IL-1β inducirana aktivacija p38 spodbuja metastaz v želodčni adenokarcinom z uravnavanjem AP-1 /C-fos, MMP2 in MMP9

IL--1β povzroča aktivacija p38 spodbuja metastaz v želodčni adenokarcinom z uravnavanjem AP-1 /c-fos , MMP2 in MMP9
abstraktnih
Ozadje
interlevkin-1β (IL-1β), je bila vpletena v napredovanje adenokarcinomom želodca (GA); Vendar pa so molekularni mehanizmi delovanja IL-1β v GA slabo označena. P38 in JNK so glavni MAPK družinske člane, ki urejajo IL-1β poti signalizacije. Tukaj smo raziskovali vlogo tako p38 in JNK v IL-1β inducirane GA celične migracije, invazije in metastatskega potenciala.
Metode
učinke IL-1β inducirane p38 in aktivacijo JNK v GA celice so bile določene uporabi in vitro Transwell migracije in invasion teste podjetja MKN-45 in AGS celice ali in vivo metastaziranje preizkusu pri golih miših. IL-1β inducirane p38 signalizacijo pot je nadalje označen s tem, GA celicah. Aktivacija signalne poti za IL-1β /p38 je bila ovrednotena tudi v človeških primarnih GA tkiva z imunohistokemijo.
Rezultati
IL-1β inducirane aktivacijo p38 povečala migracija celic GA in invazijo in vitro in promoviral metastatskega potenciala GA celice in vivo; Ti učinki so bili zmanjšati z p38 siRNA ali SB202190 zaviralcev p38. MMP2 ali MMP9 siRNAs in zaviralec MMP2 /9 mejnih prehodov zaviral tudi IL-1β-inducirano migracijo GA celic in invazijo in vitro. IL-1β, povzroča aktivacijo p38 znatno povečal MMP2 in MMP9 mRNA in izražanje proteinov in aktivnosti. Luciferazne reporter testi so pokazali, da aktivator protein-1 (AP-1) in AP-1 vezavna mesta v področij MMP9
promotorja (-670 /MMP9) smo aktivirali z IL-1β inducirane aktivacijo p38. Fosfo-p38 je bistveno povečana pri človeških GA tkivih (v primerjavi z ujemanjem ne-neoplastične tkiva), in močno povezana z bezgavkah metastaz in invazije izven korena. Izražanje fosfo-p38 močno povezana z IL-1β, MMP2, MMP9, in c-fos izražanja v človeških GA tkiv in GA celic metastaz v pljučih golih miših. IL-1β je bil tudi sposoben aktivirati JNK v GA celicah, vendar aktivacijo JNK ni bila povezana z migracijo celic GA in invazijo. Zato, IL-1β inducirane migracije in invazijo v GA celicah so urejena s p38, ne pa JNK.
Sklepi
IL-1β inducirane aktiviranje p38 in IL-1β /p38 /AP-1 ( c-fos) /MMP2 & MMP9 pot igrajo pomembno vlogo pri metastaz v GA; To pot lahko zagotovi nov terapevtski cilj za GA.
Ključne besede
IL-1β p38 Adenokarcinom želodca MMP2 in MMP9 AP-1 Metastasis Ozadje
Povečanje dokazi kažejo, da so tumorji spodbuditi in podpreti s vnetnih signalov iz tumorja mikrookolje in tumor mikrookolje igra pomembno vlogo pri spodbujanju raka [1, 2]. Citokini, predvsem so citokini, ki jih tumorske celice izločajo, so bistveni sestavni deli mikrookolje tumorja. Dejavnik tumorske nekroze alfa (TNF-α), interlevkin-1β (IL-β) in IL-6 so najbolj značilne, citokini, ki so dokazali, da se tesno povezana z napredovanje raka. Veliko raziskav je pokazalo, da ima vnetje s citokini inducirane pomembno vlogo pri razvoju raka želodca [3]. Znano je, da
so infekcije, še posebej tiste, ki jih povzroča Helicobacter pylori sposoben induciranja želodčne sluznice vnetne odzive, ki izhajajo iz uravnavanjem IL-1β, kar lahko spodbudi vnetjem povezano karcinogenezo [4]. Vendar pa so osnovni molekularni mehanizmi za vloge IL-1β signalizacijo v želodcu rakotvornost še vedno v veliki meri neznan, in so trenutno v interesu.
