IL-1β-indotta attivazione di p38 promuove metastasi in adenocarcinoma gastrico attraverso upregulation di AP-1 /c-fos, MMP2 e MMP9

IL-1β-indotta attivazione di p38 promuove metastasi in adenocarcinoma gastrico attraverso upregulation di AP-1 /c-fos , MMP2 e MMP9
Abstract
sfondo
interleuchina-1β (iL-1β) è stato implicato nella progressione di adenocarcinoma gastrico (GA); Tuttavia, i meccanismi molecolari d'azione di IL-1β in GA sono poco caratterizzati. P38 e JNK sono i principali membri della famiglia MAPK che regolano l'IL-1β vie di segnalazione. Qui, abbiamo studiato il ruolo di entrambi p38 e JNK in IL-1β-indotta migrazione delle cellule GA, invasione e potenziale metastatico.
Metodi
Gli effetti di p38 di IL-1β-indotta e l'attivazione di JNK nelle cellule GA sono stati determinati utilizzando in vitro Transwell migrazione e l'invasione delle cellule saggi MKN-45 e AGS, o un vivo test in metastasi in topi nudi. Il percorso di segnalazione p38 di IL-1β-indotta è stato ulteriormente caratterizzato in cellule GA. L'attivazione della via di segnalazione IL-1β /p38 è stata valutata anche in umani tessuti GA primari di immunoistochimica.
Risultati
attivazione IL-1β-indotta di p38 sono aumentati migrazione delle cellule GA e l'invasione in vitro e promosso il potenziale metastatico del cellule GA in vivo; questi effetti sono stati attenuati da siRNA p38 o la SB202190 inibitore p38. MMP2 o MMP9 siRNA e la MMP2 /9 inibitore PIF anche inibito IL-1β-indotta migrazione delle cellule GA e l'invasione in vitro. IL-1β-indotta attivazione di p38 significativamente aumentata MMP2 e MMP9 mRNA e proteina espressione e l'attività. saggi di luciferasi hanno dimostrato che la proteina attivatrice-1 (AP-1) e l'AP-1 siti di legame della MMP9
promotore (-670 /MMP9) sono stati attivati ​​mediante attivazione di p38 di IL-1β-indotta. Fosfo-p38 era significativamente upregulated in tessuti umani GA (rispetto ai tessuti non neoplastici abbinati), e significativamente associato con metastasi linfonodali, e l'invasione oltre la sierosa. L'espressione di fosfo-p38 significativamente correlata con IL-1β, MMP2, MMP9, e l'espressione di c-fos in entrambi i tessuti GA umani e le metastasi delle cellule GA nei polmoni di topi nudi. IL-1β è stata anche in grado di attivare JNK nelle cellule GA, ma attivazione di JNK non è stata associata con la migrazione delle cellule GA e invasione. Pertanto, IL-1β-indotta la migrazione e l'invasione delle cellule GA sono stati regolata da p38, ma non da JNK.
Conclusioni
IL-1β-indotta p38 attivazione e l'IL-1β /p38 /AP-1 ( c-fos) /MMP2 & percorso MMP9 svolgono un ruolo importante in metastasi in GA; questo percorso può fornire un nuovo bersaglio terapeutico per GA.
Parole
IL-1β p38 adenocarcinoma gastrico MMP2 e MMP9 AP-1 metastasi Sfondo
crescente evidenza indica che i tumori sono promossi e sostenuti da segnali infiammatori del tumore microambiente, e il microambiente tumorale gioca un ruolo importante nella promozione del cancro [1, 2]. Citochine, soprattutto citochine secrete dalle cellule tumorali, sono componenti essenziali del microambiente tumorale. fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), interleuchina-1β (IL-β) e IL-6 sono le citochine maggior parte ben caratterizzati, che hanno dimostrato di essere strettamente legato alla progressione del cancro. Molti studi hanno dimostrato che l'infiammazione indotta da citochine gioca un ruolo importante nello sviluppo del cancro gastrico [3]. E 'ben noto che le infezioni, in particolare quelle indotte da Helicobacter pylori,
sono in grado di indurre risposte infiammatorie mucosa gastrica, con conseguente upregulation di IL-1β, che a sua volta può favorire carcinogenesi infiammazione associata [4]. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base del ruolo della segnalazione IL-1β nella carcinogenesi gastrica rimangono in gran parte sconosciute, e sono attualmente di interesse.
