IL-1β-induceret aktivering af p38 fremmer metastase i gastrisk adenocarcinom via opregulering af AP-1 /c-fos, MMP2 og MMP9

IL-1β-induceret aktivering af p38 fremmer metastase i gastrisk adenocarcinom via opregulering af AP-1 /c-fos, MMP2 og MMP9
Abstract
Baggrund
Interleukin-1β (IL-1β) er blevet impliceret i progression af gastrisk adenocarcinom (GA); imidlertid er molekylære virkningsmekanismer af IL-1β i GA dårligt karakteriseret. P38 og JNK er de store MAPK familiemedlemmer, der regulerer IL-1β signalveje. Her, undersøgte vi den rolle, både p38 og JNK i IL-1β-induceret GA cellemigration, invasion og metastatisk potentiale. Salg Fremgangsmåder
Virkningerne af IL-1β-induceret p38 og JNK-aktivering i GA-celler blev bestemt anvendelse af in vitro Transwell migration og invasion assays af MKN-45 og AGS-celler eller en in vivo metastase-assay i nøgne mus. IL-1β-induceret p38-signalvejen blev yderligere karakteriseret i GA-celler. Aktivering af IL-1β /p38-signalvejen blev også vurderet i humane primære GA væv ved immunhistokemi.
Resultater Salg IL-1β-induceret aktivering af p38 forøgede GA cellemigration og invasion in vitro og fremmet metastatiske potentiale GA celler in vivo; Disse effekter blev svækket ved p38 siRNA eller p38-inhibitor SB202190. MMP2 eller MMP9 siRNAs og MMP2 /9 inhibitor BIPS inhiberede også IL-1β-induceret GA cellemigration og invasion in vitro. IL-1β-induceret p38-aktivering signifikant øget MMP2 og MMP9 mRNA og proteinekspression og aktivitet. Luciferase reporter assays viste, at aktivatorproteinet-1 (AP-1) og de AP-1 bindingssteder i MMP9
promotoren (-670 /MMP9) blev aktiveret med IL-1β-induceret p38-aktivering. Phospho-p38 blev signifikant opreguleret i humane GA væv (sammenlignet med matchede ikke neoplastiske væv), og signifikant associeret med lymfeknudemetastaser, og invasion ud over serosa. Ekspression af phospho-p38 signifikant korreleret med IL-1β, MMP2, MMP9, og c-fos-ekspression i både humane væv og GA GA celle metastaser i lungerne hos nøgne mus. IL-1β var også i stand til at aktivere JNK i GA-celler, men aktivering af JNK var ikke forbundet med GA cellemigration og invasion. Derfor IL-1β-inducerede migration og invasion i GA-celler blev reguleret af p38, men ikke af JNK.
Konklusioner Salg IL-1β-induceret p38-aktivering og IL-1β /p38 /AP-1 ( c-fos) /MMP2 & MMP9 pathway spille en vigtig rolle i metastase i GA; denne vej kan tilvejebringe en ny terapeutisk mål for GA.
Nøgleord
IL-1β p38 Gastrisk adenocarcinom MMP2 og MMP9 AP-1 Metastase Baggrund
Stigende beviser indikerer, at tumorer fremmes og støttes af inflammatoriske signaler fra tumoren mikromiljø, og tumormikromiljøet spiller vigtige roller i forbindelse med fremme af cancer [1, 2]. Cytokiner, især cytokiner udskilt af tumorceller, er væsentlige dele af tumor mikromiljø. Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), interleukin-1β (IL-β) og IL-6 er de mest velkarakteriserede cytokiner, som har vist sig at være tæt forbundet med udviklingen af ​​kræft. Mange undersøgelser har vist, at inflammation er induceret af cytokiner spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​gastrisk cancer [3]. Det er velkendt, at infektioner, især dem fremkaldt af Helicobacter pylori,
er stand til at inducere gastriske mucosale inflammatoriske responser, hvilket resulterer i opregulering af IL-1β, hvilket igen kan fremme inflammation-associerede carcinogenese [4]. Men de underliggende molekylære mekanismer for rollen af ​​IL-1β signalering i gastrisk carcinogenese stort set ukendt, og i øjeblikket er af interesse.
