-IL-1β activatie van p38 bevordert metastase in adenocarcinoom via opregulatie van AP-1 /c-fos, MMP2 en MMP9

IL--1β geïnduceerde activering van p38 bevordert metastase in adenocarcinoom via opregulatie van AP-1 /c-fos , MMP2 en MMP9
Abstract achtergrond
interleukine-1β (IL-1β) is betrokken bij de progressie van maagdarmkanker (GA); Echter, de moleculaire werkingsmechanismen van IL-1β in GA slecht gekarakteriseerd. P38 en JNK zijn de belangrijkste leden MAPK familie die IL-1β signaalwegen reguleren. Hier hebben we de rol van zowel p38 en JNK in IL-1β geïnduceerde GA celmigratie, invasie en metastatisch potentieel.
Methods Ondernemingen De effecten van IL-1β geïnduceerde p38 en JNK activering in cellen GA bepaald hand van in vitro Transwell migratie en invasie assays van MKN-45 cellen en AGS, of een in vivo assay metastase in naakt muizen. De IL-1β geïnduceerde p38 signaalroute werd verder gekenmerkt GA cellen. Activatie van de IL-1β /p38 signaalweg werd ook beoordeeld in primaire GA weefsels door immunohistochemie.
Resultaten
IL-1β geïnduceerde activering van p38 verhoogde GA celmigratie en invasie in vitro en bevorderde de metastatisch vermogen van GA cellen in vivo; Deze effecten werden verzwakt door siRNA p38 of p38 remmer SB202190. MMP2 of MMP9 siRNA en de MMP2 /9 inhibitor bips remde ook IL-1β geïnduceerde GA cel migratie en invasie in vitro. -IL-1β geïnduceerde p38 activering aanzienlijk toegenomen MMP2 en MMP9 mRNA en eiwit expressie en activiteit. Luciferase reporter assays aangetoond dat de activator proteïne-1 (AP-1) en de AP-1 bindingsplaatsen van de MMP9
promotor (-670 /MMP9) werden geactiveerd door IL-1β geïnduceerde p38 activatie. Fosfo-p38 was significant opgereguleerd in menselijke weefsels GA (vs. Gematchte niet-neoplastische weefsels) en significant geassocieerd met lymfeknoop metastase en invasie voorbij de serosa. Expressie fosfo-p38 significant gecorreleerd met IL-1β, MMP2, MMP9 en c-fos expressie in zowel menselijke weefsels en GA GA cel metastasen in de longen van naakt muizen. IL-1β ook kan activeren JNK in GA-cellen, maar de activering van JNK werd niet geassocieerd met GA celmigratie en invasie. Daarom IL-1β-induceerde de migratie en invasie in GA cellen gereguleerd door p38, maar niet door JNK.
Conclusies
-IL-1β geïnduceerde p38 activering en IL-1β /p38 /AP-1 ( c-fos) /MMP2 & MMP9 pathway speelt een belangrijke rol in metastase in Georgië; dit traject kan een nieuw therapeutisch doelwit voor GA.
Trefwoorden
IL-1β p38 Maagdarmkanker MMP2 en MMP9 AP-1 metastase Achtergrond
Toenemende bewijs geeft aan dat tumoren worden gestimuleerd en ondersteund door inflammatoire signalen van de tumor micromilieu, en de tumor micro speelt een belangrijke rol bij de promotie van kanker [1, 2]. Cytokinen, in het bijzonder de cytokinen gesecreteerd door tumorcellen, zijn wezenlijke bestanddelen van de tumor micro-omgeving. Tumor necrose factor alfa (TNF-α), interleukine-1β (IL-β) en IL-6 zijn de best gekarakteriseerde cytokinen waarvan is gebleken nauw verwant met kanker progressie. Veel studies hebben aangetoond dat ontsteking geïnduceerd door cytokinen een belangrijke rol in de ontwikkeling van maagkanker [3] speelt. Het staat vast dat infecties, met name die veroorzaakt door Helicobacter pylori, Wat zijn kunnen induceren maagslijmvlies ontstekingsreacties, waardoor opwaartse regulatie van IL-1β, waardoor inflammatie-geassocieerde carcinogenese kunnen bevorderen [4]. De onderliggende moleculaire mechanismen voor de rol van IL-1β signalering bij maagkanker blijven grotendeels onbekend en zijn plaats.
