Az IL-1β-indukált aktiválását a p38 elősegíti metasztázis gyomor adenokarcinóma keresztül fokozza a AP-1 /c-fos, MMP2 és MMP9

IL-1β-indukált aktiválását a p38 elősegíti metasztázis gyomor adenokarcinóma keresztül fokozza a AP-1 /c-fos , MMP2 és MMP9
Abstract
alapon
interleukin-1β (IL-1β) szerepet játszik a progresszió gyomor adenokarcinóma (GA); Azonban a molekuláris hatásmechanizmusa az IL-1β a GA rosszul jellemzi. P38 és JNK a fő MAPK család tagjai, amelyek szabályozzák az IL-1β jelátviteli. Itt, megvizsgáltuk a szerepe mind a p38 és JNK az IL-1β indukált GA sejtmigráció, invázió és metasztatikus potenciálját.
Módszerek
A hatása az IL-1β indukált p38 és JNK aktiváció GA sejtekben meghatároztuk in vitro Transwell migrációs és behatolás vizsgálatok a MKN-45 és AGS-sejteket, vagy egy in vivo metasztázis assay csupasz egerekben. Az IL-1β indukált p38 jelátviteli útvonal azzal jellemezve, GA sejtekben. Aktiválása az IL-1β /p38 jelátviteli útvonal is értékelték az emberi elsődleges GA szövetek immunhisztokémiai. Katalógusa Eredmények katalógusa IL-1β-indukált p38 fokozott GA-migráció és invázióját in vitro és támogatni a metasztatikus potenciálja GA-sejtek in vivo; ezek a hatások mérsékelhetők p38 siRNS-sel vagy a p38 inhibitor SB202190. MMP2 vagy MMP9 siRNS és a MMP2 /9 inhibitor határállomások is gátolta az IL-1β indukált GA-migráció és invázió in vitro. Az IL-1β-indukált p38 aktiváció jelentősen emelkedett MMP-2 és MMP9 mRNS és fehérje expressziója és aktivitása. A luciferáz riporter méréseink igazolták, hogy az aktivátor protein-1 (AP-1) és az AP-1-kötőhelyek az MMP9 katalógusa promoter (-670 /MMP9) aktiváltunk IL-1β indukált p38 aktiváció. Foszforilált p38 szignifikánsan emelkedett a humán GA szövetekben (szemben a kiegyenlített, nem daganatos szövetek), és szignifikáns összefüggést a nyirokcsomó metasztázisok és invázió túl savóshártyát. Expression of foszfo-p38 szignifikánsan korrelált az IL-1β, MMP2, MMP9, és a c-Fos expresszió mind humán GA szövetek és GA sejt áttétek a tüdőben csupasz egerekben. Az IL-1β is volt, amely képes aktiválni a JNK a GA sejteket, de aktiválás a JNK nem járt együtt a GA-migráció és invázió. Ennélfogva az IL-1β-indukált migrációs és invázió GA sejteket által szabályozott p38, de nem a JNK.
Következtetések
IL-1β indukált p38 aktiváció és az IL-1β /p38 /AP-1 ( c-fos) /MMP-2 & MMP9 reakcióút fontos szerepet játszanak a metasztázis GA; ez az útvonal lehet, hogy egy új terápiás célpont GA.
kulcsszavak
IL-1β p38 Gyomor adenocarcinoma MMP2 és MMP9 AP-1 Metastasis alapon
Egyre több bizonyíték jelzi, hogy a daganatok támogatják és fenn a gyulladásos jeleket a tumor mikrokörnyezet, és a tumor mikrokörnyezet fontos szerepet játszik a támogatása rák [1, 2]. A citokinek, különösen a citokinek által tumorsejtek, alapvető összetevői a tumor mikrokörnyezetében. A tumor nekrózis faktor alfa (TNF-α), az interleukin-1β (IL-β) és az IL-6 a leginkább jól jellemzett citokinek, amelyek kimutatták, hogy szorosan kapcsolódik a rák progressziójának. Sok tanulmány kimutatta, hogy a gyulladás által indukált citokinek fontos szerepet játszik a fejlesztés a gyomorrák [3]. Jól megalapozott, hogy a fertőzések, különösen azok által indukált Helicobacter pylori,
képesek kiváltani gyomornyálkahártya gyulladásos válaszokat, ami fokozza a IL-1β, ami viszont elősegíti a gyulladás-asszociált karcinogenezis [4]. Azonban a mögöttes molekuláris mechanizmusok szerepére az IL-1β jelátviteli gyomor karcinogenezis marad nagyrészt ismeretlen, és jelenleg az érdeklődés.
