectaron durante 14 días. Grupo 1 fueron inyectados con PBS y revueltos siRNA transfectadas MKN-45 células; grupo 2 fueron inyectados con IL-1β y revueltos siRNA transfectadas MKN-45 células; y el grupo 3 fueron inyectados con transfectadas con siRNA p38 45-MKN células y IL-1β
A los 45 días después de la inyección de las células, todos los animales. (6/6; 100%) en el grupo tratado con IL-1β se había desarrollado metástasis pulmonares (Figura 7A) a D (grupo 2; promedio de focos metastásicos en 6 de las secciones de pulmón fue 14 por pulmón). Por el contrario, un menor número de animales (2 /6,33.33%) en el grupo de control que no fueron inyectados con IL-1β habían desarrollado metástasis pulmonares (grupo 1; media de 6 metástasis en 6 de las secciones de pulmón por pulmón). Considerando que, sólo dos animales del grupo de siRNA p38 más IL-β tratados desarrollaron metástasis de pulmón y el número de metástasis de pulmón en este grupo fue significativamente menor (grupo 3, promedio de 4 metástasis en 6 de las secciones de pulmón por pulmón) y significativamente menor que la del grupo correspondiente tratados con IL-1β (grupo 2) (Figura 7A a D). Figura 7 la estimulación de IL-1β aumenta el potencial metastásico de las células GA in vivo a través de un mecanismo dependiente de p38. R: Las metástasis pulmonares representativos forman en diferentes ratón grupo. B: Bares indican el número de animales desarrolló metástasis pulmonares. C: Los resultados representativos de tinción HE de metástasis pulmonares. D: Bares indicaron la ± SD media del número de focos metastásicos en 6 de las secciones de pulmón /por pulmón en ratones que habían desarrollado metástasis pulmonares. △△ P Hotel < 0,05 frente inyectados con células transfectadas siRNA scramble más estimulación de IL-1β. E: análisis de RT-PCR de p38, MMP2, MMP9
y c-fos
la expresión de ARNm en las metástasis pulmonares de diferentes ratones. IHC análisis de p-p38, MMP2, MMP9 y expresión de la proteína c-fos en las metástasis pulmonares;: F IL-1β inducida elevada p-p38, MMP2, MMP9 y expresión de la proteína c-fos.
Para confirmar aún más si p38, MMP2 y MMP9 están involucrados en la IL-1β inducida por metástasis de pulmón de células GA, y determinar si este proceso está regulado por AP-1, los niveles de expresión de ARNm de p38, MMP2, MMP9
y c-fos
(un componente clave de AP-1) en el pulmón metastásico se cuantificaron por RT-PCR, y p-p38 , MMP2, MMP9 y expresión de la proteína c-fos en secciones de pulmón fueron examinadas usando IHC. Como se muestra en la Figura 7 E y F, los niveles de expresión de p-p38, MMP2, MMP9 y c-fos en los focos metastásicos pulmonares fueron elevados en respuesta a IL-1β. La activación de p38 y la expresión de ARNm o proteína de los niveles de p38, MMP2, MMP9 y c-fos fueron más bajos en la metástasis formados por las células transfectadas con siRNA p38 plus grupo-β tratados con IL (grupo 3) o en el grupo de control (grupo 1 ) en comparación con las metástasis formadas por scramble siRNA más grupo tratado con IL-β (grupo 2) (Figura 7E y F). En conjunto, los datos in vivo confirma además que inducida por IL-1β metástasis de las células GA está mediada por la señalización de p38 a través de la regulación positiva dependiente de AP-1 de MMP2 y MMP9.
Discusión
Un número de estudios han sugerido que la IL 1β es capaz de activar p38 y JNK [11, 12], y p38 y JNK juegan un papel importante en la migración de células de cáncer y la invasión [14, 23-26]. Por lo tanto, la hipótesis de que la IL-1β puede contribuir a la invasión celular y la metástasis GA a través de la activación de las vías de p38 y JNK. Para investigar esta posibilidad, se evaluó la capacidad de la IL-1β para activar p38 y JNK, y promover la migración y la invasión de las células GA. Nuestros resultados mostraron que la IL-1β podría activar tanto p38 y JNK, y aumentar GA migración celular y la invasión, y que estos efectos podrían ser inhibidos por p38 siRNA o el inhibidor de p38 SB 202190, pero no JNK siRNA o SP600125 inhibidor de JNK. Esta es la primera demostración de que la IL-1β puede inducir la migración celular y la invasión GA través de la activación de p38; sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes en la que la señalización de p38 IL-β mediada está regulada durante la carcinogénesis gástrica siguen siendo en gran medida desconocido.