P38 is een lid van de door mitogeen geactiveerde eiwitkinase (MAPK) superfamilie. De MAPK signaalroutes zijn goed onderzocht en worden uit ten minste drie superfamilies van MAPK's die diverse cellulaire activiteiten [5] reguleren. Het is bekend dat p38 MAPK kan reguleren vele cellulaire reacties op stress cytokinen, waaronder IL-1β [6]; Uit recente gegevens aangetoond dat p38 is ook nauw verbonden met de ontwikkeling van verschillende vormen van kanker bij de mens via het vermogen om kanker celmigratie en invasie verhogen in reactie op verschillende stimuli, waaronder ontstekingsfactoren [6]. Bovendien wordt p38 ook betrokken bij de regulering van celdifferentiatie en apoptose. Vier isovormen van p38 zijn tot dusver geïdentificeerd: p38-α, β-p38, p38-γ en p38-δ [7]. Hoewel de aminozuursequenties van deze p38 MAPK's zijn meestal identiek, het expressiepatroon van elke isovorm verschilt [8]. P38-α is de belangrijkste p38 MAPK en wordt uitgedrukt alomtegenwoordig is p38-β voornamelijk in de hersenen, terwijl p38γ overvloedig tot expressie wordt gebracht in skeletspier [9] en p38-δ voornamelijk in endocriene klieren [10]. Veel studies hebben ook aangetoond dat p38 deelneemt aan IL-1β signaaltransductiecascades in een aantal celtypen, met name in muis embryonale fibroblasten (MEF) cellen en macrofagen cellen [11, 12]; echter zeer weinig bekend over de functie van IL-1β-geactiveerde p38 bij maagkanker.
c-Jun-N-terminale kinase (JNK) is een andere MAPK familielid die ook bekend is een belangrijke rol in regulatie IL-1β signaalweg [13]. Naast deelname aan regelgeving inflammatoire signaalroute, JNK voert al enkele andere belangrijke cellulaire functies, waaronder de regulering van de celgroei, differentiatie, de overleving en apoptose. Bovendien recente studies tonen aan dat JNK vaak over-uitgedrukt in verschillende kanker weefsels, en up-regulatie van JNK kunnen nauw verband worden gebracht met kanker invasie [14]; echter of JNK deel aan regulatie van IL-1β geïnduceerde maagkanker celmigratie en invasie nog zwaar
Maagdarmkanker (GA) is de meest voorkomende neoplastische tumoren van de maag.; Daarom hebben we ons gericht op GA in deze studie. Hier hebben we de activering van p38 en JNK in respons op IL-1β, en hun effect op IL-1β-geïnduceerde metastatisch potentieel van GA cellen in vitro en vivo.
Daarnaast is de expressie van fosfo-p38 (p- p38) in GA, mogelijke relatie tot clinicopathologic kenmerken van GA en de correlatie tussen de expressie van IL-1β en p-p38 onderzocht in humane paraffine ingebedde weefsels GA middels immunohistochemie. Tot slot hebben we ook gekenmerkt de moleculaire mechanismen die de IL-1β geïnduceerde p38-gemedieerde metastatische potentieel van GA cellen reguleren.
Resultaten
-IL-1β geïnduceerde activatie van p38 bevordert GA cel migratie en invasie in vitro
Ten eerste hebben we onderzocht of IL-1β was in staat om p38 signalering activeren GA cellen. Zoals getoond in figuur 1, activering van p38 (p-p38) werd gedetecteerd in zowel GA cellijnen (AGS en MKN-45 cellen) na behandeling met IL-1β gedurende 30 min; -IL-1β geïnduceerde activering van p38 werd geremd door de p38 remmer SB202190 (Figuur 1A). Figuur 1 IL-1β bevordert GA celmigratie en invasie door het activeren van p38. A: Western blots bevestigden dat p-p38 kan worden geïnduceerd door 30 min stimulatie met IL-1β in AGS en MKN-45 cellijnen; de activering van p38 door IL-1β werd geremd door p38 remmer SB202190. B: Transfectie van p38 siRNA neergehaald p38 expressie in zowel de twee GA cellijnen. C-F: Behandeling van GA cellen met IL-1β verhoogd celmigratie en invasie in vitro; Deze effecten werden geremd door p38 siRNA of p38 remmer SB202190. ** P Restaurant < 0,05 versus scramble siRNA (Control siRNA) getransfecteerde cellen gestimuleerd met IL-1β; △△ P Restaurant < 0,05 versus ongetransfecteerde cellen (wild-type cellen) gestimuleerd met IL-1β. Balken geven de gemiddelde ± SD aantal cellen per veld (400 × vergroting) bij de migratie en invasie assays. G:. Vertegenwoordiger lichtmicroscoop beelden van AGS en MKN-45 celmigratie en invasie in de Transwell assays
P38 kan de migratie en invasie van verschillende kankercellen [15] te bevorderen. Om te onderzoeken of IL-1β de migratie en invasie van GA cellen kunnen bevorderen via het activeren van p38 signalering, GA cellen getransfecteerd met een scrambled siRNA (controle siRNA) of p38 siRNA of GA cellen voorbehandeld met of zonder de p38 remmer SB202190 waren gestimuleerd met IL-1β. Transwell migratie en invasie assays aangetoond dat IL-1β stimulatie verhoogde de migratie en invasie van zowel AGS en MKN-45 cellen; echter IL-1β geïnduceerde GA celmigratie en invasie significant verminderd door knockdown van p38 middels siRNA (Figuur 1B G) of voorbehandeling met SB202190 (figuur 1C tot G). Bij elkaar genomen, deze gegevens suggereren sterk dat IL-1β bevorderd GA cel migratie en invasie worden gemedieerd door p38.