P38 tagja a mitogén-aktivált protein kináz (MAPK) szupercsalád. A MAPK jelátviteli utak már jól vizsgálták, és amely legalább három szupercsaládba a MAPK, amelyek szabályozzák a különböző sejtes tevékenység [5]. Köztudott, hogy a p38 MAPK képes szabályozó sok celluláris reakciók citokinek és a stressz, beleértve az IL-1β [6]; Azonban a legújabb adatok azt mutatják, hogy a p38 is szorosan kapcsolódik a fejlesztés különböző típusú emberi rák keresztül a képessége, hogy felemelje a rákos sejt migrációt és inváziót stimulusok, beleértve a gyulladásos faktorok [6]. Továbbá, a p38 is részt vesz a szabályozás a sejt-differenciálódás és apoptózis. Négy izoformja p38 azonosítottak eddig: p38-α, p38-β, p38-γ, és a p38-δ [7]. Bár az aminosav szekvenciája a következő p38 MAPK többnyire azonosak, az expressziós mintázata az egyes izoformák változik [8]. P38-α a fő p38 MAPK és expresszálódik mindenütt, a p38-β elsősorban az agyban expresszálódik, míg a p38γ bőségesen fejezik vázizomban [9] és a p38-δ főleg kifejezve endokrin mirigyekben [10]. Számos tanulmány azt is kimutatták, hogy a p38 részt vesz az IL-1β jelátviteli kaszkádok egy sor sejttípus, különösen egér embrionális fibroblaszt (MEF) sejtek és makrofágok sejtek [11, 12]; Azonban nagyon keveset tudunk a funkció az IL-1β-aktivált p38 gyomorrákban.
a c-Jun N-terminális kináz (JNK) egy másik MAPK család tagja, amely szintén jól ismert, hogy fontos szerepet játszanak a szabályozás Az IL-1β jelátviteli [13]. Amellett, hogy a részvétel rendelet gyulladásos jelátviteli út, a JNK végez számos más fontos celluláris funkciókat, beleértve a sejtnövekedés szabályozásában, differenciálódás, túlélés és az apoptózis. Továbbá, a legutóbbi vizsgálatok azt mutatják, hogy a JNK gyakran overexpresszált különböző rákos szövetekben, és up-regulációját JNK lehet szorosan kapcsolódik a rák terjedését [14]; Azt azonban, hogy a JNK részt vesz a szabályozás az IL-1β indukált gyomorrák sejt migrációs és behatolás nagymértékben ismeretlen maradt.
gyomor adenokarcinóma (GA) a leggyakoribb daganatos tumor a gyomor; Ezért összpontosított GA ebben a vizsgálatban. Itt azt vizsgáltuk, az aktiválás a p38 és JNK válaszul az IL-1β, és azok hatását a IL-1β indukált metasztatikus potenciálját GA sejtek in vitro vagy in vivo.
Továbbá, a kifejezés a foszfo-p38 (P- p38) a GA, a kapcsolata a klinikai és patológiai jellemzői GA, és a korreláció az IL-1β és p-p38 vizsgáltuk humán paraffinba ágyazott GA szövetek immunhisztokémiai. Végül, mi is jellemzi a molekuláris mechanizmusok, amelyek szabályozzák az IL-1β indukált p38-közvetített metasztatikus potenciálját GA sejteket.
Eredmények
IL-1β-indukált aktiválását a p38 elősegíti GA sejtmigrációt és invázióját in vitro
Először azt vizsgáltuk, hogy az IL-1β volt képes aktiválni a p38 jelátvitel GA sejtekben. Amint az 1. ábrán látható, aktiválása a p38 (p-p38) kimutatható volt mindkét GA sejtvonalban (AGS és MKN-45 sejtek) való kezelés után az IL-1β-on 30 percig; Az IL-1β-indukált aktiválását a p38 gátolta a p38-inhibitor SB202190 (1a ábra). 1. ábra az IL-1β elősegíti GA sejt migrációs és behatolás aktiválásával p38. A: Western blot megerősítette, hogy a p-p38 lehetne által kiváltott 30 perc stimuláció IL-1β AGS és MKN-45 sejtvonalak; az aktiválás a p38 az IL-1β-t gátolta a p38-inhibitor SB202190. B: transzfekciója p38 siRNS leütött a p38-expresszió mind a két GA sejtvonalakon. A C-F: kezelése GA-sejtek IL-1β fokozott sejt migrációs és behatolás in vitro; ezek a hatások gátolta a p38 siRNS vagy a p38 útvonal inhibitor SB202190. ** P katalógusa < 0,05 vs. tülekedés siRNS (kontroll siRNS) -transfected stimulált IL-1β; △△ P katalógusa < 0,05 vs. nem transzfektált sejtekben (vad típusú sejtek) stimuláltuk IL-1β. Sávok jelzik az átlag ± SD sejtek száma látómező (× 400-szoros nagyítás), a migrációs és behatolás vizsgálatokban. G: Reprezentatív fénymikroszkópos képei AGS és MKN-45-migráció és invázió a Transwell vizsgálatokban. Katalógusa P38 elősegítheti a migrációs és behatolás különböző rákos sejtek [15]. Annak vizsgálatára, hogy az IL-1β elősegítheti a migrációs és invázió GA sejtek keresztül aktiváló p38 jeltovábbítási, GA transzfektált sejtek egy kódolt siRNS (kontroll siRNS-t), vagy a p38 siRNS, vagy Ga-sejteket előkezeljük vagy a nélkül a p38 útvonal inhibitor SB202190 voltak stimulált IL-1β. Transzwell migrációs és behatolás vizsgálatokban kimutatták, hogy az IL-1β stimuláció növelte a migrációs és behatolás mindkét AGS és MKN-45 sejtek; Azonban az IL-1β indukált GA sejt migrációs és behatolás szignifikánsan mérsékelhetők kiütése p38 alkalmazásával siRNS (1B ábra A-G), vagy előkezelés SB202190 (1C-G). Együttvéve ezek az adatok arra utalnak, hogy az IL-1β mozdítani GA sejt migrációs és behatolás által közvetített p38.
