IL-1β-indukovanú aktiváciu p38 podporuje metastáz u adenokarcinóme žalúdka cez up-reguláciu AP-1 /c-fos, MMP2 a MMP9

IL-1β-indukovanú aktiváciu p38 podporuje metastáz u adenokarcinóme žalúdka cez up-reguláciu AP-1 /c-fos, MMP2 a MMP9
abstraktné
pozadia
Interleukín-1β (IL-1β) sa podieľa na progresie adenokarcinóme žalúdka (GA); Avšak molekulárne mechanizmy účinku IL-1 v GA je zle charakterizovaná. P38 a JNK sú hlavnými MAPK rodinní príslušníci, ktoré regulujú IL-1 signálnych dráh. Tu sme skúmali úlohu ako p38 a JNK v IL-1β-indukovanej migrácie buniek GA, invázie a metastatického potenciálu.
Metódy
účinky IL-1β-indukovanú aktiváciu p38 a JNK v bunkách GA boli stanovené za použitia in vitro Transwell migrácie a invázie testy z MKN-45 a AGS buniek alebo in vivo na tvorbu metastáz teste u nahých myší. IL-1β vyvolanej p38 signálnej dráhy sa ďalej vyznačuje tým, GA bunkách. Aktivácia IL-1β /p38 signálnej dráhy sa tiež posudzoval v ľudských primárnych GA tkanivách imunohistochemicky.
Výsledky
IL-1β-indukovanú aktiváciu p38 zvýšil migráciu GA buniek a invázie in vitro a podporoval metastatické potenciál GA bunky in vivo; Tieto účinky boli zoslabené p38 siRNA alebo SB202190 inhibítora p38. MMP2 alebo MMP9 siRNA a inhibítor MMP2 /9 BIPS tiež inhibuje IL-1β-indukovanú migráciu GA buniek a invázie in vitro. IL-1β-indukovanú aktiváciu p38 významne zvyšuje MMP2 a MMP9 mRNA a expresie proteínu a aktivitu. Luciferázové reportéri testy preukázali, že aktivátor proteín-1 (AP-1) a AP-1 väzbové miesta MMP9
promótorom (-670 /MMP9) boli aktivované IL-1β-indukovanú aktiváciu p38. Fosfo-P38 bol významne up-regulovaná v ľudských tkanivách GA (v porovnaní so zodpovedajúcimi nenádorových tkanív), a významne spojené s lymfatických uzlín, a invázie mimo serózna blany. Expresie fosfo-p38 významne koreluje s IL-1, MMP2, MMP9, a c-fos expresie v oboch ľudských GA tkanív a buniek metastáz GA v pľúcach u nahých myší. IL-1β bola tiež schopná aktivovať JNK v bunkách GA, ale aktivácia JNK nebolo spojené s migráciou GA buniek a invázie. Z tohto dôvodu, IL-1β-indukovanú migráciu a inváziu v GA bunky boli upravené p38, ale nie JNK.
Závery
IL-1β-indukovanú aktiváciu p38 a IL-1β /P38 /AP-1 ( c-fos) /MMP2 & MMP9 cesta hrajú dôležitú úlohu v metastáz v GA; táto cesta môže poskytnúť nový terapeutický cieľ pre GA.
Kľúčové
IL-1β p38 Adenokarcinóm žalúdka MMP2 a MMP9 AP-1 metastáza pozadia
čoraz viac dôkazov naznačuje, že nádory sú podporované a udržiavané pomocou zápalovými signály z nádoru mikroprostredie, a mikroprostredie nádoru zohráva dôležitú úlohu pri podpore rakoviny [1, 2]. Cytokíny, najmä cytokíny vylučované nádorovými bunkami, sú základnými zložkami mikroprostredie nádoru. Tumor nekrotizujúceho faktoru alfa (TNF-α), interleukín-1β (IL-β) a IL-6 sú veľmi dobre charakterizované cytokíny, ktoré bolo preukázané, že úzko súvisí s progresiou rakoviny. Mnoho štúdií ukázalo, že zápal indukované cytokíny, zohráva dôležitú úlohu v rozvoji rakoviny žalúdka [3]. Je dobre známe, že infekcia, najmä tých, vyvolané Helicobacter pylori,
sú schopné vyvolať žalúdočnej sliznice zápalové reakcie, čo vedie k up-reguláciu IL-1, čo môže podporovať zápal súvisiace s karcinogenéze [4]. Avšak základné molekulárne mechanizmy pre rolu IL-1 signalizácie v žalúdočnej karcinogenéze zostávajú do značnej miery neznámy, a sú v súčasnej dobe predmetom záujmu.