P38 er et medlem af mitogen-aktiveret proteinkinase (MAPK) superfamilien. MAPK signalveje er blevet godt undersøgt, og består af mindst tre overfamilier af MAPK'er som regulerer forskellige cellulære [5] aktiviteter. Det er velkendt, at p38 MAPK er stand til at regulere mange cellulære responser til cytokiner og stress, herunder IL-1β [6]; imidlertid påvist nylige data, at p38 også er nært knyttet til udviklingen af ​​forskellige typer af human cancer via dets evne til at løfte kræft cellemigration og invasion som reaktion på forskellige stimuli, herunder inflammatoriske [6] faktorer. Derudover er p38 også involveret i reguleringen af ​​celledifferentiering og apoptose. Fire isoformer af p38 er blevet identificeret indtil nu: p38-α, p38-β, p38-γ, og p38-δ [7]. Selvom aminosyresekvenserne af disse p38 MAPK'er er næsten identiske, ekspressionsmønsteret for hver isoform varierer [8]. P38-α er den største p38 MAPK og udtrykkes allestedsnærværende, er p38-β hovedsageligt udtrykt i hjernen, mens p38γ er rigeligt til udtryk i skeletmuskulatur [9] og p38-δ er primært udtrykt i endokrine kirtler [10]. Mange undersøgelser har også vist, at p38 deltager i IL-1p signaleringskaskader i et sæt af celletyper, især i muse embryonale fibroblast (MEF)-celler og makrofager celler [11, 12]; imidlertid meget lidt om funktionen af ​​IL-1β-aktiveret p38 i gastrisk cancer.
c-Jun N-terminal kinase (JNK) er en anden MAPK familiemedlem, som er også kendt for at spille en vigtig rolle i reguleringen IL-1β-signalvejen [13]. Ud over at deltage i reguleringen inflammatorisk signal pathway, JNK udfører flere andre vigtige cellulære funktioner, herunder regulering af cellevækst, differentiering, overlevelse og apoptose. Desuden seneste undersøgelser viser, at JNK er ofte overudtrykt i forskellige kræft væv, og opregulering af JNK kan være tæt forbundet med cancer invasion [14]; imidlertid, om JNK deltager i reguleringen af ​​IL-1β-induceret gastrisk cancer cellemigration og invasion forbliver stort set ukendt
gastrisk adenocarcinom (GA) er den mest almindelige neoplastiske tumor i maven.; Derfor har vi fokuseret på GA i denne undersøgelse. Her undersøgte vi aktiveringen af ​​p38 og JNK som respons på IL-1β, og deres virkning på IL-1β-inducerede metastatiske potentiale GA celler in vitro eller in vivo.
Derudover ekspressionen af ​​phospho-p38 (p- p38) i GA, blev dens forhold til de clinicopathologic funktioner i GA, og korrelationen mellem ekspression af IL-1β og p-p38 undersøgt i humane paraffinindlejrede GA væv ved hjælp af immunhistokemi. Endelig har vi kendetegnet også de molekylære mekanismer, der regulerer IL-1β-induceret p38-medieret metastatiske potentiale GA celler.
Resultater Salg IL-1β-induceret aktivering af p38 fremmer GA cellemigration og invasion in vitro
først undersøgte vi, om IL-1β var i stand til at aktivere p38 signalering i GA celler. Som vist i figur 1, blev aktivering af p38 (p-p38) påvist i begge GA cellelinjer (AGS og MKN-45-celler) efter behandling med IL-1β i 30 minutter; IL-1β-induceret aktivering af p38 blev inhiberet af p38-inhibitoren SB202190 (figur 1A). Figur 1 IL-1β fremmer GA cellemigration og invasion ved at aktivere p38. A: Western blots bekræftede, at p-p38 kunne induceres af 30 minutters stimulering med IL-1β i AGS og MKN-45 cellelinier; aktivering af p38 ved hjælp af IL-1β blev inhiberet af p38-inhibitor SB202190. B: Transfektion af p38 siRNA slået ned p38-ekspression i begge de to GA cellelinier. C-F: Behandling af GA-celler med IL-1β forøgede cellemigration og invasion in vitro; Disse effekter blev inhiberet af p38 siRNA eller p38 pathway inhibitor SB202190. ** P
< 0,05 over scramble siRNA (kontrol siRNA) transficerede celler stimuleret med IL-1β; △△ P
< 0,05 i forhold til utransficerede celler (vildtype celler) stimuleret med IL-1β. Barer angiver middelværdien ± SD antal celler pr synsfelt (× 400 forstørrelse) i migrationen og invasion assays. G:. Repræsentative lysmikroskop billeder af AGS og MKN-45 cellemigration og invasion i Transwell assays
P38 kan fremme migration og invasion af forskellige cancerceller [15]. For at undersøge om IL-1β kan fremme migration og invasion af GA celler via aktivering p38 signalering, GA celler transficeret med en kodet siRNA (kontrol siRNA) eller p38 siRNA, eller GA-celler forbehandlet med eller uden p38 pathway inhibitor SB202190 var stimuleret med IL-1β. Transwell migration og invasion analyser viste, at IL-1β stimulering øget migration og invasion af både AGS og MKN-45 celler; dog IL-1β-induceret GA migration og invasion celle blev væsentligt svækket ved knockdown af p38 ved hjælp siRNA (figur 1B til G) eller forbehandling med SB202190 (figur 1C til G). Tilsammen disse data tyder på, at IL-1β forfremmet GA celle migration og invasion er medieret af p38.