P38 è un membro della proteina chinasi mitogeno-attivata (MAPK) superfamiglia. Le vie di segnalazione MAPK sono stati ben studiati, e sono costituiti da almeno tre superfamiglie di MAPK che regolano diverse attività cellulari [5]. È ben noto che p38 MAPK è in grado di regolare un sacco di risposte cellulari alle citochine e sollecitazioni, tra IL-1β [6]; Tuttavia, dati recenti hanno dimostrato che p38 è strettamente legato allo sviluppo di diversi tipi di cancro umano attraverso la sua capacità di elevare la migrazione delle cellule tumorali e l'invasione in risposta a vari stimoli, compresi fattori infiammatori [6]. Inoltre, p38 è anche coinvolto nella regolazione della differenziazione cellulare e l'apoptosi. Quattro isoforme di p38 sono stati identificati finora: p38-α, β-p38, p38-γ, e p38-δ [7]. Anche se le sequenze di amminoacidi di queste MAPK p38 sono pressoché identiche, il pattern di espressione di ogni isoforma varia [8]. P38-α è il principale MAPK p38 ed è espressa ubiquitariamente, p38-β è espresso principalmente nel cervello, mentre p38γ è abbondantemente espressa nel muscolo scheletrico [9] e p38-δ si esprime soprattutto nelle ghiandole endocrine [10]. Molti studi hanno inoltre dimostrato che p38 partecipa IL-1b cascate di segnalazione in un insieme di tipi di cellule, specialmente nel topo fibroblasti embrionali (MEF) Cellule e macrofagi cellule [11, 12]; Tuttavia, si sa molto poco circa la funzione di p38 di IL-1β-attivato nel carcinoma gastrico.
chinasi c-Jun N-terminale (JNK) è un altro membro della famiglia MAPK che è anche ben noto a svolgere un ruolo importante nella regolazione IL-1β via di segnalazione [13]. Oltre alla partecipazione al percorso di regolazione del segnale infiammatorio, JNK svolge diverse altre funzioni cellulari importanti, tra cui regolazione della crescita cellulare, la differenziazione, la sopravvivenza e l'apoptosi. Inoltre, recenti studi dimostrano che JNK è spesso sovra-espresso in diversi tessuti tumorali, e up-regolazione di JNK possono essere strettamente associati con l'invasione del cancro [14]; tuttavia, se JNK partecipa nella regolazione della migrazione delle cellule cancro gastrico IL-1β-indotta e l'invasione rimane in gran parte sconosciuto
adenocarcinoma gastrico (GA) è il tumore più comune neoplastica dello stomaco.; Pertanto, ci siamo concentrati su GA in questo studio. Qui, abbiamo studiato l'attivazione di p38 e JNK in risposta a IL-1β, e il loro effetto su IL-1β-indotta potenziale metastatico delle cellule di GA in vitro o in vivo.
Inoltre, l'espressione di fosfo-p38 (p- p38) in GA, la sua relazione con le caratteristiche clinico-patologiche di GA, e la correlazione tra l'espressione di iL-1β e p-p38 sono stati studiati nei tessuti GA inclusi in paraffina umani mediante immunoistochimica. Infine, si caratterizza anche i meccanismi molecolari che regolano l'IL-1β-indotta p38-mediata potenziale metastatico delle cellule di GA.