P38 je členom proteín kinázy aktivovanej mitogénom (MAPK) superrodiny. MAPK signálnej dráhy boli dobre preskúmané, a pozostávajú z aspoň troch superfamilies z MAPK, ktoré regulujú rôzne bunkové aktivity [5]. Je dobre známe, že p38 MAPK je schopný regulovať veľa bunkových reakcií na cytokíny a stresu, vrátane IL-1 [6]; Avšak, nedávne údaje ukázali, že p38 je tiež úzko súvisí s rozvojom rôznych typov rakoviny u ľudí, vďaka svojej schopnosti povýšiť migráciu a inváziu rakovinových buniek v odpovedi na rôzne podnety, vrátane zápalových faktorov [6]. Navyše, p38 sa tiež podieľa na regulácii bunkovej diferenciácie a apoptózy. Štyri izoformy p38 boli doteraz identifikované: p38-a, p38, p38-beta-y, a P38-delta [7]. Hoci aminokyselinové sekvencie týchto p38 MAPK sú väčšinou rovnaké, expresné vzor každej izoformy sa líšia v [8]. P38-α je hlavným p38 MAPK a vyjadruje sa ubikvitnou, P38-β je exprimovaný predovšetkým v mozgu, zatiaľ čo p38γ je hojne exprimovaný v kostrovom svalstve [9] a P38-ó je exprimovaný hlavne v žliaz s vnútornou sekréciou [10]. Mnohé štúdie tiež preukázali, že p38 sa zúčastňuje IL-1 signálnych kaskád v súbore typov buniek, a to najmä v myšiach embryonálnych fibroblastov (MEF), bunky a makrofágy bunky [11, 12]; Avšak, veľmi málo je známe o funkcii IL-1β-aktivovanej p38 u karcinómu žalúdka.
C-Jun N-terminálnej kinázy (JNK) je ďalší člen rodiny MAPK, ktorá je tiež dobre známe, že hrajú dôležitú úlohu v regulácii IL-1β signálne dráhy [13]. Okrem účasti v regulácii zápalové signálne dráhy, JNK plní niekoľko ďalších dôležitých bunkových funkcií, vrátane regulácie bunkového rastu, diferenciácie, prežitie a apoptózy. Navyše nedávne štúdie ukazujú, že JNK je často nadmerne exprimovaný v rôznych tkanivách s rakovinou, a up-regulácia JNK môžu byť úzko spojené s rakovinou inváziu [14]; však, či JNK sa podieľa na regulácii IL-1β vyvolané žalúdočné migráciu a inváziu rakovinových buniek je stále do značnej miery neznáma
adenokarcinóme žalúdka (GA) je najčastejšou neoplastickým nádor žalúdka .; Preto sme sa zamerali na GA v tejto štúdii. Tu sme skúmali aktiváciu p38 a JNK v odpovedi na IL-1, a ich účinok na IL-1β-indukovanú metastatické potenciál GA buniek in vitro alebo in vivo.
Navyše expresie fosfo-p38 (p P38) v GA, jeho vzťah k patologickým rysy GA, a korelácia medzi expresiou IL-1 a p-P38 boli skúmané v ľudských parafínových GA tkanív pomocou imunohistochémia. Nakoniec sme tiež charakterizovaný molekulárne mechanizmy, ktoré regulujú IL-1β-indukovanej p38 sprostredkovanej metastatické potenciál GA buniek. Výsledky
IL-1β-indukovanú aktiváciu p38 podporuje migráciu buniek GA a invázie in vitro
Najprv sme skúmali, či IL-1β bol schopný aktivovať p38 signalizáciu v bunkách GA. Ako je znázornené na obrázku 1, aktivácia p38 (p-P38) bola zistená u oboch bunkových línií GA (AGS a MKN-45 bunky) po liečbe s IL-1 po dobu 30 minút; IL-1β-indukovanú aktiváciu p38 bol inhibovaný SB202190 inhibítora p38 (Obrázok 1A). Obrázok 1 IL-1β podporuje migráciu buniek a inváziu GA aktiváciou p38. A: Western blot potvrdzuje, že p-P38 by mohla byť indukovaná 30 minútach stimulácie IL-1 v AGS a MKN-45 bunkových línií; aktivácia p38 pomocou IL-1 bola inhibovaná inhibítora p38 SB202190. B: transfekcia p38 siRNA zrazený p38 expresiu v oboch dvoch bunkových línií GA. C-F: Liečba GA buniek IL-1 zvýšila migráciu a inváziu buniek in vitro; Tieto účinky boli inhibované p38 siRNA alebo inhibítora p38 dráhy SB202190. ** P Hotel < 0,05 vs. ťahanice siRNA (siRNA Control) -transfected bunky stimulovanej IL-1; △△ P Hotel < 0,05 verzus netransfekované bunky (typ buniek prirodzeného) stimulovanej IL-1. Stĺpce indikujú priemer ± SD počet buniek v jednom zornom poli (× 400 zväčšenie) v testoch migrácie a invázie. G :. Reprezentatívny svetelným mikroskopom obrazy AGS a MKN-45 migrácie buniek a inváziu v testoch Transwell
P38 môže podporovať migráciu a inváziu rôznych nádorových buniek [15]. Pre zistenie, či sa IL-1β môže podporovať migráciu a inváziu GA buniek prostredníctvom aktivácie p38 signalizáciu, GA bunky transfekované s kódovaným siRNA (kontrolná siRNA) alebo p38 siRNA alebo GA bunky vopred ošetrené s alebo bez SB202190 inhibítora p38 dráhy boli stimulované IL-1. Transwell migrácie a invázie testy preukázali, že IL-1β stimulácia zvýšila migráciu a inváziu ako AGS a MKN-45 bunkách; Avšak, IL-1β-indukovanú migráciu GA buniek a invázie boli významne zoslabený Knockdown p38 pomocou siRNA (obrázok 1B až G), alebo predliečenie SB202190 (Obrázok 1C až G). Dohromady tieto údaje silne naznačujú, že IL-1β podporovaná migrácia a invázia buniek GA sú sprostredkované p38.