P38 je član proteinske kinaze z mitogeni aktivira (MAPK) naddružine. Poti MAPK signalnih so dobro raziskana in so sestavljeni iz najmanj treh superfamilies iz MAPKs, ki regulirajo različne celične aktivnosti [5]. Znano je, da je p38 MAPK sposobna regulirati veliko celičnih odzivov na citokinov in stres, vključno z IL-1β [6]; Vendar pa zadnji podatki pokazali, da je p38 tesno povezana z razvojem različnih vrst raka človeškega pomočjo njegove sposobnosti, da povzdignil migracije rakavih celic in vdor v odgovor na različne dražljaje, vključno vnetnih dejavnikov [6]. Poleg tega je p38 sodeluje tudi pri regulaciji celične diferenciacije in apoptoze. Štiri izooblike iz p38 so bile doslej ugotovljene: p38-a, p38-P, p38-y, in p38-Í [7]. Čeprav so aminokislinske sekvence teh p38 MAPKs predvsem identična izraz vzorec vsake izooblike razlikuje [8]. P38-α je glavni p38 MAPK in se izraža povsod, ki je p38-β izraža predvsem v možganih, medtem ko p38γ izobilju izražena v skeletnih mišicah [9] in p38-Í večinoma izražena v endokrinih žlez [10]. Številne študije so pokazale, da je p38 sodeluje pri IL-1β signalnih kaskad v nizu tipov celic, zlasti miške embrionalnih fibroblastov (MEF) celic in makrofagov celic [11, 12]; Vendar pa je zelo malo znanega o funkciji IL-1β-aktiviranim p38 raka želodca.
c-Jun N-terminalne kinaze (JNK) je druga MAPK član družine, ki je tudi dobro znano, da igrajo pomembno vlogo pri urejanju IL-1β signalizacijo pot [13]. Poleg sodelovanja v ureditev vnetne signala poti, JNK opravlja številne druge pomembne celične funkcije, vključno z regulacijo celične rasti, diferenciacije, preživetja in apoptoze. Poleg tega so nedavne raziskave kažejo, da je JNK pogosto pretirano izražena v različnih tkivih raka in regulacijo navzgor JNK lahko tesno povezana z rakom invazijo [14]; Vendar, ali je JNK sodeluje pri regulaciji IL-1β inducirane migracije želodčni rak celic in invaziji še vedno v veliki meri neznan
adenokarcinomom želodca (GA) je najpogostejši neoplastični tumor želodca.; Zato smo se osredotočili na GA v tej študiji. Tukaj smo raziskovali aktivacijo p38 in JNK odgovor na IL-1β, ter njihov vpliv na IL-1β-inducirane metastatskega potenciala GA celic in vitro ali in vivo.
Poleg tega izraz fosfo-p38 (p- p38), v GA je bila njegova povezava z clinicopathologic značilnosti GA, in korelacija med izražanje IL-1β in p-p38 raziskovali v človeški-parafin vgrajeni GA tkiv uporabo imunohistokemično. Na koncu smo značilna tudi molekularne mehanizme, ki uravnavajo IL-1β-inducirano-P38 posredovano metastatskega potenciala GA celic.
Rezultati
IL-1β inducirana aktivacija p38 spodbuja migracijo celic GA in invazijo in vitro
Najprej smo raziskovali, ali je IL-1β sposobni aktivirati p38 signalizacije v GA celicah. Kot je prikazano na sliki 1, je aktivacija p38 (p-p38) odkrita v obeh celičnih linijah GA (AGS in MKN-45 celic) po zdravljenju z IL-1β 30 min; IL-1β inducirane aktivacijo p38 je inhibira SB202190 zaviralcev p38 (Slika 1A). Slika 1 IL-1β spodbuja migracijo celic GA in napad z aktiviranjem p38. A: Western blots je potrdil, da bi se p-p38 inducira min stimulacijo 30 in IL-1β v letnem pregledu rasti in MKN-45 celičnih linijah; aktivacija p38 IL-1β je inhibira zaviralec p38 SB202190. B: Transfekcija p38 siRNA podrli p38 ekspresije v obeh dveh celičnih linij GA. C-F: Zdravljenje GA celic z IL-1β povečano migracijo celic in invazijo in vitro; Ti učinki so bili zavira p38 siRNA ali zaviralec p38 poti, v SB202190. ** P
< 0.05 vs. scramble siRNA (Control siRNA) -transfected celice stimulirali z IL-1β; △△ P
< 0,05 vs netransficirane celice (tip celice divje) stimulirani z IL-1β. Črtice prikazujejo povprečje ± SD število celic na vidno polje (x 400 povečavo) v migracijskih in invazijo testov. G:. Reprezentativne svetlobnim mikroskopom slike AGS in migracije celic MKN-45 in invazije na testih Transwell
P38 lahko spodbujajo migracije in vdor različnih rakavih celic [15]. Da bi raziskali, ali lahko IL-1β spodbujati migracije in vdor GA celic z aktiviranjem P38 signalizacijo, GA celice transfektirane z umešana siRNA (nadzor siRNA) ali p38 siRNA ali GA celice predhodno obdelani z ali brez zaviralca SB202190 na p38 poti, v so stimulirali z IL-1β. Transwell migracije in invazijo testi pokazali, da IL-1β stimulacija povečala migracije in invazijo obeh AGS in podjetja MKN 45 celic; Vendar, IL-1β inducirane celične migracije GA in vdori so precej zmanjša z rasklapanje za p38 uporabo siRNA (slika 1B do G) ali predhodnem zdravljenju z SB202190 (opisano Slika 1C do G). Če povzamemo, ti podatki jasno kažejo, da IL-1β spodbujati migracije GA celic in invazija so posredovane s p38.