Risultati
IL-1β-indotta attivazione di p38 promuove la migrazione delle cellule GA e l'invasione in vitro
in primo luogo, abbiamo studiato se l'IL-1β è stata in grado di attivare la segnalazione p38 nelle cellule GA. Come mostrato in figura 1, l'attivazione di p38 (p-p38) è stata rilevata in entrambe le linee cellulari GA (AGS e MKN-45 cellule) dopo il trattamento con IL-1β per 30 min; IL-1β-indotta attivazione di p38 è stata inibita dalla SB202190 inibitore p38 (Figura 1A). Figura 1 IL-1β promuove la migrazione delle cellule GA e l'invasione attivando p38. A: Western blot hanno confermato che p-p38 potrebbe essere indotta da 30 min stimolazione con IL-1β in AGS e linee cellulari MKN-45; l'attivazione di p38 da IL-1β è stata inibita da inibitore p38 SB202190. B: La trasfezione di p38 siRNA abbattuto espressione p38 sia nelle due linee cellulari GA. C-F: Il trattamento delle cellule GA con IL-1β aumentato la migrazione delle cellule e l'invasione in vitro; tali effetti sono stati inibiti da siRNA p38 o l'inibitore p38 percorso SB202190. ** P
< 0.05 vs scramble siRNA (siRNA di controllo), le cellule transfettate stimolate con IL-1β; △△ P
< 0.05 vs cellule untransfected (cellule wild-type) stimolate con IL-1β. Barre indicano la media ± SD numero di cellule per campo di vista (× 400 ingrandimenti) nei test di migrazione e l'invasione. G:. Immagini luce microscopio rappresentativi di AGS e la migrazione delle cellule MKN-45 e l'invasione nei saggi Transwell
P38 può promuovere la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali diverse [15]. Per verificare se l'IL-1β può favorire la migrazione e l'invasione delle cellule GA tramite l'attivazione di segnalazione p38, le cellule GA trasfettate con un scrambled siRNA (controllo siRNA) o p38 siRNA, o cellule GA pre-trattati con o senza l'inibitore SB202190 p38 percorso erano stimolate con IL-1β. Transwell saggi di migrazione e l'invasione hanno dimostrato che la stimolazione di IL-1β aumentato la migrazione e l'invasione di entrambi AGS e MKN-45 celle; tuttavia, IL-1β-indotta migrazione delle cellule GA e l'invasione erano significativamente attenuati da atterramento di p38 utilizzando siRNA (Figura 1B a G) o pretrattamento con SB202190 (Figura 1C a G). Presi insieme, questi dati suggeriscono fortemente che l'IL-1β promosso la migrazione delle cellule GA e l'invasione sono mediati da p38.
IL-1β-indotta attivazione di p38 upregulates MMP2 e MMP9 espressione e l'attività delle cellule GA
MMP2 e MMP9 hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nella invasione delle cellule del cancro e metastasi [16]. Per esplorare se MMP2 e MMP9 partecipano anche l'IL-1β-indotta potenziale metastatico p38-regolata di cellule GA, RT-PCR, immunoistochimica e microscopia confocale, e il saggio zimografia sono stati effettuati per determinare MMP2 e MMP9 espressione e l'attività in GA linee cellulari trasfettate con siRNA controllo o p38 siRNA, o pretrattati con o senza l'inibitore SB202190 p38, e quindi trattate con o senza iL-1β. Come previsto, MMP2 e MMP9 espressione e l'attività sono stati elevati in risposta al trattamento IL-1β (Figura 2A a C). Knockdown di p38 utilizzando siRNA, o pre-trattamento con la SB202190 inibitore p38 significativamente diminuita MMP2 Il-1β-indotta e l'espressione di mRNA MMP9 e l'attività in entrambe le linee cellulari GA (Figura 2A a C). Figura 2 IL-1β upregulates MMP2 e MMP9 espressione e l'attività attivando p38. A: analisi RT-PCR ha dimostrato che MMP2
e MMP9
mRNA sono stati upregulated in entrambi AGS e MKN-45 cellule in risposta al trattamento con IL-1β; questo effetto è stato bloccato da siRNA p38 o la SB202190 inibitore p38. B: Quantificazione dell'espressione di MMP2
e MMP9
mRNA normalizzato per GAPDH
mRNA. ** P
< 0.05 vs cellule siRNA-trasfettate scramble stimolate con IL-1β. △△ P
< 0.05 vs cellule untransfected stimolate con IL-1β. C: gel zimografia ha mostrato che l'attività MMP2 e MMP9 sono stati upregulated in entrambi AGS e MKN-45 cellule in risposta al trattamento con IL-1β; questo effetto è stato bloccato da siRNA p38 o la SB202190 inibitore p38. D: immunocitochimica colorazione e microscopia confocale hanno confermato che l'IL-1β aumentata attivazione di p38 (rosso), e MMP2 e MMP9 (verde) espressione in cellule MKN-45 GA; questi effetti sono stati bloccati da siRNA p38 o la SB202190 inibitore p38.
Immunocitochimica e microscopia confocale hanno dimostrato che p-p38 è stato debolmente espresso in trattati MKN-45 cellule, che ha espresso anche livelli molto bassi di MMP2 e MMP9. Dopo stimolazione con IL-1β, in modo significativo aumento dei livelli di p-p38, MMP2 e MMP9 sono stati rilevati nelle cellule MKN-45; questi effetti IL-1β-indotti sono stati inibiti da p38 siRNA e SB202190 (Figura 2D). Presi insieme, questi risultati suggeriscono che l'IL-1β attraverso l'invasione p38-indotta e la migrazione delle cellule GA è mediata attraverso la capacità di p-p38 per upregulate MMP2 e MMP9 espressione e l'attività.