IL-1β-induceret aktivering af p38 opregulerer MMP2 og MMP9 udtryk og aktivitet i GA celler
MMP2 og MMP9 har vist sig at spille en vigtig rolle i cancercelleinvasion og metastase [16]. At undersøge, om MMP2 og MMP9 deltager også i IL-1β-induceret p38-regulerede metastatiske potentiale GA-celler, blev RT-PCR, immunocytokemi og konfokal mikroskopi, og zymografi assay udført for at bestemme MMP2 og MMP9-ekspression og aktivitet i GA cellelinier transficeret med kontrol siRNA eller p38 siRNA, eller forbehandlet med eller uden p38-inhibitoren SB202190, og derefter behandlet med eller uden IL-1β. Som forventet blev MMP2 og MMP9 udtryk og aktivitet forhøjet i respons på IL-1β behandling (figur 2A til C). Knockdown af p38 ved hjælp siRNA, eller forbehandling med p38-inhibitoren SB202190 faldt betydeligt Il-1β-induceret MMP2 og MMP9 mRNA-ekspression og aktivitet i begge GA cellelinier (figur 2A til C). Figur 2 IL-1β opregulerer MMP2 og MMP9-ekspression og aktivitet ved at aktivere p38. A: RT-PCR-analyse viste, at MMP2
og MMP9
mRNA blev opreguleret i både AGS og MKN-45 celler som respons på behandling med IL-1β; denne virkning blev blokeret af p38 siRNA eller p38-inhibitor SB202190. B: Kvantificering af ekspressionen af ​​MMP2
og MMP9
mRNA normaliseret til GAPDH
mRNA. ** P
< 0,05 vs. kapløbet siRNA-transficerede celler stimuleret med IL-1β. △△ P
< 0,05 vs. utransficerede celler stimuleret med IL-1β. C: gelzymografi viste, at MMP2 og MMP9-aktivitet blev opreguleret i både AGS og MKN-45 celler som respons på behandling med IL-1β; denne virkning blev blokeret af p38 siRNA eller p38-inhibitor SB202190. D: immuncytokemisk farvning og konfokal mikroskopi bekræftede, at IL-1β forøgede aktivering af p38 (rød), og MMP2 og MMP9 (grøn) ekspression i MKN-45 GA celler; Disse effekter blev blokeret af p38 siRNA eller p38-inhibitoren SB202190.