-IL-1β geïnduceerde activatie van p38 upregulates MMP2 en MMP9 expressie en activiteit in Georgië cellen
MMP2 en MMP9 hebben aangetoond dat een belangrijke rol in kankercel invasie en metastase [16] spelen. Te onderzoeken of MMP2 en MMP9 ook deelnemen aan de IL-1β geïnduceerde p38 gereguleerde metastatisch potentieel van GA cellen, RT-PCR, immunocytochemie en confocale microscopie en het zymografie assay uitgevoerd om MMP2 en MMP9 expressie en activiteit van GA bepalen cellijnen getransfecteerd met controle siRNA of p38 siRNA of voorbehandeld met of zonder de p38 remmer SB202190 en vervolgens behandeld met of zonder IL-1β. Zoals verwacht, werden MMP2 en MMP9 expressie en activiteit verhoogd in reactie op IL-1β behandeling (Figuur 2A-C). Knockdown van p38 middels siRNA of voorbehandeling met de p38 remmer SB202190 significant verlaagd Il-1β geïnduceerde MMP2 en MMP9 mRNA expressie en activiteit in zowel GA cellijnen (Figuur 2A-C). Figuur 2 IL-1β upregulates MMP2 en MMP9 expressie en activiteit door het activeren van p38. A: RT-PCR analyse toonde aan dat MMP2 Kopen en MMP9
mRNA opgereguleerd in zowel AGS en MKN-45 cellen in respons op behandeling met IL-1β; Dit effect werd geblokkeerd door p38 siRNA of de p38-remmer SB202190. B: Het kwantificeren van de expressie van MMP2 Kopen en MMP9
mRNA genormaliseerd naar GAPDH
mRNA. ** P Restaurant < 0,05 versus scramble-siRNA getransfecteerde cellen gestimuleerd met IL-1β. △△ P Restaurant < 0,05 vs. getransfecteerde cellen gestimuleerd met IL-1β. C: Gel zymografie toonde aan dat MMP2 en MMP9 activiteit werden opgereguleerd in zowel AGS en MKN-45 cellen in respons op behandeling met IL-1β; Dit effect werd geblokkeerd door p38 siRNA of de p38-remmer SB202190. D: immunocytochemische kleuring en confocale microscopie bevestigd dat IL-1β verhoogde activering van p38 (rood) en MMP2 en MMP9 (groen) expressie in MKN-45 cellen GA; Deze effecten werden geblokkeerd door siRNA p38 of p38 remmer SB202190.
immunocytochemie confocale microscopie aangetoond dat p-p38 zwak tot expressie werd gebracht in onbehandelde MKN-45 cellen, die ook zeer lage MMP2 en MMP9 uitgedrukt. Na stimulatie met IL-1β, aanzienlijk hogere niveaus van p-p38, MMP2 en MMP9 werden gedetecteerd in de MKN-45 cellen; Deze IL-1β geïnduceerde effecten werden geremd door p38 siRNA en SB202190 (figuur 2D). Samen vormen deze resultaten suggereren sterk dat de IL-1β doorgaande p38 geïnduceerde invasie en migratie van GA cellen wordt gemedieerd via het vermogen van p-p38 tot MMP2 en MMP9 expressie en activiteit opreguleren.