Attivazione IL-1β-indotta p38 upregulates MMP2 e MMP9 attivando trascrizione AP-1-dipendente in cellule GA
e 'ben documentato che il fattore di trascrizione attivatore protein-1 (AP-1) può regolare l'espressione di MMP2 e MMP9 [17], e l'attivazione di p38 è in grado di regolare la AP-1 di attivazione [18]. Per esaminare se IL-1β-indotta elevata MMP2 e MMP9 espressione e l'attività di p38-mediata dipendono AP-1, l'attivazione della trascrizione AP-1-dipendente è stata studiata in cellule GA trattate con o senza IL-1β, in la presenza o l'assenza di inibizione p38, utilizzando un saggio AP-1 reporter luciferasi. IL-1β aumentato l'attività di AP-1 in entrambe le linee cellulari GA (figura 3A); Tuttavia, l'inibizione della p38 usando siRNA p38 o cellule pretrattate con inibitore p38 SB202129 ridotto IL-1β-indotta AP-1 in entrambe le linee cellulari GA (Figura 3A). Questi risultati indicano che IL-1β indotta, p38 mediata espressione di MMP2 e MMP9 dipendono AP-1. Figura 3 IL-1β attiva AP-1 attraverso la via p38. R: Sia le cellule GA sono state trasfettate con AP-1 giornalista plasmide o AP-1 giornalista plasmide insieme scramble siRNA o p38 siRNA. AP-1 luciferasi reporter di attività dei geni è risultata significativamente aumentata dalla stimolazione di IL-1β in entrambi AGS e MKN-45 celle; tali effetti sono significativamente inibiti da p38 siRNA in maniera dose-dipendente e anche inibita dalla SB202190 inibitore p38. ** P
< 0,05 vs. controllo siRNA (scramble siRNA) + AP-1 le cellule Luc-trasfettate stimolate con IL-1β; ΔΔP
< 0.05 vs AP-1 le cellule Luc-trasfettate stimolate con IL-1β; relativa attività luciferasi è stato normalizzato a B-gal. B: attivazione p38-mediata IL-1β-indotta di MMP9
promoters dipende dai siti AP-1-binding. ** P
< 0.05 vs trasfettate -670 /MMP9 + controllo cellule siRNA stimolate con IL-1β; ΔΔP
< 0.05 vs transfettate -670 cellule /MMP9 stimolate con IL-1β; ▼▼ P
< 0.05 vs transfettate -570 cellule /MMP9 stimolate con IL-1β; relativa attività luciferasi è stato normalizzato a B-gal.
Al fine di confermare ulteriormente il ruolo di AP-1 in via di p38 di IL-1β-indotta, luciferasi vettori genetici giornalista che contengono i siti AP-1 della MMP9
promotore regioni sono state trasfettate nelle cellule GA. In conformità con i saggi di gene reporter di AP-1, le attività luciferasi del -670 /MMP9
regione del promotore (che contiene due siti di legame di AP-1 [-533 e -79] e un sito di legame di NF-КB [-600 ] [19-21]) significativamente aumentato nelle cellule IL-1β-stimolati (Figura 3B). La trasfezione delle cellule con siRNA p38 o cellule pretrattate con inibitore p38 SB202129 ridotto l'attività della luciferasi IL-1β-indotta di -670 /MMP9
promotore del gene reporter di (Figura 3B). L'attività della luciferasi MMP9
promotore (-571 /MMP9
) non è stato modificato con la cancellazione del sito NFκB vincolante (-600). Inoltre, quando i siti AP-1 (-79 e -533) del MMP9
promotore sono state cancellate (-73 /MMP9
mutanti), l'attività della luciferasi del gene reporter significativamente diminuita rispetto al rispettivo selvaggio geni di tipo di controllo Reporter (Figura 3B). Collettivamente, questi dati indicano fortemente che l'IL-1β induce l'attivazione della via di segnalazione p38, che promuove l'invasione e la migrazione delle cellule GA via upregulation AP-1-dipendente di MMP2 e MMP9 espressione e l'attività.