IL-1β-indukovanú aktiváciu p38 zvyšuje aktiváciu MMP2 a MMP9 expresiu a aktivitu v bunkách GA
MMP2 a MMP9 mať bolo preukázané, že hrajú dôležitú úlohu v nádorových buniek invázie a metastáz [16]. Preskúmať, či MMP2 a MMP9 tiež podieľať sa na IL-1β vyvolanej p38-regulované metastatického potenciálu GA buniek, RT-PCR, imunocytochémia a konfokálna mikroskopia, a test zymografie boli vykonané na stanovenie MMP2 a MMP9 expresiu a aktivitu v GA bunkové línie transfekované s kontrolným siRNA alebo siRNA p38, alebo vopred ošetrené s alebo bez SB202190 inhibítora p38, a potom sa spracuje s alebo bez IL-1. Ako sa dalo očakávať, MMP2 a MMP9 expresie a aktivita bola zvýšená v odpovedi na IL-1 ošetrenie (obrázok 2A až C). Vyradenie p38 pomocou siRNA, alebo predbežné spracovanie sa SB202190 inhibítorom p38 významne znížil Il-1β-indukovanú expresiu MMP2 a MMP9 mRNA a aktivitu v oboch bunkových líniách GA (Obrázok 2a až c). Obrázok 2 IL-1β upregulates MMP2 a MMP9 expresiu a aktivitu aktiváciou p38. A: RT-PCR analýza ukázala, že MMP2 stroje a MMP9
mRNA bola up-regulovaná v oboch AGS a MKN-45 bunkami v odpovedi na liečbu s IL-1; tento účinok bol blokovaný p38 siRNA alebo SB202190 inhibítora p38. B: Kvantifikácia expresie MMP2 stroje a MMP9
mRNA normalizované na GAPDH mRNA
. ** P Hotel < 0,05 vs. Scramble bunky transfekované siRNA-stimulovaných IL-1. △△ P Hotel < 0,05 vs. netransfekované bunky stimulovanej IL-1. C: Gél zymografie ukázalo, že MMP2 a MMP9 aktivita bola up-regulovaná v oboch AGS a MKN-45 bunkami v odpovedi na liečbu s IL-1; tento účinok bol blokovaný p38 siRNA alebo SB202190 inhibítora p38. D: Imunocytochemické farbenie a konfokálna mikroskopia potvrdila, že IL-1β zvýšená aktivácia p38 (červená), a MMP2 a MMP9 (zelená) expresie v MKN-45 bunkách GA; Tieto účinky boli blokované p38 siRNA alebo SB202190 inhibítora p38.