IL-1β inducirana aktivacija p38 upregulates MMP2 in MMP9 izražanje in aktivnost v GA celicah
MMP2 in MMP9 imajo dokazano, da igrajo pomembno vlogo v rakave celice invaziji in metastaz [16]. Raziskati, ali MMP2 in MMP9 sodelujejo tudi v IL-1β inducirane-p38 urejeno metastatskega potenciala GA celic, so RT-PCR, imunocitokemija in konfokalna mikroskopija in cimografijo test izvede za določitev MMP2 in MMP9 izražanje in aktivnost v GA celične linije transficirane s kontrolno siRNA ali p38 siRNA, ali predhodno obdelane z ali brez zaviralca SB202190 s p38 in nato obdelane z ali brez IL-1β. Kot je bilo pričakovati, so MMP2 in MMP9 izražanja in povečano aktivnostjo v odgovor na IL-1β zdravljenja (Slika 2A do C). Rasklapanje od p38 uporabo siRNA ali predhodnem zdravljenju z SB202190 zaviralcev p38 bistveno zmanjšala Il-1β povzročeno MMP2 in MMP9 mRNA izražanja in dejavnosti v obeh celičnih linijah GA (Slika 2A do C). Slika 2 IL-1β upregulates MMP2 in MMP9 izražanja in dejavnost, ki jo aktivira p38. A: RT-PCR analiza je pokazala, da so bile MMP2
in MMP9
mRNA molekul v obeh letnem pregledu rasti in podjetja MKN 45 celic v odzivu na zdravljenje z IL-1β; ta učinek je blokirala p38 siRNA ali SB202190 zaviralcev p38. B: Količinska izraza MMP2
in MMP9
mRNA preračuna GAPDH
mRNA. ** P
< 0,05 vs. Utrka-siRNA transfekcije celice stimulirali z IL-1β. △△ P
< 0,05 vs. netransficirane celice stimulirali z IL-1β. C: Gel cimografijo je pokazala, da so bile MMP2 in MMP9 dejavnost povečana pri obeh letnem pregledu rasti in podjetja MKN 45 celic v odzivu na zdravljenje z IL-1β; ta učinek je blokirala p38 siRNA ali SB202190 zaviralcev p38. D: imunocitokemijski obarvanje in konfokalna mikroskopija potrdila, da IL-1β povečano aktivacijo p38 (rdeča), in MMP2 in MMP9 (zelena) izraz v MKN-45 GA celic; ti učinki so ovirale p38 siRNA ali SB202190 zaviralcem p38.
imunocitokemija in konfokalna mikroskopija je pokazala, da je bil p-p38 slabo izražen v neobdelanih MKN-45 celic, ki izražajo tudi zelo nizke vrednosti MMP2 in MMP9. Po stimulaciji z IL-1β, precej višjih od p-p38, so MMP2 in MMP9 odkrita v celicah MKN-45; ti IL-1β-induciranih učinki so bili zavira p38 siRNA in SB202190 (opisano Slika 2D). Če povzamemo, ti rezultati nakazujejo, da je IL-1β skozi p38 povzroča invazije in migracije GA celic, posredovane prek zmožnosti p-p38 za upregulate MMP2 in MMP9 izražanje in aktivnost.