IL-1β geïnduceerde activering van p38 reguleert MMP2 en MMP9 door activering van AP-1-afhankelijke transcriptie in cellen GA
het is goed gedocumenteerd dat de transcriptiefactor activator proteïne-1 (AP-1) kan de expressie van MMP2 en MMP9 [17], en activering reguleren p38 kan reguleren AP-1 activering [18]. Om te onderzoeken of IL-1β geïnduceerde p38 gemedieerde verhoogde MMP2 en MMP9 expressie en activiteit afhankelijk van AP-1, de activering van AP-1-afhankelijke transcriptiefactoren onderzocht in GA cellen behandeld met of zonder IL-1β, in de aanwezigheid of afwezigheid van p38 remmen, met een AP-1 luciferase reporter assay. IL-1β verhoogde de activiteit van de AP-1 in zowel GA cellijnen (Figuur 3A); Remming van p38 p38 middels siRNA of voorbehandelde cellen met p38 remmer SB202129 verlaagde IL-1β geïnduceerde AP-1-activiteit in zowel GA cellijnen (Figuur 3A). Deze resultaten geven aan dat IL-1β geïnduceerde p38 gemedieerde expressie van MMP9 MMP2 en zijn afhankelijk van AP-1. Figuur 3 IL-1β geactiveerd AP-1 activiteit door middel van p38 route. A: Beide GA cellen werden getransfecteerd met AP-1 reporter plasmide of AP-1 reporterplasmide samen met scramble siRNA of p38 siRNA. AP-1 luciferase reportergen activiteit werd significant verhoogd door IL-1β stimulatie in zowel AGS en MKN-45 cellen; Deze effecten waren significant geremd door p38 siRNA op een dosis-afhankelijke wijze en ook geremd door de p38 remmer SB202190. ** P Restaurant < 0,05 versus controle siRNA (scramble siRNA) + AP-1-luc getransfecteerde cellen gestimuleerd met IL-1β; ΔΔP Restaurant < 0,05 versus AP-1-luc getransfecteerde cellen gestimuleerd met IL-1β; relatieve luciferaseactiviteit werd genormaliseerd naar B-gal. B: IL-1β geïnduceerde p38-gemedieerde activatie van de MMP9
promoters is afhankelijk van de AP-1-bindingsplaatsen. ** P Restaurant < 0,05 vs. getransfecteerde -670 /+ MMP9 controle siRNA cellen gestimuleerd met IL-1β; ΔΔP Restaurant < 0,05 vs. getransfecteerde -670 /MMP9 cellen gestimuleerd met IL-1β; ▼▼ P Restaurant < 0,05 vs. getransfecteerde -570 /MMP9 cellen gestimuleerd met IL-1β; relatieve luciferaseactiviteit werd genormaliseerd naar B-gal.
Om de rol van AP-1 in IL-1β geïnduceerde p38 route, luciferase reportergen vectoren die de AP-1 plaatsen van de MMP9
promoter verder te bevestigen gebieden werden getransfecteerd in de cellen GA. Volgens de AP-1 reportergenassays De luciferase activiteiten van het -670 /MMP9
promotergebied (dat twee AP-1 bindingsplaatsen [-533 en -79] en een NF-КB bindingsplaats [-600 ] [19-21]) significant toegenomen IL-1β-gestimuleerde cellen (Figuur 3B). Transfectie van cellen met p38 siRNA of voorbehandelde cellen met p38 remmer SB202129 verkleinde-IL-1β geïnduceerde luciferaseactiviteit van het -670 /MMP9
promoter reportergen (Figuur 3B). De luciferase activiteit van de MMP9
promotor (-571 /MMP9
) werd niet gewijzigd door schrapping van de NFKB-bindingsplaats (-600). Bovendien, als de AP-1 plaatsen (-79 en -533) van de MMP9
promoter werden geschrapt (-73 /MMP9
mutanten), de luciferase activiteit van het reportergen aanzienlijk gedaald in vergelijking met de respectievelijke wild -type control reportergenen (Figuur 3B). Tezamen zijn deze gegevens een sterke aanwijzing dat IL-1β induceert activatie van de p38 signaleringsroute, die de invasie en migratie van cellen via GA AP-1-afhankelijke opregulatie van MMP2 en MMP9 expressie en activiteit bevordert.