Imunocytochémia a konfokálna mikroskopia ukázala, že p-P38 bol slabo exprimovaný v neošetrených MKN-45 bunkách, ktoré takisto vyjadrenej veľmi nízkej hladiny MMP2 a MMP9. Po stimulácii IL-1, významne zvýšené hladiny p-P38, MMP2 a MMP9 boli zistené v bunkách MKN-45; Tieto IL-1β-indukovanej účinky boli inhibované p38 siRNA a SB202190 (obrázok 2D). Dohromady tieto výsledky silne
naznačujú, že IL-1β cez inváziu a migráciu buniek GA p38 vyvolaného je sprostredkovaná prostredníctvom schopnosti p-P38 upregulovat MMP2 a MMP9 expresiu a aktivitu. IL-1β-indukovanú aktiváciu p38 zvyšuje aktiváciu MMP2 a MMP9 aktiváciou AP-1-závislú transkripciu v bunkách GA
je dobre zdokumentované, že transkripčný faktor aktivátor proteín-1 (AP-1), môže regulovať expresiu MMP2 a MMP9 [17], a aktivácia p38 je schopný regulovať AP-1 aktiváciu [18]. Aby bolo možné zistiť, či IL-1β vyvolanej p38 sprostredkovanej zvýšenej MMP2 a MMP9 expresie a aktivita závisí na AP-1, aktivácia AP-1-závislé transkripcie bola skúmaná v GA buniek ošetrených s alebo bez IL-1, v prítomnosť alebo neprítomnosť inhibícia p38, s použitím luciferázového reporterového testu AP-1. IL-1β zvýšil aktivitu AP-1 v oboch bunkových líniách GA (obrázok 3A); Avšak, inhibícia p38 za použitia p38 alebo siRNA vopred ošetrených buniek s SB202129 inhibítora p38 znižuje IL-1β-indukovanú AP-1 aktivitu v oboch bunkových líniách GA (obrázok 3A). Tieto výsledky ukazujú, že IL-1β indukovanej p38 sprostredkovanej expresie MMP2 a MMP9 sú závislé na AP-1. Obrázok 3 IL-1β aktivuje AP-1 aktivity prostredníctvom p38 dráhy. A: Oba GA bunky boli transfekovány AP-1 reportérovým plazmidom alebo AP-1 reportérovým plazmidom, spolu s šifrovacím siRNA alebo siRNA p38. AP-1 génu aktivita luciferázového reportérového bola významne zvýšená o IL-1 stimulácia v oboch AGS a MKN-45 bunkách; Tieto účinky boli významne inhibovaná p38 siRNA v spôsobom závislým od dávky, a tiež inhibovaná SB202190 inhibítora p38. ** P Hotel < 0,05 vs. kontrolné siRNA (zhon siRNA) + AP 1-bunky prenesené Luc-stimulovaných IL-1; ΔΔP Hotel < 0,05 versus AP 1-luc buniek transfekciou stimulovaných IL-1; Relatívna aktivita Luciferase sa normalizuje na B-gal. B: IL-1β vyvolanej p38 sprostredkovanej aktivácie MMP9
promotorov je závislá na AP-1-väzobných miest. ** P Hotel < 0,05 versus transfekované -670 /+ MMP9 kontrolné siRNA bunky stimulované IL-1; ΔΔP Hotel < 0,05 versus transfekované -670 /MMP9 bunky stimulované IL-1; ▼▼ P Hotel < 0,05 versus transfekované -570 /MMP9 bunky stimulované IL-1; Relatívna aktivita Luciferase sa normalizuje na B-gal.
Za účelom ďalšieho potvrdenia role AP-1 na IL-1β indukovanej p38 dráhy, luciferázové reportér génu vektorov obsahujúcich miesta AP-1 zo MMP9
promótorom regióny boli transfekovány do buniek GA. V súlade s testami reportérového génu v AP-1, Luciferase činnosti -670 /MMP9
promotorové oblasti (obsahujúci dve väzbové miesta AP-1 [-533 a -79] a jedno väzobné miesto NF-КB [-600 ] [19-21]) významne IL-1β-stimulovaných bunkách (Obrázok 3B) zvýšil. Prenos buniek s p38 alebo siRNA vopred ošetrených buniek s SB202129 inhibítora p38 znižuje IL-1 indukovanú aktivitu luciferázy u -670 /MMP9
promótor referenčného génu (obrázok 3B). Aktivita luciferázy zo MMP9
promótor (-571 /MMP9
) nebola ovplyvnená delécií miesta NFkB viažuci (-600). Okrem toho, keď sú miesta AP-1 (-79 a -533) z MMP9
promótor boli odstránené (-73 /MMP9
mutantov), ​​aktivita luciferázy reporterového génu výrazne znížila, v porovnaní s príslušnou voľnej prírody -type reportéri gény riadiace (Obrázok 3b). Súhrnne tieto dáta jasne ukazujú, že IL-1β indukuje aktiváciu p38 signálnej dráhy, ktorá podporuje inváziu a migráciu buniek GA pomocou AP-1-up-reguláciu v závislosti MMP2 a MMP9 expresiu a aktivitu.