IL-1β-inducirano aktiviranje p38 upregulates MMP2 in MMP9 z aktiviranjem AP-1-odvisno transkripcijo v gA celicah
Znano je dokumentirano, da transkripcijski faktor aktivator protein-1 (AP-1) lahko regulira ekspresijo MMP2 in MMP9 [17] in aktivacije p38 je sposobna regulirati AP-1 aktivacijsko [18]. Da bi preverili, ali so IL-1β-inducirane-p38 posredovano povišani MMP2 in MMP9 izražanje in aktivnost odvisna od AP-1, je bila aktivacija AP-1-odvisne prepisu raziskovali v GA celicah tretiranih z ali brez IL-1β, v prisotnost ali odsotnost inhibicije p38, z uporabo AP-1 luciferaza reporterskega testa je. IL-1β povečano aktivnost AP-1 v obeh celičnih linijah GA (slika 3A); Vendar inhibicija p38 uporabo p38 siRNA ali zdravljene celice inhibitorjev p38 SB202129 zmanjša IL-1β-inducirano AP-1 aktivnost v obeh celičnih linijah GA (slika 3A). Ti rezultati kažejo, da je p38 posredovano izraz MMP2 in MMP9 so IL-1β inducirane odvisna AP-1. Slika 3 IL-1β aktivira AP-1 aktivnost s p38 poti. A: Oba GA celice smo transfektirali z AP-1 reporterskega plazmida ali AP-1 reporterskega plazmida skupaj s žoga siRNA ali p38 siRNA. AP-1 luciferazno reporterski gen aktivnost se je znatno povečal s stimulacijo IL-1β v obeh letnem pregledu rasti in podjetja MKN 45 celic; Ti učinki so bili znatno zavira p38 siRNA na način, ki je odvisen od odmerka in tudi zavira SB202190 zaviralcev p38. ** P
< 0.05 vs. nadzor siRNA (scramble siRNA) + AP-1-Luc transfekcije celice stimulirali z IL-1β; ΔΔP
< 0.05 vs. AP-1-Luc transfekcije celic stimuliranih z IL-1β; relativna luciferazno aktivnost je bila preračunana na B-gal. B: IL-1β-inducirano-p38 posredovana aktivacija v MMP9
promotorjev je odvisna od AP-1-vezavnih mest. ** P
< 0.05 vs. transficirali -670 /MMP9 + nadzor siRNA celice stimulirali z IL-1β; ΔΔP
< 0.05 vs. transficirali -670 /MMP9 celice stimulirali z IL-1β; ▼▼ P
< 0.05 vs. transficirali -570 /MMP9 celice stimulirali z IL-1β; relativna luciferazno aktivnost je bila preračunana na B-gal.
Da bi še dodatno potrjujejo vlogo AP-1 v IL-1β inducirane p38 poti, luciferazno reporter genskih vektorjev, ki vsebujejo lokacij AP-1 MMP9
promotorja regije smo transfektirali v GA celice. V skladu s AP-1 reporterskih genov testih so luciferazne aktivnosti na -670 /MMP9
promotorski regiji (ki vsebuje dve AP-1 veznih mest [-533 in -79] in en NF-КB vezavo na mestu [-600 ] [19-21]) znatno IL-1β-stimuliranih celic (slika 3B) povečala. Transfekciji celic s p38 siRNA ali predhodno obdelanih celicah z zaviralcem p38 SB202129 zmanjša IL-1β inducirane luciferazno aktivnost v tem -670 /MMP9
promotor reporterskega gena (slika 3B). Aktivnost luciferaze zaradi tega MMP9
promotorja (-571 /MMP9
) ni spremenila izbrisom mestu NFκB-vezavo (-600). Poleg tega, ko so območja AP-1 (-79 in -533) od področij MMP9
promotorja izbrisal (-73 /MMP9
mutanti) je luciferaza aktivnost reporterskega gena znatno zmanjšal, v primerjavi z enakim divjini -tip reporterski geni nadzor (slika 3b). Kolektivno, ti podatki močno kažejo, da IL-1β sproži aktivacijo p38 signalne poti, ki spodbuja invazijo in migracije GA celic preko AP-1-odvisne uravnavanjem MMP2 in MMP9 izražanja in delovanja.