Knockdown van MMP2 of MMP9 verlaagt-IL-1β geïnduceerde migratie en invasie in GA cellen Belgique Om verder te bevestigen dat-IL-1β geïnduceerde GA celmigratie invasie worden geassocieerd met opregulatie van MMP2 en MMP9, AGS en MKN-45 cellen werden getransfecteerd met siRNA tegen MMP2
of MMP9
of voorbehandeld met of zonder MMP2 /MMP9 remmer GIP en vervolgens gestimuleerd met IL-1β. Transwell de migratie en invasie assays toonden dat de IL-1β geïnduceerde migratie en invasie van GA cellen waren significant verminderd door knockdown van MMP2
of MMP9, golfreizen of voorbehandeling met GIP, in vergelijking met controle cellen (Figuur 4A C). Daarom opregulatie van MMP2 en MMP9 zijn cruciaal voor IL-1β geïnduceerde GA celmigratie en invasie. Figuur 4 Knockdown van MMP2 of MMP9 of voorbehandeling met de MMP2 /9-remmer bips remt IL-1β geïnduceerde GA cel migratie en invasie in vitro. A: RT-PCR bevestigde de efficiëntie van de MMP2 of MMP9 siRNAs, die aanzienlijk gereduceerde MMP2
of MMP9
expressie, respectievelijk met maximaal meer dan 75%. B: IL-1β verhoogde GA cel migratie en invasie in vitro; Deze effecten werden geremd door MMP2 of MMP9 siRNA of de MMP2 /9 inhibitor bips. ** P Restaurant < 0,05 versus scramble siRNA (controle siRNA) getransfecteerde cellen gestimuleerd met IL-1β. Staven zijn gemiddelde ± SD veelvoudveranderingen genormaliseerd met de controlegroep bij de migratie en invasie assays. C: Representatieve lichtmicroscopie beelden van AGS en MKN-45 celmigratie en invasie in de Transwell migratie en invasie assays
IL-1β-geïnduceerde activering van JNK neemt niet deel aan de regulering van GA cel migratie en invasie
. het is bekend dat leden van MAPK spelen een belangrijke rol bij de regulatie van cellulaire reacties op cytokinen en stress en P38 en JNK zijn de belangrijkste leden MAPK familie die IL-1β signaalwegen reguleren. Te begrijpen of JNK ook geassocieerd met IL-1β geïnduceerde GA celmigratie en invasie, werd Western blot analyse uitgevoerd om de activering van JNK in respons op IL-1β detecteren. Zoals getoond in figuur 5A, werd p-JNK gedetecteerd in zowel AGS en MNK-45 cellijnen na stimulatie met IL-1β gedurende 30 min. De resultaten van beide Transwell migratie en invasie assays toonden dat de verhoogde migratie en invasie van zowel AGS en MKN-45 cellen geïnduceerd door IL-1β stimulatie niet werden verminderd door knockdown JNK met siRNA of verzwakt door remmen JNK pathway met JNK inhibitor SP600125 noch (Figuur 5B D); Het aantal gemigreerde cellen en invasieve bijna geen verandering vertoonde voor of na transfectie met siRNA tegen JNK (P >0,05) of al dan niet voorbehandeld met JNK inhibitor SP600125 (P > 0,05). JNK werd niet geassocieerd met IL-1β-bevorderde de GA celmigratie en invasie die verder door AP-1 luciferase reporter assay gecontroleerd. Als de stroomopwaartse kinase c-jun (een belangrijke component van AP-1), JNK kan AP-1, en de activering van AP-1 door JNK activeren is nauw verwant met de functie JNK over regulatie van verschillende cellulaire reacties zoals kanker celmigratie en invasie [22]; echter IL-1β geïnduceerde AP-1 activatie in zowel AGS en MKN-45 cellen werd niet geremd door JNK siRNA of JNK-remmer SP600125 noch (figuur 5E). Alles bij elkaar, deze gegevens zijn sterke aanwijzingen dat de toegenomen GA migratie en invasie gepromoot door IL-1β niet worden gereguleerd door JNK. Figuur 5 De activering van JNK niet geassocieerd met IL-1β geïnduceerde GA celmigratie en invasie. A: p-JNK werd gedetecteerd door 30 minuten stimulatie met IL-1β in AGS en MKN-45 cellijnen. B: Transfectie van JNK siRNA neergehaald JNK expressie in zowel de twee GA cellijnen. C-D: Behandeling van GA cellen met IL-1β verhoogd celmigratie en invasie in vitro; Deze effecten werden niet geremd door JNK siRNA noch de JNK-remmer SP600125. ** P Restaurant < 0,05 versus scramble-siRNA getransfecteerde cellen gestimuleerd met IL-1β; △△ P Restaurant < 0,05 versus ongetransfecteerde cellen (wild-type cellen) gestimuleerd met IL-1β; ## Of ●● geen significant verschil tussen deze twee groepen werd ontdekt (P
> 0,05). Bars aangegeven het gemiddelde ± SD aantal cellen per gezichtsveld in de migratie en invasie assays. D: Representatieve lichtmicroscoop beelden van AGS en MKN-45 celmigratie en invasie in de Transwell assays. E: Beide GA cellen werden getransfecteerd met AP-1 reporter plasmide of AP-1 reporterplasmide samen met scramble siRNA of JNK siRNA. AP-1 luciferase reportergen activiteit werd significant verhoogd door IL-1β stimulatie in zowel AGS en MKN-45 cellen; Deze effecten werden niet geremd door JNK siRNA noch geremd door de JNK-remmer SP600125 beide. ** P Restaurant < 0,05 versus controle siRNA (scramble siRNA) + AP-1-luc getransfecteerde cellen gestimuleerd met IL-1β; ΔΔP Restaurant < 0,05 versus AP-1-luc getransfecteerde cellen gestimuleerd met IL-1β; ## Of ●● geen significant verschil tussen deze twee groepen werd ontdekt (P
> 0,05). Relatieve luciferaseactiviteit werd genormaliseerd naar B-gal.