Knockdown di MMP2 e MMP9 diminuisce la migrazione IL-1β-indotta e l'invasione delle cellule GA
Ad ulteriore conferma che la migrazione delle cellule GA IL-1β-indotta e l'invasione sono associati con up-regolazione di MMP2 e MMP9, AGS e MKN-45 cellule sono state trasfettate con siRNA contro MMP2
o MMP9
, o pretrattati con o senza l'inibitore MMP2 /MMP9 PIF, e poi stimolate con iL-1β. I saggi di migrazione e invasione Transwell hanno dimostrato che la migrazione di IL-1β-indotta e l'invasione delle cellule GA sono stati significativamente attenuati da atterramento di MMP2
o MMP9,
o pre-trattamento con PIF, rispetto alle cellule di controllo (Figura 4A a C). Pertanto, upregulation di MMP2 e MMP9 sono cruciali per IL-1β-indotta migrazione delle cellule GA e invasione. Figura 4 Knockdown di MMP2 e MMP9 o pretrattamento con la MMP2 /9 inibitore PIF inibisce IL-1β-indotta migrazione delle cellule GA e l'invasione in vitro. A: RT-PCR ha confermato l'efficienza della MMP2 e MMP9 siRNA, che ha ridotto in modo significativo, rispettivamente, MMP2
o MMP9
espressione, fino a oltre il 75%. B: IL-1β aumentato la migrazione delle cellule GA e l'invasione in vitro; tali effetti sono stati inibiti da MMP2 o MMP9 siRNA o il MMP2 /9 inibitore PIF. ** P
< 0.05 vs scramble siRNA (controllo siRNA), le cellule transfettate stimolate con IL-1β. I bar sono la media ± SD volte cambia normalizzato al gruppo di controllo nei test di migrazione e l'invasione. C: immagini di microscopia luce rappresentativi di migrazione delle cellule AGS e MKN-45 e l'invasione dei saggi di migrazione e l'invasione Transwell
IL-1β-indotta attivazione di JNK non partecipa nella regolazione della migrazione delle cellule GA e l'invasione
. e 'ben noto che i membri della MAPK svolgono un ruolo importante nella regolazione delle risposte cellulari a citochine e stress, e P38 e JNK sono i principali membri della famiglia MAPK che regolano l'iL-1β vie di segnalazione. Per capire se JNK è anche associato con IL-1β-indotta migrazione cellulare GA e l'invasione, analisi Western blot è stata eseguita per rilevare l'attivazione di JNK in risposta a IL-1β. Come esposto in Figura 5A, p-JNK è stata rilevata in entrambi AGS e linee cellulari MNK-45 dopo stimolazione con IL-1β per 30 min. Tuttavia, i risultati di entrambi i test di migrazione e l'invasione Transwell hanno mostrato che l'aumento della migrazione e l'invasione di entrambi AGS e MKN-45 cellule indotte dalla stimolazione IL-1β non sono stati attenuati da JNK atterramento con siRNA né attenuati attraverso l'inibizione via di JNK con inibitore di JNK SP600125 né (Figura 5B D); Il numero di cellule migrate e invasive quasi non mostrava cambiamenti prima o dopo trasfezione con siRNA contro JNK (P > 0,05) o con o senza pre-trattati con SP600125 inibitore di JNK (P > 0,05). JNK non è stata associata con IL-1β-promosso la migrazione delle cellule GA e invasione essendo state ulteriormente verificate da AP-1 saggio luciferasi giornalista. Come chinasi monte di c-jun (un altro componente importante di AP-1), JNK è in grado di attivare AP-1, e l'attivazione di AP-1 da JNK è strettamente correlata con la funzione di JNK sulla regolazione di vari reazione cellulare compreso il cancro la migrazione cellulare e l'invasione [22]; tuttavia, IL-1β-indotta AP-1 attivazione in entrambe le AGS e MKN-45 cellule non è stata inibita da JNK siRNA né inibitore di JNK SP600125 né (Figura 5E). Tutti insieme, questi dati indicano con forza che l'aumento della migrazione GA e l'invasione promossa da IL-1β non sono regolati dalla JNK. Figura 5 L'attivazione di JNK non è associato con IL-1β-indotta migrazione cellulare GA e invasione. A: p-JNK è stata rilevata da 30 min stimolazione con IL-1β in AGS e linee cellulari MKN-45. B: Transfection di siRNA JNK abbattuto espressione JNK in entrambe le due linee di cellule GA. C-D: Il trattamento delle cellule GA con IL-1β aumento della migrazione delle cellule e l'invasione in vitro; questi effetti non sono stati inibiti da JNK siRNA né l'inibitore di JNK SP600125 percorso. ** P
< 0.05 cellule siRNA-trasfettate vs. scramble stimolate con IL-1β; △△ P
< 0.05 vs cellule untransfected (cellule wild type) stimolate con IL-1β; ## O ●● alcuna significativa differenza tra i due gruppi è stata rilevata (P
> 0,05). Bar hanno indicato la media ± SD numero di cellule per campo di vista nei test di migrazione e l'invasione. D: immagini luce microscopio rappresentativi di AGS e la migrazione delle cellule MKN-45 e l'invasione dei saggi Transwell. E: Sia le cellule GA sono state trasfettate con AP-1 giornalista plasmide o AP-1 giornalista plasmide insieme scramble siRNA o JNK siRNA. AP-1 luciferasi reporter di attività dei geni è risultata significativamente aumentata dalla stimolazione di IL-1β in entrambi AGS e MKN-45 celle; questi effetti non sono stati inibiti da JNK siRNA né inibiti dal SP600125 inibitore di JNK nessuno dei due. ** P
< 0,05 vs. controllo siRNA (scramble siRNA) + AP-1 le cellule Luc-trasfettate stimolate con IL-1β; ΔΔP
< 0.05 vs AP-1 le cellule Luc-trasfettate stimolate con IL-1β; ## O ●● alcuna significativa differenza tra i due gruppi è stata rilevata (P
> 0,05). l'attività luciferasi relativa è normalizzata a B-gal.