Rasklapanje MMP2 ali MMP9 zmanjša IL-1β inducirane migracije in vdor v GA celicah
Da bi še dodatno potrjujejo, da je IL-1β inducirane migracije celic GA in vdor so povezani z uravnavanjem MMP2 in MMP9, AGS in MKN-45 celic so transfekciji s siRNAs proti MMP2
ali MMP9
, ali obdelamo z ali brez MMP2 /MMP9 zaviralec mejne kontrolne točke, nato pa stimulirali z IL-1β. V Transwell migracije in invazijo testi pokazali, da so bile migracije IL-1β-inducirane in invazijo GA celic bistveno zmanjša z rasklapanje MMP2
ali MMP9,
ali predobdelavi z mejne kontrolne točke, v primerjavi s kontrolno celic (slika 4A do C). Zato Povecanje od MMP2 in MMP9 so ključnega pomena za IL-1β inducirane migracije celic GA in invazijo. Slika 4 rasklapanje od MMP2 ali MMP9 ali predobdelave z MMP2 /9 zaviralec mejnih prehodov zavira IL-1β-inducirano migracijo GA celic in invazijo in vitro. A: RT-PCR potrdili učinkovitost MMP2 ali MMP9 siRNAs, ki je znatno zmanjšal MMP2
ali MMP9
izraz, v tem zaporedju, tudi do več kot 75%. B: IL-1β povečala migracija celic GA in invazijo in vitro; Ti učinki so bili zavira MMP2 ali MMP9 siRNA ali zaviralcem MMP2 /9 mejnih prehodov. ** P
< 0.05 vs. scramble siRNA (nadzor siRNA) -transfected celice stimulirali z IL-1β. Palice so srednja vrednost ± SD-krat spremeni normalizirana s kontrolno skupino v migracije in invazijo testov. C: Reprezentativni light mikroskopske slike AGS in MKN-45 celični migraciji in invazije v Transwell migracij in invazijo testih
IL-1β inducirana aktivacija JNK ne sodeluje pri urejanju migracij GA celic in invazijo
. znano je, da so člani MAPK igrajo pomembno vlogo pri regulaciji celične odzive na citokinov in stres, ter P38 in JNK so glavni MAPK družinske člane, ki urejajo IL-1β poti signalizacije. Da bi razumeli, ali je JNK povezano tudi z IL-1β inducirane migracije celic GA in invazije, je Western blot analiza je bila opravljena za odkrivanje aktivacijo JNK odgovor na IL-1β. Kot je razstavljena na sliki 5A, je p-JNK odkrita v obeh letnem pregledu rasti in MNK-45 celičnih linijah po stimulaciji z IL-1β za 30 minut. Vendar pa so rezultati obeh Transwell migracij in invazijo testi so pokazali, da povečana migracija in invazija obeh AGS in podjetja MKN 45 celic s stimulacijo IL-1β induciranih niso zmanjšati z rasklapanje JNK z siRNA niti zmanjšati z zaviranja JNK poti z zaviralcem JNK SP600125 niti (slika 5B do D); Število preseljenih in invazivnih celic skoraj ni pokazala sprememb pred ali po transfekciji s siRNA proti JNK (P > 0,05), ali z ali brez predhodno zdravljeni z zaviralcem JNK SP600125 (P > 0,05). JNK ni bila povezana z IL-1β, spodbuja celične migracije GA in invazija dodatno so jih preveril AP-1 luciferaza reporterskega testa. Kot navzgornji kinaze c-jun (drug pomemben del AP-1), JNK je sposoben aktivirati AP-1 in aktiviranje AP-1 po JNK je tesno povezana s funkcijo JNK o regulaciji različnih celične reakcije, vključno z rakom celične migracije in invazije [22]; Vendar, IL-1β-inducirano AP-1 aktivacija v obeh letnem pregledu rasti in MKN-45 celic ni zavira JNK siRNA niti zaviralec JNK SP600125 niti (slika 5e). Vse skupaj ti podatki močno kažejo, da so povečane migracije GA in invazija IL-1β spodbujati ne ureja JNK. Slika 5 je Aktivacijo JNK niso povezane z IL-1β-inducirane celične migracije GA in invazije. A: p-JNK odkril 30 min stimulaciji z IL-1β v letnem pregledu rasti in MKN-45 celičnih linijah. B: Transfekcija JNK siRNA podrli JNK izraz v obeh dveh celičnih linijah GA. C-D: Zdravljenje GA celic z IL-1β povečane migracije celic in invazije in vitro; ti učinki niso bili zavira JNK siRNA niti zaviralec SP600125 v JNK poti, v. ** P
< 0,05 vs. Utrka-siRNA transfekcije celice stimulirali z IL-1β; △△ P
< 0,05 vs netransficirane celice (divji tip celic) stimulirani z IL-1β; ## Ali ●● bistveno ne razlikuje med tema dvema skupinama je bila odkrita (P
> 0,05). Bari je navedeno povprečno ± SD število celic na vidno polje v migracije in invazijo testov. D: Reprezentativni svetlobnim mikroskopom slike AGS in migracije in invazije MKN-45 celic v testih Transwell. E: Oba GA celice smo transfektirali z AP-1 reporterskega plazmida ali AP-1 reporterskega plazmida skupaj s žoga siRNA ali JNK siRNA. AP-1 luciferazno reporterski gen aktivnost se je znatno povečal s stimulacijo IL-1β v obeh letnem pregledu rasti in podjetja MKN 45 celic; ti učinki niso bili zavira JNK siRNA ne zavira SP600125 zaviralcev JNK niti. ** P
< 0.05 vs. nadzor siRNA (scramble siRNA) + AP-1-Luc transfekcije celice stimulirali z IL-1β; ΔΔP
< 0.05 vs. AP-1-Luc transfekcije celic stimuliranih z IL-1β; ## Ali ●● bistveno ne razlikuje med tema dvema skupinama je bila odkrita (P
> 0,05). Relativna luciferazno aktivnost je bila preračunana na B-gal.