Fosfo-p38 opgereguleerd en correleert met de expressie van IL-1β, MMP2, MMP9 en c-fos in humane weefsels GA Ondernemingen De expressie van p-p38 in een reeks 105 GA weefsels en de gepaarde non-neoplastische gastrische weefsels werd onderzocht door immunohistochemie (IHC). Van de 105 monsters kanker, 53 gevallen van GA weefsels (50,48%) vertoonde overexpressie van p-p38 vergeleken met de gepaarde non-neoplastische gastrische weefsels (P
< 0,05; figuur 6A). Positieve p-p38 expressie werd vaak waargenomen in zowel de GA cytoplasma en kern. Figuur 6 gefosforyleerde p38 overexpressie in menselijke GA en de expressie van p-p38 positief correleert met IL-1β, MMP2, MMP9 en c-fos expressie in weefsels GA. A: Overexpressie van p-p38 werd vaak waargenomen in GA weefsels, in vergelijking met de gepaarde niet-neoplastische weefsels maag. a, P-p38 werd niet gedetecteerd of slechts zwak tot expressie gebracht in niet-neoplastische weefsels maag. b tot en met e: verschillende intensiteiten van de positieve p-p38 expressie in GA weefsels. B: Expressie van p-p38 positief gecorreleerd met IL-1β, MMP2, MMP9 en c-fos expressie in menselijke weefsels GA. GA weefselmonster vertonen sterker IL-1β expressie en sterker p-p38, MMP2, MMP9 en c-fos-expressie; en zwakkere IL-1β expressie en zwakke p-p38, MMP2, MMP9 en c-fos expressie. C: De som van scores positieve kleurintensiteit van IHC voor p-p38. ** P Restaurant < . 0,05 versus gepaarde niet-neoplastische maag weefsels verhuur No significante associaties werden waargenomen tussen overexpressie van p-p38 in de leeftijd van de patiënt (< 50 of ≥ 50 jaar), het geslacht, tumorgrootte (< 3 cm of ≥ 3 cm), weefseltype, of graad van differentiatie. Echter, overexpressie van p-p38 weergegeven significant gerelateerd met lymfeklier metastase (P Restaurant < 0,05), en de invasie voorbij de serosa (P Restaurant < 0,05). Deze gegevens suggereren dat overexpressie van p-p38 is geassocieerd met metastase in menselijke GA.
Zoals getoond in figuur 6B, de expressie van p-p38 vertoonde goede correlativity de niveaus van IL-1β, MMP2, MMP9 en AP-1 (c-fos) in GA weefsel en een significante correlatie tussen verhoogde p-p38 expressie en opregulatie van IL-1β, MMP2, MMP9 en c-fos in GA weefsel (r = 0,72, p < 0,01; r = 0,63, p < 0,01; r = 0,58, p < 0,05 en r = 0,69, p < 0,01) werd ontdekt toen geanalyseerd door Spearman methode Ondernemingen De som scores van positieve kleuring intensiteit van IHC voor de p-p38 in beide 105 gevallen van GA. weefsels en gekoppeld niet- neoplastische gastrische weefsels werden getoond in figuur 6C.