Immunocytokemi og konfokal mikroskopi viste, at p-p38 svagt blev udtrykt i ubehandlede MKN-45-celler, som også er udtrykt meget lave niveauer af MMP2 og MMP9. Efter stimulation med IL-1β, signifikant øgede niveauer af p-p38, blev MMP2 og MMP9 påvist i MKN-45 celler; disse IL-1β-inducerede virkninger blev inhiberet af p38 siRNA og SB202190 (figur 2D). Samlet set viser disse resultater kraftigt
tyder på, at IL-1β ved p38-induceret invasion og migration af GA-celler medieres via evnen hos p-p38 at opregulere MMP2 og MMP9-ekspression og aktivitet. IL-1β-induceret aktivering af p38 opregulerer MMP2 og MMP9 ved at aktivere AP-1-afhængig transskription i GA-celler
det er veldokumenteret, at transkriptionsfaktoren aktivator protein-1 (AP-1) kan regulere ekspressionen af ​​MMP2 og MMP9 [17], og aktivering af p38 er i stand til at regulere AP-1-aktivering [18]. For at undersøge, om IL-1β-induceret p38-medieret forhøjet MMP2 og MMP9-ekspression og aktivitet er afhængige af AP-1, blev aktiveringen af ​​AP-1-afhængig transskription undersøgt i GA-celler behandlet med eller uden IL-1β, i nærvær eller fravær af p38-inhibering, under anvendelse af en AP-1 luciferase reporter assay. IL-1β forøgede aktiviteten af ​​AP-1 i begge GA cellelinier (figur 3A); imidlertid inhibering af p38 ved hjælp af p38 siRNA eller forbehandlede celler med p38-inhibitor SB202129 reducerede IL-1β-induceret AP-1-aktivitet i begge GA cellelinier (figur 3A). Disse resultater indikerer, at IL-1β-induceret p38-medieret ekspression af MMP2 og MMP9 er afhængige af AP-1. Figur 3 IL-1β aktiverer AP-1-aktivitet gennem p38 pathway. A: Begge GA-celler blev transficeret med AP-1 reporterplasmid eller AP-1 reporterplasmid sammen med scramble siRNA eller p38 siRNA. AP-1 luciferasereportergen aktivitet var signifikant forhøjet ved IL-1β-stimulering i både AGS og MKN-45 celler; Disse effekter blev signifikant inhiberet af p38 siRNA på en dosis-afhængig måde, og også inhiberet af p38-inhibitor SB202190. ** P
< 0,05 over for kontrol siRNA (scramble siRNA) + AP-1 luc-transficerede celler stimuleret med IL-1β; ΔΔP
< 0,05 over AP-1 luc-transficerede celler stimuleret med IL-1β; relativ luciferaseaktivitet blev normaliseret til B-gal. B: IL-1β-induceret p38-medieret aktivering af MMP9
promotorer er afhængig af de AP-1-bindingssteder. ** P
< 0,05 over transficeret -670 /MMP9 + kontrol siRNA-celler stimuleret med IL-1β; ΔΔP
< 0,05 over transficeret -670 /MMP9 celler stimuleret med IL-1β; ▼▼ P
< 0,05 over transficeret -570 /MMP9 celler stimuleret med IL-1β; relativ luciferaseaktivitet blev normaliseret til B-gal.
For yderligere at bekræfte den rolle, AP-1 i IL-1β-induceret p38 pathway, luciferasereportergenet vektorer, der indeholder AP-1 stederne i MMP9
promotoren regioner blev transficeret ind i GA-celler. I overensstemmelse med de AP-1 reportergenassays, luciferase aktiviteter -670 /MMP9
promotorregion (indeholdende to AP-1 bindingssteder [-533 og -79] og en NF-КB bindingssted [-600 ] [19-21]) signifikant forøget i IL-1β-stimulerede celler (figur 3B). Transfektion af cellerne med p38 siRNA eller forbehandlede celler med p38-inhibitor SB202129 reducerede IL-1β-inducerede luciferaseaktivitet af -670 /MMP9
promotorreportergen (figur 3B). Luciferaseaktiviteten af ​​MMP9
promotor (-571 /MMP9
) blev ikke ændret ved sletning af NFKB-bindingssted (-600). Endvidere, når de AP-1 steder (-79 og -533) af MMP9
promotoren blev deleteret (-73 /MMP9
mutanter), luciferaseaktiviteten af ​​reportergenet faldet betydeligt, sammenlignet med den respektive vild -type kontrol reportergener (figur 3B). Kollektivt disse data stærkt indikerer, at IL-1β inducerer aktivering af p38-signalvejen, som fremmer invasion og migration af GA celler via AP-1-afhængige opregulering af MMP2 og MMP9-ekspression og aktivitet.