Fosfo-p38 je molekul in korelira z ekspresijo IL-1β, MMP2, MMP9 in c-fos v človeških tkivih GA
ekspresije p-p38 je z serija 105 gA tkiv in seznanjenih ne-neoplastične želodčnega tkiva je pregledal imunohistokemijo (IHC). 105 vzorcev z rakom, 53 primerov GA tkiv (50,48%), razstavljenih prekomerno ekspresijo p-p38 primerjavi z paru non-neoplastičnih želodčnega tkiva (P
< 0,05; slika 6A). Pozitivni p-p38 izraz je pogosto opaziti tako v celični citoplazmi in jedra GA. Slika 6 fosforilirata p38 je prekomerno v človeški GA, in izraz p-p38 pozitivno korelira z IL-1β, MMP2, MMP9 in c-fos izražanja v GA tkivih. A: Prekomerna ekspresija p-p38 so pogosto opazili pri GA tkivih, v primerjavi z paru non-neoplastičnih želodčnega tkiva. A, P-p38 ni bilo zaznano ali le šibko izražen v ne-neoplastičnih želodčnega tkiva. b do e: različne intenzivnosti pozitivnega izražanja p-p38 v GA tkivih. B: Izražanje p-p38 pozitivna korelacija z IL-1β, MMP2, MMP9, in c-fos izražanja v človeških GA tkivih. GA vzorcem tkiva kažejo močnejšo IL-1β izražanja in večjo p-P38, MMP2, MMP9 in c-fos izraz; in šibkejše IL-1β izražanja in šibko p-p38, MMP2, MMP9 in c-fos ekspresijo. C: vsota mnogo pozitivnega intenzivnosti obarvanja z IHC za p-p38. ** P
< . 0.05 vs. paru ne- neoplastične želodčne tkiva
Ni pomembnih povezav med prekomerno p-p38 so opazili v starosti bolnika (< 50 ali ≥ 50 let), spol, velikost tumorja (< 3 cm ali ≥ 3 cm), histološki tip ali razred diferenciacije. Vendar, prikazane čezmernim p-p38 močno povezana s bezgavkah metastaze (P
< 0,05) in invazijo preko korena (P
< 0,05). Ti podatki kažejo, da je prekomerno p-p38 povezana z metastazami v človeški GA.
Kot je razstavljena v sliki 6B, izražanje p-p38 je pokazala dobro correlativity s stopnjami IL-1β, MMP2, MMP9 in AP-1 (c-fos) v GA tkivu in statistično značilna korelacija med dvignjeno p-p38 izražanja in uravnavanjem IL-1β, MMP2, MMP9 in c-fos v GA tkivu (r = 0,72, p < 0,01; r = 0,63, p < 0,01; r = 0,58, p 0.05 in r = 0,69, p < 0,01) smo zaznali pri analizi z metodo Spearmanu
rezultate vsota pozitivnih intenzitete barvanja z imunohistokemijo za p-p38 v obeh 105 primerih gA. tkiva in v parih, ne- neoplastične želodca tkiva so bile razstavljene na sliki 6C.