invasie assay in naakt muizen
MKN-45 cellen getransfecteerd met een scrambled siRNA of p38 siRNA werden geïnjecteerd in de staartader van BALB /c-nu /nu muizen; IL-1β of PBS werden intraperitoneaal geïnjecteerd vanaf de dag van de cellen werden geïnjecteerd gedurende 14 dagen. Groep 1 werden geïnjecteerd met PBS en scrambled siRNA getransfecteerde MKN-45 cellen; groep 2 werden geïnjecteerd met IL-1β en scrambled siRNA getransfecteerde MKN-45 cellen; en groep 3 werden geïnjecteerd met p38 siRNA getransfecteerde MKN-45 cellen en IL-1β
45 dagen na injectie van de cellen, alle dieren. (6/6, 100%) in de IL-1β-behandelde groep ontwikkelde longmetastasen (Figuur 7A tot D) (groep 2, gemiddeld metastatische foci in 6 van longsecties was 14 per long). Daarentegen had minder dieren (2 /6,33.33%) in de controlegroep die niet waren geïnjecteerd met IL-1β longmetastasen ontwikkeld (groep 1, gemiddeld 6 metastasen in 6 van longsecties per long). Dat slechts twee dieren in de p38 siRNA plus IL-β-behandelde groep ontwikkelde longmetastasen en het aantal longmetastasen in deze groep was significant lager (groep 3, gemiddeld 4 metastasen in 6 van longsecties per long) en aanzienlijk kleiner dan die van de overeenkomstige groep behandeld met IL-1β (groep 2) (Figuur 7A tot en met D). Figuur 7 IL-1β stimulatie verhoogt het metastatisch potentieel van GA cellen in vivo via een p38-afhankelijk mechanisme. A: Representatieve longmetastasen gevormd andere groep muizen. B: Bars aangegeven het aantal dieren longmetastasen ontwikkeld. C: Representatieve resultaten van HE kleuring van longmetastasen. D: Staven aangegeven het gemiddelde ± SD aantal metastatische foci in 6 van longsecties /per long in muizen die longmetastasen had ontwikkeld. △△ P Restaurant < 0,05 versus geïnjecteerd met scramble siRNA getransfecteerde cellen plus IL-1β stimulatie. E: RT-PCR analyse van p38, MMP2, MMP9 Kopen en c-fos
mRNA expressie in de long metastases van verschillende muizen. F: IHC analyse van p-p38, MMP2, MMP9 en c-fos-eiwit expressie in de long metastasen; IL-1β geïnduceerde verhoogde p-p38, MMP2, MMP9 en c-fos eiwitexpressie. Belgique Om verder te bevestigen of p38, MMP2 en MMP9 zijn betrokken bij IL-1β geïnduceerde long metastase van GA cellen, en bepalen of deze taak wordt gereguleerd door AP-1, het mRNA expressieniveaus van p38, MMP2, MMP9 Kopen en c-fos
(een belangrijke component van AP-1) in metastatische long werden gekwantificeerd door RT-PCR en p-p38 , MMP2, MMP9 en c-fos-eiwit expressie in long secties werden onderzocht onder toepassing van IHC. Zoals getoond in figuur 7 E en F werden de expressieniveaus van p-p38, MMP2, MMP9 en c-fos in de longen metastatische foci verhoogd in reactie op IL-1β. Activering van p38 en het mRNA of eiwit expressieniveaus van p38, MMP2, MMP9 en c-fos lager bij de metastasen gevormd door de cellen getransfecteerd met p38 siRNA plus IL--β behandelde groep (Groep 3) of in de controlegroep (groep 1 ) vergeleken met metastasen gevormd door scramble siRNA plus IL-β-behandelde groep (groep 2) (Figuur 7E en F). Het geheel van in vivo gegevens bevestigen verder dat IL-1β geïnduceerde GA cel metastase wordt bemiddeld door p38 signalering via AP-1 afhankelijke opregulatie van MMP2 en MMP9.

Discussie Een aantal studies hebben gesuggereerd dat IL 1β is kan activeren p38 en JNK [11, 12] en p38 en JNK spelen een belangrijke rol bij kanker celmigratie en invasie [14, 23-26]. Daarom veronderstelden we dat IL-1β kan bijdragen aan GA invasie en metastase via activeren van de p38 en JNK trajecten. Om deze mogelijkheid te onderzoeken, onderzochten we het vermogen van IL-1β naar p38 en JNK activeren, en het bevorderen van de migratie en invasie van GA-cellen. Onze resultaten laten zien dat IL-1β zowel p38 kon activeren en JNK en verhogen GA celmigratie en invasie, en dat deze effecten kunnen worden geremd door p38 siRNA of p38 remmer SB 202190, maar niet JNK siRNA of JNK inhibitor SP600125. Dit is het eerste bewijs dat IL-1β GA celmigratie en invasie via activatie van p38 kan induceren; Echter, de onderliggende moleculaire mechanismen die-IL-β-gemedieerde p38 signalering wordt geregeld tijdens de maag carcinogenese blijven grotendeels onbekend.