IL-1β-indukált aktiválását a p38 upregulálja MMP2 és MMP9 expressziója és aktivitása a GA sejtekben
MMP2 és MMP9 van kimutatták, hogy a fontos szerepet játszanak a ráksejtek terjedését és áttétét. [16] Vizsgálni, hogy a MMP-2 és MMP9 is részt vesz az IL-1β-indukált p38 által szabályozott metasztatikus potenciálját GA-sejtek, RT-PCR, immunhisztokémia és konfokális mikroszkópia, és zimográfia vizsgálatot végeztünk annak megállapítására, MMP2 és MMP9 expressziója és aktivitása a GA sejtvonalak transzfektált kontroll siRNS vagy p38 siRNS, vagy előkezelt vagy anélkül a p38 inhibitor SB202190, és ezután vagy anélkül IL-1β. Ahogy az várható volt, az MMP2 és MMP9 expressziója és aktivitása emelkedett volt, válaszul az IL-1β kezelés (2A ábra a C). Kiütése p38 alkalmazásával siRNS, vagy előkezelés a p38 inhibitor SB202190 szignifikánsan csökkentette az IL-1β-indukált MMP2 és MMP9 mRNS expressziója és aktivitása egyaránt GA sejtvonalban (2A ábra a C). 2. ábra Az IL-1β serkenti MMP2 és MMP9 expressziója és aktivitása aktiválásával p38. A: RT-PCR elemzés azt mutatta, hogy az MMP2
és MMP9
mRNS serkentett mind AGS és MKN-45 sejtek a kezelésre adott válasz az IL-1β; ezt a hatást blokkolja p38 siRNS-sel vagy a p38 inhibitor SB202190. B: számszerűsítése expressziójának MMP2
és MMP9
mRNS normalizált GAPDH
mRNS. ** P katalógusa < 0,05 vs. Scramble siRNS-transzfektált sejtekkel stimulált IL-1β. △△ P katalógusa < 0,05 vs. nem transzfektált sejtekkel stimulált IL-1β. C: A gél zimográfia azt mutatták, hogy az MMP2 és MMP9 aktivitás fokozódik mind AGS és MKN-45 sejtek a kezelésre adott válasz az IL-1β; ezt a hatást blokkolja p38 siRNS-sel vagy a p38 inhibitor SB202190. D: immuncitokémiai festési és konfokális mikroszkópiával megerősítette, hogy az IL-1β megnövekedett aktiválódását P38 (piros), és MMP2 és MMP9 (zöld) expressziót MKN-45 GA-sejtek; ezek a hatások által blokkolt p38 siRNS vagy p38-inhibitor SB202190.
Immuncitokémia és konfokális mikroszkópiával kimutatták, hogy a p-p38-t gyengén expresszálódik a kezeletlen MKN-45 sejtek, amelyek szintén kifejezte nagyon alacsony szinten MMP2 és MMP9. Miután stimulációt az IL-1β, szignifikánsan megemelkedett p-p38, MMP2 és MMP9 detektáltunk a MKN-45-sejtek; ezek az IL-1β-indukált hatások gátolta a p38 siRNS és SB202190 (2D, ábra). Összefoglalva, ezek az eredmények erősen arra utalnak, hogy az IL-1β keresztül p38-indukált invázióját és migrációját GA sejtek közvetíti a képességét, p-p38 upregulate MMP2 és MMP9 expressziója és aktivitása.