Vyradenie MMP2 alebo MMP9 znižuje migráciu a inváziu IL-1 indukovanej GA bunkách
aby sa ďalej potvrdilo, že IL-1 indukovanej GA migráciu a inváziu buniek sú spojené s up-reguláciu MMP2 a MMP9, AGS a MKN-45 bunky boli transfekovány siRNA proti MMP2
alebo MMP9
, alebo vopred s alebo bez inhibítora MMP2 /MMP9 hraničné kontroly, a potom stimulované IL-1. Migračné a invázie testy Transwell preukázali, že migrácia IL-1β indukovanej a invázie buniek GA významne zoslabený Vyradenie MMP2
alebo MMP9,
alebo predbežného spracovania s hraničnej kontroly, v porovnaní s kontrolnými bunkami (obrázok 4A až C). Z tohto dôvodu, upregulace MMP2 a MMP9 sú kľúčové pre IL-1β-indukovanej migrácie buniek GA a invázie. Obrázok 4 Vyradenie MMP2 alebo MMP9, alebo predbežné spracovanie s MMP2 /9 inhibítora BIPS inhibuje IL-1β-indukovanú migráciu GA buniek a invázie in vitro. A: RT-PCR potvrdila účinnosť MMP2 alebo MMP9 siRNA, čo výrazne zníženú MMP2
alebo MMP9
expresie, v uvedenom poradí, až na viac ako 75%. B: IL-1β zvýšenej migrácii GA buniek a inváziu in vitro; Tieto účinky boli inhibované MMP2 alebo MMP9 siRNA alebo inhibítora MMP2 /9 hraničné kontroly. ** P Hotel < 0,05 vs. ťahanice siRNA (kontrolné siRNA) -transfected bunky stimulovanej IL-1. Tyče sú priemer ± SD krát zmení normalizované na kontrolnou skupinou v testoch migrácie a invázie. C: Reprezentatívny Svetelná mikroskopia obrazy migráciu buniek AGS a MKN-45 a inváziu v migrácie a invázie testoch Transwell
IL-1β-indukovanú aktiváciu JNK sa nezúčastňuje na reguláciu migrácie a invázie buniek GA
. je dobre známe, že členovia MAPK zohrávajú dôležitú úlohu v regulácii bunkovej reakcie na cytokíny a stres a P38 a JNK sú hlavné MAPK členovia rodiny, ktoré regulujú IL-1 signalizačné dráhy. Pochopiť, či JNK je tiež spojená s IL-1β-indukovanej migrácie buniek GA a invázie, Western blot analýza bola vykonaná pre detekciu aktivácie JNK v odpovedi na IL-1. Ako vystavoval na obrázku 5A, p-JNK bola zistená ako v AGS a MNK-45 bunkových línií po stimulácii IL-1 po dobu 30 minút. Avšak, výsledky oboch migrácie a invázie testoch Transwell ukázalo, že zvýšená migrácia a invázia oboch AGS a MKN 45 buniek indukovanú IL-1 stimulácia nebola zoslabená smiešne nízke JNK s siRNA, ani zmiernený inhibíciou JNK s SP600125 inhibítora JNK ani (obrázok 5B až D); Počet migrovali a invazívnych buniek málom ani ukázal zmenu pred alebo po transfekciu s siRNA proti JNK (P 0,05), alebo s alebo bez pre-liečení inhibítorom JNK SP600125 (P 0,05). JNK nebolo spojené s IL-1β, podporovaná migrácia GA buniek a invázie ktorá bola ďalej overená AP-1 luciferázového reporterového testu. Vzhľadom k tomu, upstream kinázy c-Jun (ďalšie dôležité zložky AP-1), JNK je schopná aktivovať AP-1 a aktiváciu AP-1 od JNK je úzko spätý s funkciou JNK o regulácii rôznych bunkových reakcií, vrátane rakoviny migráciu buniek a inváziu [22]; Avšak, IL-1β-indukovanú AP-1 aktiváciu ako AGS a MKN-45 bunkách nebola inhibovaná JNK siRNA, ani SP600125 inhibítora JNK ani (Obrázok 5E). Dohromady tieto dáta jasne ukazujú, že zvýšená migrácia a invázia GA podporovaný IL-1 nie sú upravené JNK. Obrázok 5 Aktivácia JNK nie je spojené s IL-1β-indukovanej migrácie buniek GA a invázie. A: p-JNK bola zistená 30 min stimuláciou s IL-1 v AGS a MKN-45 bunkových línií. B: transfekcia JNK siRNA zrazený JNK expresiu v oboch dvoch bunkových línií GA. C-D: Liečba GA buniek IL-1β zvýšenou migráciou buniek a invázie in vitro; Tieto účinky neboli inhibované JNK siRNA ani SP600125 inhibítora JNK. ** P Hotel < 0,05 vs. Scramble bunky transfekované siRNA-stimulovaných IL-1; △△ P Hotel < 0,05 verzus netransfekované bunky (divokého typu buniek) stimulovaných IL-1; ## Alebo ●● sa zistil významný rozdiel medzi týmito dvoma skupinami (P Hotel &0,05). Čiarok stredná hodnota ± SD počet buniek na zorné pole v testoch migrácie a invázie. D: Reprezentatívny svetelným mikroskopom obrazy AGS a MKN-45 migráciu a inváziu buniek v testoch transjamkových. E: Oba GA bunky boli transfekovány AP-1 reportérovým plazmidom alebo AP-1 reportérovým plazmidom, spolu s šifrovacím siRNA alebo siRNA JNK. AP-1 génu aktivita luciferázového reportérového bola významne zvýšená o IL-1 stimulácia v oboch AGS a MKN-45 bunkách; Tieto účinky neboli inhibované JNK siRNA, ani inhibovaná inhibítory JNK SP600125 ani. ** P Hotel < 0,05 vs. kontrolné siRNA (zhon siRNA) + AP 1-bunky prenesené Luc-stimulovaných IL-1; ΔΔP Hotel < 0,05 versus AP 1-luc buniek transfekciou stimulovaných IL-1; ## Alebo ●● sa zistil významný rozdiel medzi týmito dvoma skupinami (P Hotel &0,05). Relatívna aktivita Luciferase sa normalizuje na B-gal.