Een mogelijk mechanisme waardoor p38 de invasie en migratie van kankercellen kunnen verhogen is door het verhogen van de niveaus van MMP's [ ,,,0],27]. Het is bekend dat uitscheiding van MMP's met het vermogen tot extracellulaire matrix (ECM) degradatie is een kenmerk van metastatische kankercellen [28]. MMP2 en MMP9 zijn twee van de meest goed gekarakteriseerde MMPs en zijn nauw verbonden met kanker en metastase door hun sterke proteolytische activiteit van ECM [29]. Wij rapporteren hier ook voor het eerst dat het waarschijnlijke werkingsmechanisme waardoor IL-1β bevordert GA celmigratie en invasie kan omvatten het IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & MMP9 signaleringsroute. We hebben aangetoond dat zowel MMP2 en MMP9 in GA cellen opgereguleerd in reactie op IL-1β stimulatie; Deze effecten werden geremd door siRNA tegen p38, MMP2 golfreizen of MMP9
, de p38 remmer SB202190, en de MMP2 /9 inhibitor bips. Bovendien knockdown van MMP2 golfreizen of MMP9
met behulp van siRNA, of remming van MMP2 /9 activiteit met bips, aanzienlijk gedaald IL-1β geïnduceerde GA celmigratie en invasie. Als serine /threonine proteïne kinase, p38 kan induceren de activering van de transcriptiefactor AP-1 [30]. We vonden verder dat de IL-1β geïnduceerde p38-gemedieerde opregulatie van MMP2 en MMP9 waren AP-1 afhankelijke. IL-1β was alleen in staat om de transcriptie van MMP9
promotorregio's die AP-1 spots te activeren, en deze effecten werden gedempt door p38 siRNA en de p38 remmer SB202190. Bovendien, IL-1β geïnduceerde activering van AP-1-afhankelijke transcriptie werd geremd door p38 siRNA.
Phospho-p38 (p-p38), de geactiveerde vorm van p38, kon worden gedetecteerd bijna 50% van de menselijke GA weefselmonsters getest door IHC analyse en expressie van p-p38 was significant geassocieerd met lymfeknoop metastase en invasie voorbij de serosa bij patiënten met GA. Bovendien is de expressie van IL-1 ß positief gecorreleerd met de expressie van p-p38, MMP2, MMP9 en c-fos in de klinische monsters GA. Verder in vivo gegevens van de metastase assay aangetoond dat de vorming van long metastatische foci door GA cellen en p38 /
p-p38, MMP2, MMP9 en c-fos mRNA en eiwitexpressie in de longen metastatische foci werden verhoogd door IL-1β en verminderd door injectie van cellen getransfecteerd met p38 siRNA. Samen vormen deze gegevens wijzen erop dat IL-1β geïnduceerde GA celmigratie en invasie gebeuren via activatie van de p38 signaleringsroute die leidt tot AP-1 activering en opregulatie van MMP2 en MMP9. Daarom p38 speelt een essentiële rol in IL-1β geïnduceerde metastase in GA.
JNK is een andere belangrijke MAPK goed bekend zijn belangrijke rollen in voorschrift IL-1β-signalering in verschillende cellen [14, 31]. In dit onderzoek werd vastgesteld dat JNK niet betrokken zijn bij regulatie van IL-1β geïnduceerde GA celmigratie en invasie. SiRNA JNK en JNK-remmer niet verminderen IL-1β geïnduceerde GA celmigratie en invasie, noch verzwakken activering van AP-1 geïnduceerd door IL-1β. Daarom, IL-1β-bevorderd GA cel migratie en invasie worden gereguleerd door p38, maar niet door JNK.
Kortom, we hebben geïdentificeerd voor de eerste keer dat IL-1β functioneel betrokken bij de regulatie van uitzaaiing in Georgië via activering van p38. Deze moleculaire mechanisme omvat-p38 gemedieerde AP-1-afhankelijke opregulatie van zowel MMP2 en MMP9; en deze studie suggereert sterk dat de IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Gastroparese geassocieerd met gastroptosis presenteren als een onderbuik bulk massa in een kind: een case report
• Invloed van IL17A polymorfismen op de afwijkende methylering van DAPK en CDH1 in niet-kankerachtige maagslijmvlies