Knockdown af MMP2 eller MMP9 reducerer IL-1β-inducerede migration og invasion i GA-celler
for yderligere at bekræfte, at IL-1β-induceret GA cellemigration og invasion er forbundet med opregulering af MMP2 og MMP9, AGS og MKN-45 celler blev transficeret med siRNAs mod MMP2
eller MMP9
eller forbehandlet med eller uden MMP2 /MMP9 inhibitor bips, og derefter stimuleret med IL-1β. Transwell migration og invasion-assays viste, at IL-1β-inducerede migration og invasion af GA-celler blev signifikant svækket ved knockdown af MMP2
eller MMP9,
eller forbehandling med bips, sammenlignet med kontrolceller (figur 4A til C). Derfor opregulering af MMP2 og MMP9 er afgørende for IL-1β-induceret GA cellemigration og invasion. Figur 4 Knockdown af MMP2 eller MMP9 eller forbehandling med MMP2 /9-inhibitor BIPS inhiberer IL-1β-induceret GA cellemigration og invasion in vitro. A: RT-PCR bekræftede effektiviteten af ​​MMP2 eller MMP9 siRNAs, som væsentligt reduceret MMP2
eller MMP9
udtryk, henholdsvis med op til mere end 75%. B: IL-1β forøgede GA cellemigration og invasion in vitro; disse effekter blev hæmmet af MMP2 eller MMP9 siRNA eller MMP2 /9-hæmmer bips. ** P
< 0,05 over scramble siRNA (kontrol siRNA) transficerede celler stimuleret med IL-1β. Barer er middelværdien ± SD fold skifter normaliseret til kontrolgruppen i migrationen og invasion assays. C: Repræsentative lys mikroskopi billeder af AGS og MKN-45 celle migration og invasion i migrations- og invasion assays Transwell
IL-1β-induceret aktivering af JNK deltager ikke i reguleringen af ​​GA celle migration og invasion
. det er velkendt, at medlemmer af MAPK spiller vigtige roller i reguleringen af ​​cellulære reaktioner på cytokiner og stress, og P38 og JNK er de store MAPK familiemedlemmer, der regulerer IL-1β signalveje. For at forstå, om JNK også er associeret med IL-1β-induceret GA cellemigration og invasion, blev Western blot-analyse udført for at detektere aktiveringen af ​​JNK som respons på IL-1β. Som udstillet i figur 5A, blev p-JNK detekteret i begge AGS og MNK-45 cellelinier efter stimulation med IL-1β i 30 minutter. begge resultaterne af Transwell migration og invasion-assays viste, at den forøgede migration og invasion af både AGS og MKN-45-celler induceret af IL-1β-stimulering ikke blev svækket ved knockdown JNK med siRNA eller svækket ved hæmning JNK med JNK inhibitor SP600125 hverken (figur 5B til D); Antallet af migrerede og invasive celler næsten ikke viste ændring før eller efter transfektion med siRNA mod JNK (P > 0,05) eller med eller uden forbehandlet med JNK inhibitor SP600125 (P > 0,05). JNK var ikke forbundet med IL-1β-fremmet migration og invasion GA celle er blevet yderligere bekræftet af AP-1 luciferase reporter assay. Som opstrømskinase af c-jun (en anden vigtig komponent i AP-1), JNK er i stand til at aktivere AP-1, og aktiveringen af ​​AP-1 ved JNK er tæt forbundet med JNK funktion på regulering af forskellige cellulære reaktion, herunder cancer cellemigration og invasion [22]; dog IL-1β-induceret AP-1-aktivering i begge AGS og MKN-45-celler blev ikke inhiberet af JNK siRNA eller JNK-inhibitor SP600125 hverken (figur 5E). Alle sammen, disse data indikerer kraftigt, at den øgede GA migration og invasion fremmes af IL-1β ikke er reguleret af JNK. Figur 5 Aktiveringen af ​​JNK er ikke forbundet med IL-1β-induceret GA cellemigration og invasion. A: p-JNK blev påvist ved 30 min stimulation med IL-1β i AGS og MKN-45 cellelinjer. B: Transfektion af JNK siRNA slået ned JNK-ekspression i begge de to GA cellelinier. C-D: Behandling af GA-celler med IL-1β forøgede cellemigration og invasion in vitro; Disse virkninger blev ikke inhiberet af JNK siRNA eller JNK inhibitor SP600125. ** P
< 0,05 vs. kapløbet siRNA-transficerede celler stimuleret med IL-1β; △△ P
< 0,05 i forhold til utransficerede celler (vildtype celler) stimuleret med IL-1β; ## Eller ●● ingen signifikant forskellige mellem disse to grupper blev påvist (P
&0,05). Bars angivet middelværdien ± SD af celler pr synsfelt i migrationen og invasion-assays. D: Repræsentative lysmikroskop billeder af AGS og MKN-45 cellemigration og invasion i Transwell assays. E: Begge GA-celler blev transficeret med AP-1 reporterplasmid eller AP-1 reporterplasmid sammen med scramble siRNA eller JNK siRNA. AP-1 luciferasereportergen aktivitet var signifikant forhøjet ved IL-1β-stimulering i både AGS og MKN-45 celler; Disse virkninger blev ikke inhiberet af JNK siRNA eller inhiberet af JNK-inhibitor SP600125 hverken. ** P
< 0,05 over for kontrol siRNA (scramble siRNA) + AP-1 luc-transficerede celler stimuleret med IL-1β; ΔΔP
< 0,05 over AP-1 luc-transficerede celler stimuleret med IL-1β; ## Eller ●● ingen signifikant forskellige mellem disse to grupper blev påvist (P
&0,05). Relativ luciferaseaktivitet blev normaliseret til B-gal.