Az IL-1β-indukált aktiválását p38 upregulálja MMP2 és MMP9 aktiválásával AP-1-függő transzkripciót GA sejtekben
jól dokumentált, hogy a transzkripciós faktor aktivátor protein-1 (AP-1) expresszióját szabályozzák MMP2 és MMP9 [17], és az aktiválás p38 képes szabályozni az AP-1 aktiválás [18]. Annak érdekében, hogy vizsgálja meg, hogy az IL-1β indukált p38-közvetített megemelkedett MMP2 és MMP9 expressziója és aktivitása függ az AP-1, az aktiválás az AP-1-függő transzkripciós vizsgáltuk GA kezelt sejtek vagy anélkül IL-1β, hogy jelenlétében vagy hiányában a p38 gátlás segítségével egy AP-1 luciferáz riporter vizsgálat. Az IL-1β növelte aktivitását az AP-1, mind a GA sejtvonalban (3A ábra); Azonban gátlása p38 alkalmazásával p38 siRNS vagy előkezelt sejtek p38-inhibitor SB202129 csökkentette az IL-1β indukált AP-1 aktivitás mindkét GA sejtvonalban (3A ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az IL-1β indukált, p38 által közvetített kifejezése MMP2 és MMP9 függ az AP-1. 3. ábra Az IL-1β aktiválja az AP-1 aktivitás révén p38 útvonal. A: Mindkét GA sejteket transzfektáltunk az AP-1 riporter plazmid vagy az AP-1 riporter plazmiddal együtt Scramble siRNS vagy p38 siRNS. AP-1 luciferáz riporter gén aktivitás szignifikánsan emelkedett IL-1β stimuláció mindkét AGS és MKN-45-sejtek; ezek a hatások jelentős mértékben gátolta a p38 siRNS dózis-függő módon és szintén gátolta a p38 inhibitor SB202190. ** P katalógusa < 0,05 vs. kontroll siRNS (Scramble siRNS-t) + AP-1 luc-transzfektált sejtekkel stimulált IL-1β; ΔΔP katalógusa < 0,05 vs. AP-1 luc-transzfektált sejtekkel stimulált IL-1β; relatív luciferáz aktivitást normalizáltuk a B-gal. B: Az IL-1β indukált p38-közvetített aktiválását a MMP9 katalógusa promoterek függ az AP-1-kötőhelyek. ** P katalógusa < 0,05 vs. transzfektált -670 /MMP9 + kontroll siRNS stimulált IL-1β; ΔΔP katalógusa < 0,05 vs. transzfektált -670 /MMP9 stimulált IL-1β; ▼▼ P katalógusa < 0,05 vs. transzfektált -570 /MMP9 stimulált IL-1β; relatív luciferáz aktivitást normalizáltuk a b-gal.
Annak érdekében, hogy tovább igazoljuk a szerepét az AP-1 az IL-1β indukált p38 útvonal, a luciferáz riporter gént tartalmazó vektorokkal az AP-1 helyek a MMP9 katalógusa promoter régiókat transzfektálunk a GA sejteket. Összhangban az AP-1 riporter génnel végzett vizsgálatok, a luciferáz tevékenysége a -670 /MMP9
promoter régió (amely két AP-1-kötőhelyek [-533 és -79] és egy NF-КB kötőhelyet [-600 ] [19-21]) jelentősen növelte az IL-1β-stimulált sejtek (3B ábra). Transzfekció a sejtek p38 siRNS vagy előkezelt sejtek p38 inhibitor SB202129 csökkentette az IL-1β indukált luciferáz aktivitást a -670 /MMP9
promoter riporter gén (3B ábra). A luciferáz aktivitását MMP9 katalógusa promoter (-571 /MMP9 katalógusa) nem változtatta meg törlését NFkB-kötőhely (-600). Továbbá, amikor az AP-1 helyeket (-79 és -533) az MMP9 katalógusa promoter törölték (-73 /MMP9
mutánsok), a luciferáz aktivitást a riporter gén jelentősen csökkent, összehasonlítva a megfelelő vad típusú kontroll riporter gén (3B ábra). Együttesen ezek az adatok erősen arra utalnak, hogy az IL-1β indukálja aktiválása a p38 jelátviteli útvonalat, amely elősegíti az invázió és migrációját GA sejtek keresztül az AP-1-függő túlszabályzását MMP2 és MMP9 expressziója és aktivitása.