fosfo-p38 è upregulated e correla con l'espressione di IL-1β, MMP2, MMP9 e c-fos nei tessuti umani GA
L'espressione di p-p38 in un serie di 105 tessuti GA e tessuti gastrici non neoplastiche appaiati è stata esaminata mediante immunoistochimica (IHC). Dei campioni 105 tumorali, 53 casi di tessuti GA (50.48%) esposte sovraespressione di p-p38 rispetto ai tessuti gastrici non neoplastiche appaiati (P ​​
< 0,05; la figura 6A). espressione positiva p-p38 è stata spesso osservata in entrambi citoplasma delle cellule GA e nucleo. Figura 6 p38 fosforilato è sovraespresso in GA umana, e l'espressione di p-p38 correla positivamente con IL-1β, MMP2, MMP9 e l'espressione di c-fos nei tessuti GA. A: sovraespressione di p-p38 è stata frequentemente osservata nei tessuti GA, rispetto ai tessuti gastrici non neoplastiche appaiati. a, P-p38 non è stata rilevata o solo debolmente espressa nei tessuti gastrici non-neoplastiche. B a E: diverse intensità di espressione p-p38 positivo nei tessuti GA. B: L'espressione di p-p38 correlata positivamente con IL-1β, MMP2, MMP9, e l'espressione di c-fos nei tessuti umani GA. campione di tessuto GA esibendo forte espressione di IL-1β e più forte p-p38, MMP2, MMP9 e l'espressione di c-fos; e più debole di IL-1β espressione e debole p-p38, MMP2, MMP9 e l'espressione di c-fos. C: I punteggi somma di intensità colorazione positiva di IHC per p-p38. ** P
< . 0.05 vs accoppiato tessuti gastrici non neoplastici
Nessuna associazione significativa è stata osservata tra sovraespressione di p-p38 di età dei pazienti (< 50 o ≥ 50 anni), il sesso, dimensioni del tumore (< 3 cm o ≥ 3 centimetri), il tipo istologico, o grado di differenziazione. Tuttavia, l'iperespressione di p-p38 visualizzata significativamente correlata con metastasi linfonodali (P
< 0,05), e l'invasione oltre la sierosa (P
< 0,05). Questi dati suggeriscono che la sovraespressione di p-p38 è associata con metastasi nei GA umana.
Come esposto nella Figura 6B, l'espressione di p-p38 mostrava una buona correlativity con i livelli di IL-1β, MMP2, MMP9 e AP-1 (c-fos) nel tessuto GA, e una significativa correlazione tra l'espressione elevata p-p38 e upregulation di iL-1β, MMP2, MMP9 e c-fos nel tessuto GA (r = 0.72, p < 0,01; r = 0.63, p < 0,01; r = 0.58, p < 0,05 e r = 0.69, p < 0,01) è stato rilevato quando analizzato con il metodo di Spearman
I punteggi somma di intensità colorazione positiva di IHC per p-p38 in entrambi i 105 casi di GA. tessuti e tessuti neoplastici gastrici non appaiati sono stati esposti nella figura 6C.