Phospho-p38 opreguleres og korrelerer med ekspression af IL-1β, MMP2, MMP9 og c-fos i humane GA væv
Ekspressionen af ​​p-p38 i en serie af 105 GA væv og de parrede ikke neoplastiske gastriske væv blev undersøgt ved immunhistokemi (IHC). Af de 105 cancer prøver, 53 tilfælde af GA væv (50.48%) udviste overekspression af p-p38 sammenlignet med de parrede ikke neoplastiske gastriske væv (P
< 0,05, figur 6A). Positiv p-p38-ekspression hyppigt observeret i både GA celle cytoplasmaet og kernen. Figur 6 Phosphoryleret p38 overudtrykkes i human GA, og ekspressionen af ​​p-p38 positivt korrelerer med IL-1β, MMP2, MMP9 og c-fos-ekspression i GA væv. A: Overekspression af p-p38 blev ofte observeret i GA væv, sammenlignet med de parrede ikke neoplastiske gastriske væv. a, blev P-p38 ikke fundet eller kun svagt udtrykt i ikke-neoplastiske gastriske væv. B til E: forskellige intensiteter af positiv p-p38-ekspression i GA væv. B: Ekspression af p-p38 positivt korreleret med IL-1β, MMP2, MMP9, og c-fos-ekspression i humane GA væv. vævsprøve GA udviser stærkere IL-1β ekspression og stærkere p-p38, MMP2, MMP9 og c-fos-ekspression; og svagere IL-1β ekspression og svag p-p38, MMP2, MMP9 og c-fos-ekspression. C: Summen snesevis af positiv farvning intensiteten af ​​IHC for p-p38. ** P
< . 0,05 vs. parret ikke neoplastiske gastrisk væv
nogen signifikante associationer blev observeret mellem overekspression af p-p38 i patienternes alder (< 50 eller ≥ 50 år), køn, tumorstørrelse (< 3 cm eller ≥ 3 cm), histologisk type eller kvalitet af differentiering. Imidlertid overekspression af p-p38 de viste signifikant relateret med lymfeknudemetastaser (P
< 0,05), og invasion ud serosa (P
< 0,05). Disse data antyder, at overekspression af p-p38 er associeret med metastase i human GA.
Som udstillet i figur 6B, ekspressionen af ​​p-p38 viste god correlativity med niveauerne af IL-1β, MMP2, MMP9 og AP-1 (c-fos) i GA væv, og en signifikant sammenhæng mellem den forhøjede p-p38-ekspression og opregulering af IL-1β, MMP2, MMP9 og c-fos i GA væv (r = 0,72, p < 0,01; r = 0,63, p < 0,01; r = 0,58, p < 0,05 og r = 0,69, p < 0,01) blev påvist ved analyse ved Spearman metode
Den sum snesevis af positiv farvning intensitet IHC for p-p38 i begge 105 tilfælde af GA. væv og parrede ikke- neoplastiske gastriske væv blev udstillet i figur 6C.