Kiütése MMP2 vagy MMP9 csökkenti az IL-1β-indukált migrációs és behatolás a GA sejtekben
Annak további igazolására, hogy az IL-1β indukált GA sejt migrációs és behatolás társított túlszabályzását MMP2 és MMP9, AGS és MKN-45 sejteket transzfektáltunk siRNS-ek ellen MMP2
vagy MMP9
, vagy előkezelt vagy anélkül MMP2 /MMP9 inhibitor határállomások, majd stimulált IL-1β. A Transwell migrációs és behatolás vizsgálatokban kimutatták, hogy az IL-1β-indukált migrációs és invázió GA sejtek szignifikánsan csökkentette által kiütése MMP2 katalógusa vagy MMP9,
vagy előkezelés határállomások, kontroll sejtekhez viszonyítva (4a ábra a C). Ezért upregulációját MMP2 és MMP9 alapvető fontosságú az IL-1β indukált GA-migráció és invázió. 4. ábra kiütése MMP2 vagy MMP9 vagy előkezelés az MMP2 /9 inhibitor határállomások gátolja az IL-1β indukált GA-migráció és invázió in vitro. A: RT-PCR megerősítette a hatékonyságát a MMP2 vagy MMP9 siRNS, ami jelentősen csökkentette az MMP2 katalógusa vagy MMP9
kifejezés, illetve akár több mint 75%. B: Az IL-1β fokozott GA-migráció és invázióját in vitro; ezek a hatások gátolta MMP2 vagy MMP9 siRNS vagy az MMP-2/9 inhibitor határállomások. ** P katalógusa < 0,05 vs. tülekedés siRNS (kontroll siRNS) -transfected stimulált IL-1β. Rudak az átlag ± SD-szeresére változik normalizáltuk kontroll csoport a migrációs és behatolás vizsgálatokban. C: Reprezentatív fénymikroszkópos képei AGS és MKN-45 sejt migrációs és behatolás a Transwell migrációs és behatolás vizsgálatokban.
IL-1β-indukált aktiválását JNK nem vesz részt a szabályozásában GA-migráció és invázió katalógusa jól ismert, hogy a tagok a MAPK fontos szerepet játszanak a szabályozásában celluláris reakciók citokinek és a stressz, és a p38 és JNK a fő MAPK család tagjai, amelyek szabályozzák az IL-1β jelátviteli. Ahhoz, hogy megértsük, hogy a JNK is társult az IL-1β indukált GA-migráció és invázió, Western-blot analízist végeztünk, hogy észleli a aktiválás a JNK válaszul az IL-1β. Amint kiállítva 5A ábra, p-JNK kimutatható volt mindkét AGS és MNK-45 sejtvonalak stimuláció után az IL-1β-on 30 percig. Az eredmények azonban mind a Transwell migrációs és behatolás vizsgálatok azt mutatták, hogy a megnövekedett migrációs és behatolás mindkét AGS és MKN-45 sejtek által indukált IL-1β stimuláció nem csillapítható knockdown JNK siRNS-sel sem legyengített gátlásával JNK útvonal a JNK inhibitor SP600125 sem az (5B, ábra D); Száma migrált és az invazív sejtek szinte nem mutatta, változás előtt vagy után transzfekció elleni siRNS JNK (P 0,05) vagy vagy anélkül előkezeljük JNK inhibitor SP600125 (P 0,05). JNK nem járt együtt az IL-1β-elősegítette a GA-migráció és invázió miután tovább igazolták az AP-1 luciferáz riporter vizsgálat. Ahogy az upstream kináz c-Jun (egy másik fontos eleme az AP-1), a JNK képes aktiválni az AP-1 és az aktiváló az AP-1 által JNK szorosan összefügg a JNK funkcióját szabályozására különböző sejt reakció, beleértve a rákot sejt migrációs és behatolás [22]; Azonban az IL-1β indukált AP-1 aktiváció mindkét AGS és MKN-45 sejtekben, nem volt gátolható a JNK siRNS sem JNK inhibitor SP600125 sem az (5E ábra). Minden együtt, ezek az adatok erősen arra utalnak, hogy a megnövekedett GA migrációs és behatolás által támogatott az IL-1β nem szabályozza a JNK. 5. ábra Az aktiválás a JNK nem jár az IL-1β indukált GA-migráció és invázió. A: p-JNK detektáltuk 30 perc stimuláció IL-1β AGS és MKN-45 sejtvonalak. B: transzfekciója JNK siRNS leütött JNK-expresszió mind a két GA sejtvonalakon. C-D: Kezelés GA-sejtek IL-1β fokozott sejt migrációs és behatolás in vitro; ezeket a hatásokat nem gátolta a JNK siRNS sem a JNK útvonal inhibitor SP600125. ** P katalógusa < 0,05 vs. Scramble siRNS-transzfektált sejtekkel stimulált IL-1β; △△ P katalógusa < 0,05 vs. nem transzfektált sejtekben (vad típusú sejtek) stimuláltuk IL-1β; ## Vagy ●● nincs jelentős különböző e két csoport között volt kimutatható (p
> 0,05). Bars jelzett az átlag ± SD sejtek száma látómező a migrációs és behatolás vizsgálatokban. D: Reprezentatív fénymikroszkópos képei AGS és MKN-45 sejt migrációs és behatolás a Transwell vizsgálatokban. E: Mindkét GA sejteket transzfektáltunk az AP-1 riporter plazmid vagy az AP-1 riporter plazmiddal együtt Scramble siRNS vagy JNK siRNS. AP-1 luciferáz riporter gén aktivitás szignifikánsan emelkedett IL-1β stimuláció mindkét AGS és MKN-45-sejtek; ezeket a hatásokat nem gátolta a JNK siRNS sem gátolja a JNK inhibitor SP600125 sem. ** P katalógusa < 0,05 vs. kontroll siRNS (Scramble siRNS-t) + AP-1 luc-transzfektált sejtekkel stimulált IL-1β; ΔΔP katalógusa < 0,05 vs. AP-1 luc-transzfektált sejtekkel stimulált IL-1β; ## Vagy ●● nincs jelentős különböző e két csoport között volt kimutatható (p
> 0,05). Relatív luciferáz aktivitást normalizáltuk a b-gal.