Invazija testa pri golih miškah
celic MKN-45 transfekciji z umešana siRNA ali p38 siRNA smo injicirali v repno veno BALB /c nu /nu miši; IL-1β ali PBS smo tudi intraperitonealno injicirali od dneva celic smo injicirali 14 dni. Skupina 1 smo injicirali s PBS in umešana MKN-45 celice-siRNA transfekcije; 2. skupina smo injicirali IL-1β in umešana MKN-45 celice-siRNA transfekcije; in skupina 3 smo injicirali p38 siRNA-transfekciji 45 podjetja MKN celic in IL-1β
V 45 dneh po injiciranju celice, vse živali. (06/06, 100%) v IL-1β skupini bolnikov, so razvili pljučne metastaze (Slika 7A do D) (skupina 2, povprečna metastatskega žarišč v 6 pljučnih oddelkov je 14 na pljučih). V nasprotju s tem pa manj živali (2 /6,33.33%) v kontrolni skupini, ki niso bile injicirane z IL-1β je razvil pljučnih metastaz (skupina 1; povprečje 6 metastaz pri 6 pljučnih odsekov na pljučih). Ker je le dve živali v p38 siRNA plus IL-β-zdravljeni skupini razvili pljučnih metastaz in število pljučne metastaze v to skupino je bistveno nižja (skupina 3, v povprečju 4 metastaz v 6 pljučnih oddelkov na pljučih) in bistveno manjši kot je ustrezno skupini zdravljenih z IL-1β (skupina 2) (slika 7A do D). Slika 7 IL-1β stimulacija poveča metastatskega potenciala GA celic in vivo preko mehanizma p38 odvisna. A: Predstavništva pljučne metastaze nastala v različnih skupini miši. B: Bari navedeno število živali, razvili pljučnih metastaz. C: Reprezentativni rezultati HE barvanje pljučnih metastaz. D: Bari navedeno povprečno ± SD število metastatskega žarišč v 6 pljučnih oddelkov /na pljučih pri miših, ki se je razvila v pljučih metastaze. △△ P
< 0.05 vs. vbrizgali transfekciji celic scramble siRNA plus stimulacijo IL-1β. E: analiza RT-PCR p38, MMP2, MMP9
in c-fos
mRNA izražanja v pljučne metastaze različnih miši. F: IHC analiza p-p38, MMP2, MMP9 in c-fos ekspresijo proteinov v pljučnih metastaz; IL-1β povzroča povišan p-P38, MMP2, MMP9 in c-fos ekspresijo proteinov.
Da bi še dodatno potrditev, ali so p38, MMP2 in MMP9 vključen v IL-1β, povzroča pljučnega metastazami GA celic, in ugotoviti, če je ta proces ureja AP-1 ravni mRNA ekspresijski p38, MMP2, MMP9
in c-fos
(eno ključno komponento AP-1) v metastatskem pljučih kvantificiramo z RT-PCR in p-p38 Pregledani so bili MMP2, MMP9 in c-fos izraz beljakovine v pljučnih oddelkih uporabo IHC. Kot je prikazano na sliki 7, E in F, so ekspresijski nivoji p-p38, MMP2, MMP9 in c-fos v metastaznih žarišč pljučih zvišan odgovor na IL-1β. Aktivacija p38 in mRNA ali proteinsko ekspresijo nivoji p38, MMP2, MMP9 in c-fos bila nižja v metastaz, ki jih tvorijo celice transficirane z p38 siRNA plus IL-beta-obdelano skupino (Group3) ali v kontrolni skupini (skupina1 ) v primerjavi z metastazami, ki jih tvorijo žoga siRNA plus IL-β-zdravljeni skupini (skupina 2) (Slika 7E in F). Skupaj, podatkov in vivo še dodatno potrjuje, da je IL-1β inducirane GA celic metastaze posreduje p38 signalizacijo preko AP-1 odvisne uravnavanjem MMP2 in MMP9.
Razprava
Številne študije so pokazale, da IL- 1β je sposoben aktivirati p38 in JNK [11, 12], in p38 in JNK igrajo pomembno vlogo pri migraciji rakave celice in invazije [14, 23-26]. Zato smo predpostavili, da se lahko IL-1β prispevajo k GA celični invaziji in metastaz z aktiviranjem P38 in JNK poti. Da bi raziskali to možnost, smo ocenili sposobnost IL-1β, da aktivirate P38 in JNK, in spodbujati migracije in invazije GA celic. Naši rezultati so pokazali, da bi lahko IL-1β aktivirate tako P38 in JNK, ter povečati GA migracijo celic in napad, in da so ti učinki, ki lahko zavirajo p38 siRNA ali zaviralec p38 SB 202190, vendar ne JNK siRNA ali zaviralec JNK SP600125. To je prvi dokaz, da se lahko IL-1β povzroči migracije GA celic in vdor preko aktivacije p38; Vendar pa so osnovne molekularne mehanizme, s katerimi se IL-β-posredovano p38 signalizacijo urejene v želodcu rakotvornost še vedno v veliki meri neznan.