saggio Invasion in topi nudi
MKN-45 cellule trasfettate con un siRNA o p38 siRNA strapazzate sono stati iniettati nella vena della coda di topi BALB /c nu /nu topi; IL-1β o PBS sono stati iniettati per via intraperitoneale dal giorno delle cellule sono stati iniettati per 14 giorni. Gruppo 1 sono stati iniettati con PBS e strapazzate MKN-45 cellule siRNA-transfettate; gruppo 2 sono stati iniettati con IL-1β e strapazzate MKN-45 cellule siRNA-transfettate; e il gruppo 3 sono stati iniettati con p38 siRNA-trasfettate MKN-45 cellule e IL-1β
A 45 giorni dopo l'iniezione delle cellule, tutti gli animali. (6/6; 100%) nel gruppo di IL-1β trattati avevano sviluppato metastasi polmonari (Figura 7A a D) (gruppo 2; media di foci metastatici in 6 sezioni di polmone è stato il 14 per i polmoni). Al contrario, un minor numero di animali (2 /6,33.33%) nel gruppo di controllo che non sono stati iniettati con IL-1β avevano sviluppato metastasi polmonari (gruppo 1; media di 6 metastasi in 6 delle sezioni polmonari per polmone). Considerando che, solo due animali del gruppo di p38 siRNA più IL-β-trattati sviluppato metastasi polmonari e il numero di metastasi polmonari in questo gruppo era significativamente più bassa (gruppo 3, media di 4 metastasi in 6 sezioni polmonari per polmone) e significativamente più piccola da quella del gruppo corrispondente trattato con iL-1β (gruppo 2) (Figura 7A a D). Figura 7 stimolazione IL-1β aumenta il potenziale metastatico delle cellule GA in vivo tramite un meccanismo p38-dipendente. A: metastasi polmonari Rappresentante formate nel topo gruppo diverso. B: Bar indicato il numero di animali ha sviluppato metastasi polmonari. C: I risultati rappresentativi di HE colorazione di metastasi polmonari. D: Bar indicato la media ± SD numero di focolai metastatico in 6 sezioni polmonari /al polmone nei topi che avevano sviluppato metastasi polmonari. △△ P
< 0.05 vs iniettato con cellule trasfettate scramble siRNA più stimolazione IL-1β. E: analisi RT-PCR di p38, MMP2, MMP9
e c-fos
mRNA espressione nelle metastasi polmonari di diversi topi. analisi IHC di p-p38, MMP2, MMP9 e l'espressione della proteina c-fos nelle metastasi polmonari;: F IL-1β indotta elevata p-p38, MMP2, MMP9 e l'espressione della proteina c-fos.
Ad ulteriore conferma se p38, MMP2 e MMP9 sono coinvolti in IL-1β-indotta metastasi polmonari di cellule GA, e determinare se questo processo è regolata da AP-1, i livelli di espressione di mRNA di p38, MMP2, MMP9
e c-fos
(una componente chiave della AP-1) nel polmone metastatico sono stati quantificati mediante RT-PCR, e p-p38 , MMP2, MMP9 e l'espressione della proteina c-fos nelle sezioni polmonari sono stati esaminati utilizzando IHC. Come mostrato in figura 7 E e F, i livelli di espressione di p-p38, MMP2, MMP9 e c-fos nelle foci metastatici polmonari sono stati elevati in risposta a IL-1β. Attivazione di p38 e l'mRNA o espressione proteica livelli di p38, MMP2, MMP9 e c-fos erano inferiori nelle metastasi formate dalle cellule trasfettate con p38 siRNA plus-β-trattati IL gruppo (group3) o nel gruppo di controllo (gruppo 1 ) rispetto alle metastasi formate da scramble siRNA inclusa gruppo iL-β-trattato (gruppo 2) (Figura 7E e F). Nel loro insieme, i dati in vivo confermano, inoltre, che l'IL-1β-indotta metastasi delle cellule GA è mediata da p38 segnalazione via AP-1 upregulation dipendente di MMP2 e MMP9.
Discussione
Una serie di studi hanno suggerito che IL- 1β è in grado di attivare p38 e JNK [11, 12], e p38 e JNK giocare un ruolo importante nella migrazione delle cellule tumorali e l'invasione [14, 23-26]. Pertanto, abbiamo ipotizzato che l'IL-1β può contribuire alla invasione delle cellule e metastasi GA tramite l'attivazione dei percorsi di p38 e JNK. Per studiare questa possibilità, abbiamo valutato la capacità di IL-1β per attivare p38 e JNK, e promuovere la migrazione e l'invasione delle cellule GA. I nostri risultati hanno dimostrato che l'IL-1β potrebbe attivare sia p38 e JNK, e aumentare GA migrazione cellulare e dell'invasione, e che questi effetti potrebbero essere inibiti da p38 siRNA o l'inibitore p38 SB 202190, ma non JNK siRNA o inibitore di JNK SP600125. Questa è la prima dimostrazione che IL-1β può indurre la migrazione delle cellule GA e l'invasione attraverso l'attivazione di p38; tuttavia, i meccanismi molecolari alla base con cui l'IL-β-mediata segnalazione p38 è regolato durante la carcinogenesi gastrica restano in gran parte sconosciute.