Phospho-p38 felülszabályozott, és korrelál az IL-1β, MMP2, MMP9 és c-fos humán GA szövetekben
A kifejezés p-p38 egy sorozat 105 GA szövetek és a párosított nem neoplasztikus gyomor szövetekben vizsgáltuk immunhisztokémiai (IHC). A 105 rákos minták, 53 esetben GA szövetekben (50,48%) mutatott túlzott expressziója p-p38 képest a párosított nem neoplasztikus gyomor szövetekben (p
< 0,05; 6a ábra). Pozitív p-p38 expressziót gyakran figyeltek meg mind a GA sejt citoplazmában és a sejtmagban. 6. ábra A foszforilezett p38 túlexpresszálódik emberi GA, és a kifejezés a p-p38 pozitívan korrelál a IL-1β, MMP2, MMP9 és a c-Fos expresszió GA szövetekben. A: túlexpressziója p-p38-ben gyakran megfigyelhető GA szövetekben, összehasonlítva a párosított nem neoplasztikus gyomor szövetekben. egy, a P-p38 nem volt kimutatható, vagy csak gyengén expresszálódik a nem neoplasztikus gyomor szövetekben. b e: különböző intenzitású pozitív p-p38 expresszió GA szövetekben. B: Expression of p-p38 pozitív korrelációt mutatott a IL-1β, MMP2, MMP9, és a c-Fos expresszió emberi GA szövetekben. GA szövet mintát mutatnak erősebb IL-1β expresszióját és erősebb p-p38, MMP2, MMP9 és c-fos expressziót; és gyengébb az IL-1β expresszióját és a gyenge p-p38, MMP2, MMP9 és c-fos expressziót. C: az összeg pontszámok pozitív festés intenzitását IHC p-p38. ** P katalógusa < 0,05 vs. páros nem daganatos szövetekben gyomor.
Nincs szignifikáns összefüggést figyeltek között túltermelése p-p38 a betegek életkora (< 50 vagy ≥ 50 év), a nem, a tumor mérete (< 3 cm vagy ≥ 3 cm), szövettani típus vagy osztály a differenciálás. Azonban overexpressziója p-p38 szignifikánsan összefügg nyirokcsomó-metasztázis (p
< 0,05), és invázió túl a serosa (p
< 0,05). Ezek az adatok arra utalnak, hogy overexpressziója p-p38 társul metasztázis humán GA.
Mint kiállítva 6B ábra, a kifejezés a p-p38 mutatott jó correlativity a szinteket IL-1β, MMP2, MMP9 és az AP-1 (c-fos) a GA-szövetben, és szignifikáns összefüggést a magas p-p38 expresszióját és fokozza az IL-1β, MMP2, MMP9 és a c-fos a GA szövetben (r = 0,72, p 0,01; r = 0,63, p < 0,01; r = 0,58, p < 0,05 és r = 0,69, p < 0,01) volt kimutatható, amikor elemezzük Spearman módszer.
összege pontszámok pozitív festődés intenzitását IHC p-p38 mindkét 105 eseteiben GA szövetek és párosított nem neoplasztikus gyomor szövetek voltak kiállítva ábra a 6C.
inváziós vizsgálati eljárás csupasz egerekben
MKN-45 transzfektált sejtek egy kódolt siRNS vagy p38 siRNS injektáltunk a farokvénába BALB /c nu /nu egerek; Az IL-1β vagy PBS szintén intraperitoneálisan injektáltuk a napján a sejteket injektáltunk 14 napig. 1. csoport oltottunk be PBS-sel és kódolt siRNS-transzfektált MKN-45-sejtek; 2. csoport oltottunk be az IL-1β és kódolt siRNS-transzfektált MKN-45-sejtek; és 3. csoport injektáltunk p38 siRNS-transzfektált MKN-45 sejtek és IL-1β.