invasion assay i nøgne mus
MKN-45 celler transficeret med en kodet siRNA eller p38 siRNA blev injiceret i halevenen med BALB /c nu /nu mus; IL-1β eller PBS blev også injiceret intraperitonealt fra dag af cellerne blev injiceret i 14 dage. Gruppe 1 blev injiceret med PBS og krypterede siRNA-transficerede MKN-45 celler; gruppe 2 blev injiceret med IL-1β og krypterede siRNA-transficerede MKN-45 celler; og gruppe 3 blev injiceret med p38 siRNA-transficerede MKN-45-celler og IL-1β dele på 45 dage efter injektion af cellerne, alle dyr. (6/6; 100%) i IL-1β-behandlede gruppe havde udviklet lungemetastaser (Figur 7A til D) (gruppe 2; gennemsnit af metastatiske foci i 6 af lunge sektioner var 14 pr lunge). I modsætning hertil havde færre dyr (2 /6,33.33%) i kontrolgruppen, som ikke blev injiceret med IL-1β udviklet lungemetastaser (gruppe 1; gennemsnit på 6 metastaser i 6 af lungesnit pr lunge). Henviser, kun to dyr i p38 siRNA plus IL-β-behandlede gruppe udviklede lungemetastaser og antal lungemetastaser i denne gruppe var signifikant lavere (gruppe 3, i gennemsnit 4 metastaser i 6 af lungesnit pr lunge) og betydeligt mindre end den tilsvarende gruppe behandlet med IL-1β (gruppe 2) (figur 7A til D). Figur 7 IL-1β stimulering forøger metastatiske potentiale GA-celler in vivo via en p38-afhængig mekanisme. A: Repræsentative lungemetastaser dannet i anden gruppe mus. B: Bars angivet antallet af dyr udviklede lungemetastaser. C: Repræsentative resultater af HE-farvning af lungemetastaser. D: Bars angivet middelværdien ± SD antal metastatiske foci i 6 af lungesnit /per lunge hos mus, der havde udviklet lungemetastaser. △△ P
< 0,05 over injiceret med scramble siRNA transficerede celler plus IL-1β-stimulering. E: RT-PCR-analyse af p38, MMP2, MMP9
og c-fos
mRNA-ekspression i lungemetastaserne af forskellige mus. F: IHC-analyse af p-p38, MMP2, MMP9 og c-fos protein ekspression i lungemetastaserne; IL-1β-induceret forhøjet p-p38, MMP2, MMP9 og c-fos-proteinekspression.
For yderligere at bekræfte, om p38, MMP2 og MMP9 er involveret i IL-1β-induceret lunge metastase af GA-celler, og bestemme, om denne proces er reguleret af AP-1, de mRNA ekspressionsniveauerne af p38, MMP2, MMP9
og c-fos
(en nøglekomponent i AP-1) i metastatisk lunge blev kvantificeret ved RT-PCR, og p-p38 , MMP2, MMP9 og c-fos protein ekspression i lunge sektioner blev undersøgt under anvendelse IHC. Som vist i figur 7 E og F, blev ekspressionsniveauerne af p-p38, MMP2, MMP9 og c-fos i lungevævet metastatiske foci forhøjet som reaktion på IL-1β. Aktivering af p38 og mRNA eller protein ekspressionsniveauer af p38, MMP2, MMP9 og c-fos var lavere i metastaserne dannet af celler transficeret med p38 siRNA plus IL-β-behandlede gruppe (group3) eller i kontrolgruppen (GROUP1 ) sammenlignet med metastaserne dannet ved scramble siRNA plus IL-β-behandlede gruppe (gruppe 2) (figur 7E og F). Sammen udgør in vivo-data bekræfter endvidere, at IL-1β-induceret GA celle metastase medieres af p38 signalering via AP-1 afhængig opregulering af MMP2 og MMP9.
Diskussion
En række undersøgelser har antydet, at IL- 1β er stand til at aktivere p38 og JNK [11, 12], og p38 og JNK spiller vigtige roller i kræft cellemigration og invasion [14, 23-26]. Derfor fremsatte vi den hypotese, at IL-1β kan bidrage til GA celleinvasion og metastase via aktivering af p38 og JNK pathways. For at undersøge denne mulighed vurderede vi evnen hos IL-1β at aktivere p38 og JNK, og fremme migration og invasion af GA-celler. Vores resultater viste, at IL-1β kunne aktivere både p38 og JNK, og øge GA cellemigrering og invasion, og at disse virkninger kunne inhiberes af p38 siRNA eller p38-inhibitoren SB 202190, men ikke JNK siRNA eller JNK-inhibitor SP600125. Dette er den første demonstration af, at IL-1β kan inducere GA cellemigration og invasion via aktivering af p38; imidlertid de underliggende molekylære mekanismer, hvorved IL-β-medieret p38 signalering regulerer ved gastrisk carcinogenese forbliver stort set ukendt.