Un potenziale meccanismo attraverso il quale p38 potrebbe aumentare l'invasione e la migrazione delle cellule tumorali è elevando i livelli di MMP [ ,,,0],27]. E 'ben noto che la secrezione di MMP con la capacità di degradazione della matrice extracellulare (ECM) è una caratteristica delle cellule tumorali metastatiche [28]. MMP2 e MMP9 sono due dei più MMP ben caratterizzati e sono strettamente associati con l'invasione del cancro e metastasi a causa della loro forte attività proteolitica della ECM [29]. Riportiamo qui anche per la prima volta che il meccanismo molecolare probabile con cui IL-1β promuove la migrazione cellulare GA e invasione può comportare la IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & MMP9 percorso di segnalazione. Abbiamo dimostrato che sia MMP2 e MMP9 sono stati upregulated in cellule GA in risposta alla stimolazione IL-1β; tali effetti sono stati inibiti da siRNA contro p38, MMP2
o MMP9
, il SB202190 inibitore p38, e la MMP2 /9 inibitore PIF. Inoltre, l'abbattimento di MMP2
o MMP9
utilizzando siRNA, o l'inibizione di MMP2 /9 attività utilizzando PIF, significativamente diminuita IL-1β-indotta migrazione delle cellule GA e invasione. Come una proteina chinasi serina /treonina, p38 è in grado di indurre l'attivazione del fattore di trascrizione AP-1 [30]. Abbiamo inoltre scoperto che l'IL-1β-indotta, p38-mediata upregulation di MMP2 e MMP9 erano AP-1-dipendente. IL-1β è stato solo in grado di attivare la trascrizione di MMP9
regioni promotrici contenenti AP-1 siti, e questi effetti sono stati attenuati da p38 siRNA e la SB202190 inibitore p38. attivazione Inoltre, IL-1β-indotta della trascrizione AP-1-dipendente è stata inibita da p38 siRNA.
fosfo-p38 (p-p38), la forma attivata di p38, potrebbe essere rilevato in circa il 50% di GA umana campioni di tessuto testati da test IHC, e l'espressione di p-p38 era significativamente associato con metastasi linfonodali, e l'invasione oltre la sierosa nei pazienti con GA. Inoltre, l'espressione di IL-1ß positivamente correlata con l'espressione di p-p38, MMP2, MMP9 e c-fos nei campioni clinici GA. Inoltre, in vivo dati del test di metastasi dimostrato che la formazione di metastasi polmonari foci dalle cellule GA, e p38 /
p-p38, MMP2, MMP9 e mRNA e la proteina c-fos nelle foci metastatici polmonari erano elevati by IL-1β, e ridotta mediante iniezione di cellule trasfettate con p38 siRNA. Presi insieme, questi dati suggeriscono fortemente che la migrazione delle cellule GA IL-1β-indotta e l'invasione avvengono attraverso l'attivazione della via di segnalazione p38 che porta ad AP-1 attivazione e upregulation di MMP2 e MMP9. Pertanto, p38 svolge un ruolo essenziale nella metastasi IL-1β-indotta in GA.
JNK è un altro MAPK importante essere ben noto a svolgere un ruolo importante nella regolazione di segnalazione IL-1β in più celle differenti [14, 31]. Tuttavia, in questo studio, JNK è risultato essere non coinvolto nella regolazione di IL-1β-indotta migrazione cellulare GA e invasione. JNK siRNA e inibitore di JNK non attenuano IL-1β indotto la migrazione delle cellule GA e l'invasione, ne attenuano attivazione di AP-1 indotta da IL-1β. la migrazione delle cellule GA Pertanto, IL-1β-promosso e l'invasione sono regolati da p38, ma non da JNK.
In sintesi, abbiamo identificato per la prima volta che l'IL-1β è funzionalmente coinvolta nella regolazione di metastasi a GA via attivazione di p38. Questo meccanismo molecolare coinvolge AP-1-dipendente upregulation p38-mediata sia MMP2 e MMP9; e questo studio suggerisce fortemente che l'IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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