en potencialni mehanizem, s katerim bi lahko p38 poveča invazijo in migracijo rakastih celic jo dvignili raven MMP [ ,,,0],27]. Znano je, da je izloček MMP s kapaciteto za ekstracelularnega matriksa (ECM) degradacije značilnost metastatskih rakavih celic [28]. MMP2 in MMP9 sta dve od najbolj značilna-MMP in so tesno povezana z invazijo raka in metastaz zaradi svoje močne proteolitično aktivnost ECM [29]. Poročamo tudi tukaj prvič, da je verjetnost, molekularni mehanizem, s katerim IL-1β spodbuja migracijo GA celic in vdor lahko vključujejo IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & MMP9 signalne poti. Pokazali smo, da je bilo MMP2 in MMP9 povečana pri GA celice kot odgovor na stimulacijo IL-1β; Ti učinki so bili zavira siRNAs proti p38, MMP2
ali MMP9
, SB202190 zaviralcev p38, in zaviralec MMP2 /9 mejnih prehodov. Poleg tega rasklapanje MMP2
ali MMP9
uporabo siRNAs ali zaviranje MMP2 9 aktivnosti /prek mejnih prehodov, občutno zmanjšala IL-1β-inducirano migracijo celic GA in invazijo. Kot proteinske kinaze serinske /treonin, p38 je sposobna induciranja aktivacijo transkripcijski faktor AP-1 [30]. nadalje smo ugotovili, da so bili IL-1β-inducirane,-p38 posredovano Povecanje od MMP2 in MMP9 AP-1-odvisna. IL-1β je le sposobna aktivirati transkripcijo MMP9
promoter regije, ki vsebujejo AP-1 mest, in ti učinki so bili zmanjšati z p38 siRNA in SB202190 zaviralcev p38. Poleg tega IL-1β inducirana aktivacija AP-1-odvisne transkripcijo je inhibira p38 siRNA.
Fosfo-p38 (p-p38), aktivirano obliko p38, mogoče odkriti v skoraj 50% človeškega GA vzorce tkiva testirane IHC testom, in izraz p-p38 je značilno povezana z bezgavkah metastaz in invazije izven korena pri bolnikih z gA. Poleg tega ekspresijo IL-1β pozitivni korelaciji z ekspresijo p-p38, MMP2, MMP9 in c-fos v kliničnih GA osebkov. Poleg tega, in vivo podatki iz metastaz testa pokazala, da so nastanek pljučnega metastatskega žarišč, ki ga GA celic in p38 /
p-p38, MMP2, MMP9 in c-fos mRNA in proteina izražanja v metastatskih žarišč pljučnih dvignil IL-1β in zmanjšana za injekcijo celic, transfektiranih s p38 siRNA. Skupaj ti podatki nakazujejo, da pride do IL-1β-inducirane celične migracije GA in invazija prek aktivacije signalne poti p38, ki vodi do AP-1 aktivacije in uravnavanjem MMP2 in MMP9. Zato, p38 igra ključno vlogo pri IL-1β inducirane metastaz v GA.
JNK je še en pomemben MAPK, da je dobro znano, da imajo pomembno vlogo pri uredbe IL-1β signalizacije v različnih celicah [14, 31]. Vendar pa v tej študiji, JNK bilo ugotovljeno, da niso vpleteni v regulacijo IL-1β-inducirane celične migracije GA in invazije. JNK siRNA in zaviralec JNK niso zmanjšali IL-1β povzroča migracijo celic GA in invazijo, ne zmanjšajo aktivacijo AP-1 IL-1β inducirane. Zato, IL-1β, spodbuja celične migracije GA in invazija ureja p38, ne pa JNK.
Skratka, smo opisali prvič, da je IL-1β funkcionalno sodelujejo pri urejanju metastaz v GA prek aktiviranje p38. To molekularni mehanizem vključuje AP-1-odvisna uravnavanjem-p38 posredovano v MMP2 in MMP9; in ta raziskava jasno kaže, da je IL-1β /p38 /AP-1 (c-fos) /MMP2 & Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Gastroparezo povezana z gastroptosis predstavlja kot spodnjem predelu trebuha grupiranja maso otroka: prikaz primera
• Vpliv IL17A polimorfizmov na odklonskega metitiranjem DAPK in CDH1 v ne-rakasto želodčne sluznice