Fosfo-P38 je up-regulovaná a koreluje s expresiou IL-1, MMP2, MMP9 a c-fos v ľudských tkanivách GA
expresiu p-P38 v séria 105 GA tkanív a spárovaných nenádorových žalúdočné tkaniva bola skúmaná pomocou imunohistochémia (IHC). Vzoriek 105 s rakovinou, 53 prípadov GA tkanív (50,48%), vystavených nadmernej expresie p-P38 v porovnaní s non-neoplastických párových žalúdočné tkanive (P Hotel &0,05; Obrázok 6A). Pozitívne p-P38 expresie bola často pozorovaná ako v bunkovej cytoplazme a jadru GA. Obrázok 6 fosforylovaný p38 je nadmerne exprimovaný v ľudskej GA, a expresie p-P38 pozitívne koreluje s IL-1, MMP2, MMP9 a c-fos expresie v GA tkanivách. A: Zvýšená expresia p-P38 bol často pozorovaný u GA tkanivách, v porovnaní s non-neoplastických párových žalúdočné tkaniva. a, P-P38 nebol detekovaný, alebo len slabo exprimovaný v non-neoplastických žalúdočné tkaniva. b e: rôzne intenzity pozitívny p-P38 expresie v GA tkanivách. B: Expresia p-P38 v pozitívnej korelácii s IL-1, MMP2, MMP9, a c-fos expresie v ľudských tkanivách GA. GA vzorka tkaniva vykazuje silnejšie IL-1β výraz a silnejší p-P38 MMP2, MMP9 a C-fos výraz; a slabšie expresie IL-1β a slabý p-P38, MMP2, MMP9 a c-fos expresie. C: súčet skóre pozitívny intenzity farbenia IHC pre p-P38. ** P Hotel < . 0,05 verzus párované iné ako nádorového tkaniva žalúdočné
Nebola zistená žiadna podstatná združenia boli pozorované medzi nadmernou expresiou p-P38 vo veku pacienta (< 50 alebo ≥ 50 rokov), pohlavie, veľkosť nádoru (< 3 cm alebo ≥ 3 cm), histologický typ, alebo stupeň diferenciácie. Avšak, zvýšená expresia p-P38 zobrazené významne súvisí s lymfatických uzlín (P
menšie ako 0,05), a invázie mimo serózna blany (P
menšie ako 0,05). Tieto údaje naznačujú, že zvýšená expresia p-P38 je spojená s metastázami v ľudskom GA.
Ako vystavoval na obrázku 6B, expresiu p-P38 vykazovali dobrú correlativity s úrovňou IL-1, MMP2, MMP9 a AP-1 (c-fos) v GA tkanive, a významná korelácia medzi zvýšenej p-P38 expresie a up-reguláciu IL-1, MMP2, MMP9 a c-fos v GA tkaniva (r = 0,72, p 0,01; r = 0,63, bola zistená 0,01) pri analýze metódou Spearman
súčet skóre pozitívne intenzity farbenia IHC pre p-P38 v oboch 105 prípadov GA; p &0,01; r = 0,58, p menšie ako 0,05 a r = 0,69, p <. tkaniva a párové neinvazívnej neoplastických žalúdočné tkaniva boli vystavené na obrázku 6C.