45 nappal az injekció után a sejteket, az összes állat (6/6; 100% -os) az IL-1β-val kezelt csoport alakult tüdő metasztázisok (7a ábra a D) (2. csoport; átlagos metasztatikus gócok 6. tüdő szakaszok 14 per tüdő). Ezzel szemben kevesebb állatot (2 /6,33.33%) a kontroll csoportban, amelyeket nem injektált IL-1β kifejlesztett tüdő metasztázisok (1. csoport; átlagosan 6 metasztázisok 6. tüdő szakaszok per tüdő). Mivel csak két állatok a p38 siRNS + IL-β-val kezelt csoport kifejlesztett tüdő metasztázisok száma és a tüdő metasztázisok ebben a csoportban szignifikánsan alacsonyabb volt (3. csoport, átlagosan 4 metasztázisok 6. tüdő szakaszok per tüdő), és jelentősen kisebb mint a megfelelő csoport kezelt IL-1β (2. csoport) (7a ábra a D). 7. ábra az IL-1β stimuláció növeli a metasztatikus potenciálját GA-sejtek in vivo keresztül p38-függő mechanizmus. A: Képviselő tüdőáttétes keletkezik különböző csoport egeret. B: Rudak jelzett állatok számát kifejlesztett tüdő metasztázisok. C: A reprezentatív eredményeket a HE festés metasztázisok. D: Rudak jelzett az átlag ± SD számú metasztázisos gócok 6. tüdő szakaszok /per tüdő olyan egerekben, amelyek kifejlesztett tüdő metasztázisok. △△ P katalógusa < 0,05 vs. injektált Scramble siRNS transzfektált sejteket + IL-1β stimuláció. E: RT-PCR analízis a p38, MMP2, MMP9
és a c-fos
mRNS expresszió a tüdő metasztázisok különböző egerekben. F: IHC analízis p-p38, MMP2, MMP9 és c-fos fehérje expressziót a tüdő metasztázisok; Az IL-1β indukált magas P-p38, MMP2, MMP9 és c-fos fehérje expresszióját.
Annak további igazolására, hogy a p38, MMP2 és MMP9 is részt vesz az IL-1β-indukált tüdő metasztázis GA-sejtek, és meghatározza, ha ez a folyamat szabályozza az AP-1, az mRNS expressziós szintek a p38, MMP2, MMP9
és a c-fos katalógusa (az egyik kulcseleme az AP-1) metasztázisos tüdő mennyiségileg RT-PCR, és p-p38 , MMP2, MMP9 és c-fos fehérje expressziót tüdő metszeteket vizsgáltunk segítségével IHC. Amint a 7. ábrán látható az E és F, a kifejezés szintjét p-p38, MMP2, MMP9 és a c-fos, a tüdő metasztázisos gócok emelkedettek voltak az IL-1β. Aktiválás a p38 és az mRNS vagy fehérje expressziós szintjeit a p38, MMP2, MMP9 és c-fos alacsonyabb volt a metasztázisok által alkotott transzfektált sejtek p38 siRNS + IL-β-val kezelt csoportban (group3), vagy a kontroll csoportban (group1 ), mint a metasztázisok által alkotott Scramble siRNS + IL-β-val kezelt csoportban (2. csoport) (Figure 7E és F). Mindent összevetve, az in vivo adatok továbbá megerősíti, hogy az IL-1β indukált GA sejt metasztázis p38 által közvetített jelátvitel keresztül AP-1-függő túlszabályzását MMP2 és MMP9.
Megbeszélés
Számos tanulmány arra utalt, hogy az IL- 1β képes aktiválni a p38 és JNK [11, 12], és a p38 és JNK fontos szerepet játszanak a ráksejtek migrációs és behatolás [14, 23-26]. Ezért azt feltételeztük, hogy az IL-1β hozzájárulhat a GA terjedését és áttétét keresztül aktiválja a p38 és JNK utak. Annak vizsgálatára, ezt a lehetőséget, megvizsgáltuk hogy az IL-1β, hogy aktiválja a p38 és JNK, és elősegíti a migráció és invázió GA sejteket. Eredményeink azt mutatták, hogy az IL-1β képes aktiválni mind a p38, és JNK, és növeli a GA-migráció és inváziót, és hogy ezek a hatások gátolható p38 siRNS vagy p38-inhibitor SB 202190, de nem JNK siRNS vagy JNK inhibitor SP600125. Ez az első bizonyítéka annak, hogy az IL-1β indukálhat GA sejt migrációs és behatolás aktiválása útján p38; Azonban a mögöttes molekuláris mechanizmusok, amelyek az IL-β-közvetített p38 jeltovábbítási szabályozza során gyomor carcinogenesis nagyrészt ismeretlen.