un posible mecanismo por el que p38 podría aumentar la invasión y la migración de las células cancerosas es mediante la elevación de los niveles de MMPs [ ,,,0],27]. Está bien establecido que la secreción de MMP con la capacidad de degradación de la matriz extracelular (ECM) es una característica de las células cancerosas metastásicas [28]. MMP2 y MMP9 son dos de las MMP más bien caracterizados y están estrechamente asociados con el cáncer de invasión y metástasis debido a su fuerte actividad proteolítica de la ECM [29]. Presentamos aquí también por primera vez que el mecanismo molecular probable por el cual IL-1β promueve la migración celular y la invasión GA puede implicar la IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & MMP9 vía de señalización. Hemos demostrado que tanto MMP2 y MMP9 se upregulated en las células GA en respuesta a la estimulación de IL-1β; estos efectos fueron inhibidos por siRNAs contra p38, España MMP2 o MMP9
, el SB202190 inhibidor p38, y el inhibidor de la MMP-2/9 del SIN. Además, desmontables de MMP2
o MMP9
usando siRNAs, o la inhibición de MMP2 actividad /9 usando bips, disminuyó significativamente la migración de células GA inducida por IL-1β y la invasión. Como una proteína serina /treonina quinasa, p38 es capaz de inducir la activación del factor de transcripción AP-1 [30]. Hemos encontrado además que la inducida por IL-1β, la regulación positiva de p38 mediada de MMP2 y MMP9 eran AP-1-dependiente. IL-1β sólo fue capaz de activar la transcripción de MMP9
regiones promotoras que contienen sitios de AP-1, y estos efectos fueron atenuadas por p38 siRNA y el SB202190 inhibidor p38. activación Además, inducida por IL-1β de transcripción AP-1 dependiente fue inhibida por siRNA p38.
fosfo-p38 (p-p38), la forma activada de p38, podría ser detectada en casi 50% de la GA humana muestras de tejido ensayadas por el ensayo de IHC, y la expresión de p-p38 se asoció significativamente con metástasis en los ganglios linfáticos y la invasión más allá de la serosa en pacientes con GA. Por otra parte, la expresión de IL-1ß correlacionó positivamente con la expresión de p-p38, MMP2, MMP9 y c-fos en las muestras GA clínicos. Por otra parte, en los datos in vivo del ensayo de metástasis demostraron que la formación de metástasis de pulmón focos por las células de Ga, y p38 /
p-p38, MMP2, MMP9 y ARNm y proteínas expresión de c-fos en los focos metastásicos pulmonares fueron elevados por IL-1β, y reducido por la inyección de las células transfectadas con siRNA p38. En conjunto, estos datos sugieren fuertemente que la migración de células GA inducida por IL-1β y la invasión se producen a través de la activación de la vía de señalización de p38 que conduce a la AP-1 de activación y regulación al alza de MMP2 y MMP9. Por lo tanto, p38 juega un papel esencial en la metástasis inducida por IL-1β en GA.
JNK es otro MAPK importante estar bien sabe que juega un papel importante en la regulación de la señalización de IL-1β en varias células diferentes [14, 31]. Sin embargo, en este estudio, JNK se encontró que era no estar involucrados en la regulación de la migración celular GA inducida por IL-1β y la invasión. JNK siRNA y el inhibidor de JNK no atenúan IL-1β induce la migración celular y la invasión GA, ni atenúan la activación de AP-1 inducida por IL-1β. la migración de células GA Por lo tanto, promovido por IL-1β y la invasión están regulados por p38, pero no por JNK.
En resumen, hemos identificado por primera vez que la IL-1β es funcionalmente implicados en la regulación de la metástasis en GA a través la activación de p38. Este mecanismo molecular implica AP-1 dependiente de la regulación al alza de p38 mediada por tanto de MMP2 y MMP9; y este estudio sugiere que la IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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