invázie testu u nahých myší
MKN-45 bunkách transfekciou miešaná siRNA alebo siRNA p38 podali do chvostovej žily myší Balb /c nu /nu myši; IL-1β alebo PBS boli intraperitoneálne injekciou od dňa boli bunky injekčne po dobu 14 dní. Skupina 1 boli injikované roztokom PBS a miešaná siRNA transfekciou MKN-45 bunky; Skupina 2 bola podaná injekcia IL-1 a miešaná siRNA transfekciou MKN-45 bunky; a skupina 3 boli injekčne podané s p38 siRNA transfekciou MKN-45 buniek a IL-1
Po 45 dní po injekcii buniek, všetky zvieratá. (6/6; 100%) vo IL-1β skupine liečenej sa vyvinula pľúcnych metastáz (obr 7A až d) (skupina 2; priemer metastatické ohnísk v 6 pľúcnych úsekov bolo 14 per pľúc). Na rozdiel od menej zvierat (2 /6,33.33%) v kontrolnej skupine, ktoré neboli s injekciou IL-1 sa vyvinula pľúcnych metastáz (skupina 1; priemer 6 metastáz v 6 pľúcnych úsekov na pľúc). Vzhľadom k tomu, len dve zvieratá v p38 siRNA a IL-β-liečenej skupiny vyvinul pľúcnych metastáz a počet pľúcnych metastáz v tejto skupine bola významne nižšia (skupina 3, priemerne 4 metastáz v 6 pľúcnych úsekov na pľúc) a významne menšie než zodpovedajúce skupine liečenej IL-1 (skupina 2) (obrázok 7A až D). Obrázok 7 IL-1β stimulácia zvyšuje metastatické potenciál GA buniek in vivo pomocou mechanizmu p38-závislé. A: Reprezentatívny pľúcnej metastázy vznikla v inej skupine myší. B: Bary uvedený počet zvierat vyvinula pľúcnych metastáz. C: Reprezentatívne výsledky HE farbenie pľúcnych metastáz. D: Bary uvedená stredná hodnota ± SD počet metastatického ohnísk v 6 pľúcnych sekcií /na pľúcach u myší, ktoré sa vyvíjal pľúcnych metastáz. △△ P Hotel < 0,05 vs. injekciu ťahanice siRNA transfekciou buniek plus stimulácii IL-1. E: RT-PCR analýza p38, MMP2, MMP9 stroje a c-fos mRNA expresie
v pľúcnych metastáz rôznych myší. F: IHC analýza p-P38, MMP2, MMP9 a proteínové expresie c-fos v pľúcnych metastáz; IL-1β vyvolané zvýšenou p-P38, MMP2, MMP9 a expresie proteínu c-fos.
Pre ďalšie potvrdenie, či P38, MMP2 a MMP9 sa zúčastňuje IL-1 indukovanej pľúcnej metastázy GA buniek, a zistiť, či tento proces je regulovaná AP-1, hladiny expresie mRNA p38, MMP2, MMP9 stroje a c-fos
(jeden z hlavných prvkov AP-1) v metastatickým pľúc boli kvantifikované pomocou RT-PCR, a p-P38 , MMP2, MMP9 a expresie proteínu c-fos v pľúcnych sekcií boli skúmané pomocou IHC. Ako je znázornené na obrázku 7, E a F, hladiny expresie p-P38, MMP2, MMP9 a c-fos v metastatických ložísk pľúc boli zvýšené v odpovedi na IL-1. Aktivácia p38 a mRNA alebo expresiu proteínu hladiny p38, MMP2, MMP9 a c-fos boli nižšie u metastáz tvorených buniek transfekciou p38 siRNA navyše IL-p-ošetrené skupine (Group3), alebo v kontrolnej skupine (group1 ) v porovnaní s metastáz vytvorených šifrovacím siRNA navyše IL-β-liečenej skupiny (skupina 2) (obrázok 7E a F). Dohromady dáta in vivo ďalej potvrdzuje, že IL-1β indukovanej bunky metastázy GA je sprostredkovaná p38 signalizáciou pomocou AP-1 v závislosti up-reguláciu MMP2 a MMP9.
Diskusia
Početné štúdie naznačujú, že IL 1β je schopný aktivovať p38 a JNK [11, 12], a p38 a JNK hrajú dôležité úlohy v migrácii a invázii [14, 23-26] nádorových buniek. Preto sme hypotézu, že IL-1β môže prispieť k GA invázie buniek a metastáz pomocou aktivácie p38 a JNK cesty. Vyšetrovať túto možnosť sme hodnotili schopnosť IL-1 pre aktiváciu p38 a JNK, a podporovať migráciu a inváziu GA buniek. Naše výsledky ukazujú, že IL-1β mohol aktivovať ako p38 a JNK, a zvýšiť Ga migráciu a inváziu buniek, a že tieto účinky môžu byť inhibovaný p38 siRNA alebo inhibítora p38 SB 202190, ale nie JNK siRNA alebo SP600125 inhibítora JNK. Jedná sa o prvý demonštrácii, že IL-1β môže indukovať migráciu GA buniek a invázie cez aktiváciu p38; Avšak základné molekulárne mechanizmy, ktorými je IL-β-sprostredkovaná p38 signalizácia regulované počas žalúdočnej karcinogenézy zostávajú do značnej miery neznámy.