egyik lehetséges mechanizmus, amelynek révén a p38 növelheti az invázió és a migráció a rákos sejtek által felemelő az MMP szintet [ ,,,0],27]. Jól megalapozott, hogy a váladék a MMP-k a kapacitása extracelluláris mátrix (ECM) degradáció olyan funkció, az áttétes rákos sejtek [28]. MMP2 és MMP9 kettő a legtöbb jól jellemzett MMP-k, és amelyek szorosan kapcsolódó rák terjedését és áttétét miatt erős proteolitikus aktivitása ECM [29]. Mi jelentés itt is az első alkalom, hogy a valószínű molekuláris mechanizmus, amellyel az IL-1β elősegíti GA-migráció és invázió magában az IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & MMP9 szignalizációs. Kimutattuk, hogy mindkét MMP2 és MMP9 is fokozódik GA sejtek válasz az IL-1β stimuláció; ezek a hatások gátolta siRNS ellen p38, MMP2 katalógusa vagy MMP9 katalógusa, a p38-inhibitor SB202190, és az MMP-2/9 inhibitor határállomások. Továbbá kiütése MMP2 katalógusa vagy MMP9
használatával siRNS, vagy gátlása MMP2 /9 aktivitás felhasználásával határállomások, jelentősen csökkent az IL-1β indukált GA-migráció és invázió. , Mint egy szerin /treonin protein-kináz, a p38 indukálására képes aktiválása a transzkripciós faktor AP-1 [30]. Azt találtuk továbbá, hogy az IL-1β-indukált, p38-közvetített túlszabályzását MMP2 és MMP9 voltak az AP-1-függő. Az IL-1β volt csak képes aktiválni a transzkripciót az MMP9 katalógusa promóter régiókat tartalmazó AP-1 oldalak, és ezeket a hatásokat tompította p38 siRNS és a p38 inhibitor SB202190. Továbbá, az IL-1β-indukált aktiválását az AP-1-függő transzkripciós gátolta a p38 siRNS.
Phospho-p38 (p-p38), az aktivált forma a p38, lehetett kimutatni közel 50% -a az emberi GA szövet vizsgált minták IHC-vizsgálatban, és expressziója a p-p38 szignifikánsan összefüggött a nyirokcsomó-metasztázis, és invázió túl a serosa betegeknél GA. Ezenkívül az IL-1p pozitívan korrelált a kifejezés a p-p38, MMP2, MMP9 és a c-fos, a klinikai GA példányok. Továbbá az in vivo adatokat a metasztázis assay igazolta, hogy a kialakulását tüdő metasztázisos gócok által GA-sejtek, és a p38 /
p-p38, MMP2, MMP9 és a c-fos mRNS és fehérje expresszió a tüdő metasztázisos gócok emelkedett volt által az IL-1β, és csökkentett injekció transzfektált sejtek p38 siRNS. Együttvéve ezek az adatok arra utalnak, hogy az IL-1β indukált GA sejt migrációs és behatolás történhet aktiválása a p38 jelátviteli útvonal, amely ahhoz vezet, hogy az AP-1 aktiváció és fokozza a MMP2 és MMP9. Ezért a p38 fontos szerepet játszik az IL-1β indukált áttét GA.
JNK másik fontos MAPK, hogy jól ismert, hogy fontos szerepet játszanak a rendelet az IL-1β jelátviteli több különböző sejtekben [14, 31]. Azonban ebben a vizsgálatban a JNK-t kiderül, hogy nem vesz részt a rendelet az IL-1β indukált GA-migráció és invázió. JNK siRNS és a JNK inhibitor nem csökkentette az IL-1β indukált GA sejt migrációs és behatolás, sem gyengíti aktiválása AP-1 által indukált IL-1β. Ennélfogva az IL-1β-mozdítani GA sejt migrációs és behatolás által szabályozott p38, de nem a JNK.
Összefoglalva, az általunk azonosított az első alkalom, hogy az IL-1β funkcionálisan szabályozásában vesz részt a metasztázis GA keresztül aktiválása p38. Ez a molekuláris mechanizmus magában foglalja a p38-közvetített AP-1-függő túlszabályzását egyaránt MMP2 és MMP9; és ez a tanulmány arra utal, hogy az IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot. Katalógusa

• Gastroparesis kapcsolódó gastroptosis bemutatása, mint a has alsó duzzasztó tömeg gyermek: egy esetismertetés
• Befolyásolja a IL17A polimorfizmusok aberráns metilációját DAPK és Cdh1 a nem rákos gyomornyálkahártya