En mulig mekanisme, hvorved p38 kunne øge invasion og migration af cancerceller er ved at hæve niveauerne af MMP'er [ ,,,0],27]. Det er velkendt, at sekretion af MMP'er med kapacitet til ekstracellulær matrix (ECM) nedbrydning er en funktion af metastatiske cancerceller [28]. MMP2 og MMP9 er to af de mest velkarakteriserede MMP og er tæt forbundet med cancer invasion og metastase grund af deres stærke proteolytiske aktivitet af ECM [29]. Vi rapporterer her også for første gang, at den sandsynlige molekylære mekanisme, ved hvilken IL-1β fremmer GA cellemigration og invasion kan involvere IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & MMP9-signalvejen. Vi viste, at både MMP2 og MMP9 blev opreguleret i GA-celler som respons på IL-1β stimulation; disse effekter blev hæmmet af siRNA'er mod p38, MMP2
eller MMP9
, at p38-hæmmer SB202190, og MMP2 /9-hæmmer bips. Desuden knockdown af MMP2
eller MMP9
bruge siRNA'er eller hæmning af MMP2 /9-aktivitet ved hjælp af bips, faldt betydeligt IL-1β-induceret GA celle migration og invasion. Som en serin /threoninproteinkinase, p38 kan inducere aktivering af transkriptionsfaktoren AP-1 [30]. Vi fandt endvidere, at IL-1β-induceret p38-medierede opregulering af MMP2 og MMP9 var AP-1-afhængig. IL-1β var kun i stand til at aktivere transkription af MMP9
promotorområder indeholder AP-1 steder, og disse effekter blev svækket ved p38 siRNA og p38-inhibitor SB202190. Derudover IL-1β-induceret aktivering af AP-1-afhængig transskription blev inhiberet af p38 siRNA.
Phospho-p38 (p-p38), kunne der detekteres den aktiverede form af p38 i næsten 50% af den humane GA vævsprøver testet ved IHC assay, og ekspression af p-p38 var signifikant associeret med lymfeknudemetastaser, og invasion ud serosa i patienter med GA. Endvidere ekspressionen af ​​IL-1 p positivt korreleret med ekspressionen af ​​p-p38, MMP2, MMP9 og c-fos i de kliniske GA prøver. Endvidere in vivo data fra metastase assay demonstrerede, at dannelsen af ​​lunge metastatiske foci af GA-celler, og p38 /Kreis p-p38, MMP2, MMP9 og c-fos-mRNA og proteinekspression i lungen metastatiske foci var forhøjet ved IL-1β, og reduceres ved injektion af celler transficeret med p38 siRNA. Samlet set viser disse data antyder kraftigt, at IL-1β-induceret GA cellemigration og invasion ske via aktivering af p38 signalvej, som fører til AP-1-aktivering og opregulering af MMP2 og MMP9. Derfor p38 spiller en væsentlig rolle i IL-1β-induceret metastase i GA.
JNK er en anden vigtig MAPK at være godt kendt for at spille en vigtig rolle i regulering IL-1β-signalering i flere forskellige celler [14, 31]. Men i denne undersøgelse, blev JNK fundet, at være ikke involveret i reguleringen af ​​IL-1β-induceret GA cellemigration og invasion. JNK siRNA og JNK-inhibitor ikke svække IL-1β-induceret GA cellemigration og invasion eller dæmpe aktivering af AP-1 induceret af IL-1β. Derfor IL-1β-forfremmet GA celle migration og invasion er reguleret af p38, men ikke af JNK.
Sammenfattende har vi identificeret for første gang, at IL-1β er funktionelt involveret i reguleringen af ​​metastaser i GA via aktivering af p38. Denne molekylære mekanisme involverer p38-medieret AP-1-afhængige opregulering af både MMP2 og MMP9; og denne undersøgelse tyder på, at IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Gastroparese forbundet med gastroptosis præsentere som en nedre abdominal bulking masse i et barn: en sag report
• Indflydelse af IL17A polymorfier på afvigende methylering af DAPK og CDH1 i ikke-kræft gastrisk mucosa