Jedna potenciálny mechanizmus, ktorý by mohol zvýšiť p38 inváziu a migráciu nádorových buniek sa zvýšením hladiny MMP [ ,,,0],27]. Je dobre známe, že sekrécia MMP s kapacitou pre extracelulárnej matrix (ECM) degradácia je funkcia metastatických nádorových buniek [28]. MMP2 a MMP9 sú dva z najlepšie charakterizovaných MMP a sú úzko spojené s rakovinou inváziu a metastázy vzhľadom na ich silné proteolytické aktivity ECM [29]. Popisujeme tu tiež prvýkrát, že pravdepodobne molekulárnej mechanizmus, ktorým IL-1β podporuje migráciu a inváziu buniek GA môžu zahŕňať IL-1β /P38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & MMP9 signálne dráhy. Preukázali sme, že obe MMP2 a MMP9 bola up-regulovaná v GA bunky v reakcii na stimuláciu IL-1; Tieto účinky boli inhibované siRNA proti p38, MMP2
alebo MMP9
na SB202190 inhibítora p38 a inhibítor MMP2 /9 hraničné kontroly. Okrem toho, Vyradenie MMP2
alebo MMP9 for S siRNA alebo inhibíciu MMP2 /9 aktivity za použitia hraničné kontroly, významne znížil IL-1β-indukovanú migráciu GA buniek a inváziu. Ako proteínové kinázy serín /treonín, p38 je schopný indukovať aktiváciu transkripčného faktora AP-1 [30]. Ďalej sme zistili, že IL-1β vyvolanej p38 sprostredkovanej upregulace MMP2 a MMP9 boli AP-1 v závislosti na. IL-1β len schopný aktivovať transkripciu MMP9
promotorových oblastí obsahujúcich AP-1 stránok, a tieto účinky boli zoslabené p38 siRNA a SB202190 inhibítora p38. Navyše IL-1β-indukovanú aktiváciu AP-1-závislé transkripcie bola inhibovaná p38 siRNA.
Fosfo-P38 (p-P38), aktivovaná forma p38, by mohli byť detekované v takmer 50% ľudského GA tkanivové vzorky testované IHC stanovenie a expresie p-P38 bol významne spojený s lymfatických uzlín, a invázie mimo serózna blany u pacientov s GA. Okrem toho, expresia IL-1 v pozitívnej korelácii s expresiou p-P38, MMP2, MMP9 a c-fos vo vzorkách klinických GA. Okrem toho údaje in vivo z testu metastáz preukázali, že tvorba pľúc metastatického ložísk GA bunkami, a P38 /
p-P38, MMP2, MMP9 a mRNA a expresie proteínu c-fos v metastatických ložísk pľúc boli zvýšené o IL-1β, a znižuje injekcií buniek transfekciou siRNA p38. Dohromady tieto údaje silne naznačujú, že IL-1β-indukovanú migráciu GA buniek a inváziu dochádza cez aktiváciu p38 signálnej dráhy, ktorá vedie k AP-1 aktiváciu a up-reguláciu MMP2 a MMP9. Z tohto dôvodu, p38 hrá zásadnú úlohu v IL-1β vyvolanej metastázami v GA.
JNK je ďalším dôležitým MAPK byť dobre známe, že hrajú dôležitú úlohu v regulácii IL-1 signalizácie v niekoľkých rôznych bunkách [14, 31]. Avšak, v tejto štúdii, JNK bolo zistené, že nie je zapojený do regulácie IL-1β-indukovanej migrácie buniek GA a invázie. JNK siRNA a inhibítor JNK sa neobmedzujú IL-1β indukovanú migráciu GA buniek a inváziu, ani tlmiť aktiváciu AP-1 indukovanej IL-1. Z tohto dôvodu, IL-1β-podporovať migráciu GA buniek a invázie sú regulované p38, ale nie JNK.
V súhrne sme identifikovali prvýkrát, že IL-1β je funkčne zapojený do regulácie metastáz v GA cez aktivácia p38. Tento molekulárnej mechanizmus zahŕňa p38 sprostredkovanej AP-1-dependentný upregulaci ako MMP2 a MMP9; Táto štúdia naznačuje, že IL-1β /P38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Gastroparézy spojená s gastroptosis prejavujúce sa ako spodnej časti brucha zmesový hmoty u dieťaťa: prípad report
• Vplyv IL17A polymorfizmov na aberantne metylácie DAPK a CDH1 v non-rakovinové žalúdočné mucosa