Stromala fibroblaster i mikro av gastric karcinom främja tumörmetastas via uppreglering TAGLN expression

stromala fibroblaster i mikro av gastriska karcinom främja tumörmetastas via uppreglera TAGLN uttryck Bild Sammanfattning
Bakgrund
Fibroblaster spelar en avgörande roll i tumörbildning, tumör progression och metastasering. Men deras detaljerade molekylära egenskaper och klinisk betydelse är fortfarande svårfångade. TAGLN är ett aktinbindande protein som spelar en viktig roll i tumörbildning.
Resultat
Vi undersökte interaktionen mellan cancerceller och tumörmikromiljön för att bestämma hur de fibroblaster från mänsklig magkarcinom lätta tumörbildning genom TAGLN. QRT-PCR och Western blot indikerade att TAGLN uttryck uppregleras i magcancer-associerade fibroblaster (CAFS) som främjar magsäckscancer cellmigration och invasion. Använda små störande RNA (siRNA), fann vi att CAFS förbättrad tumörmetastas genom uppreglerade TAGLN in vitro och in vivo. Uttrycket av matrix metalloproteinas-2 (MMP-2) var signifikant lägre efter TAGLN knock-down av siRNA. TAGLN nivåerna var förhöjda i human magcancer stroma än normalt gastric stroma och i samband med differentiering och lymfkörtelmetastaser av magcancer.
Slutsats
CAFS kan främja magcancer cellmigration och invasion via uppreglering TAGLN och TAGLN inducerad MMP-2 produktion.
Nyckelord
TAGLN Fibroblast mikromiljö tumörmetastas Gastric cancer bakgrund
Gastric cancer är den näst vanligaste orsakerna till cancerrelaterade dödsfall i världen, särskilt i Asien [1, 2]. De flesta av gastric cancerpatienter dog av tumöråterfall orsakat av avlägsna metastaser. Metastas är en flerstegsprocess genom vilken cancerceller sprider från den primära tumör och invadera omgivande vävnad och distansorgan, som inbegriper cancercellrörlighet, intravasering, transit i blodet eller lymfan och extravasering [3]. Denna process beror tätt på den omgivande mikromiljö och tumörutveckling förlitar sig på en kontinuerlig överhörning mellan cancerceller och extracellulära mikromiljöer [4].
Transgelin (TAGLN, även känd som SM22) är en aktin tvärbindande protein som är involverat i kalcium interaktioner och reglerar kontraktila egenskaper [5]. Det kan spela en roll i celldifferentiering, cellmigration cellinvasion och matris remodellering genom att stabilisera cytoskelettet genom aktinbindning [6, 7]. Överexpression av TAGLN protein har observerats i karcinom i magen, levern, och matstrupen, medan minskade nivåer av TAGLN mRNA har observerats i bröst- och koloncancercellinjer och primära tumörer [8].
Det är allmänt accepterat att tumören -stroma interaktioner spelar en viktig roll i tumörutveckling och progression. Stroman består huvudsakligen av extracellulär matris (ECM) och cellulära element, såsom fibroblaster [9, 10]. Cellkomponentema hos stroma är välkänd ha en stödjande roll i cancer [11, 12]. Dessa stromala element agera på en synergistisk överhörning med cancerceller från den primära platser för att upprätthålla cancertillväxt och metastaser [13, 14]. Den tumörstroma vilken hänvisas till som en "reaktiv stroma" är associerat med ett ökat antal fibroblaster, förbättrad kapillär densiteten och deponering av en ny ECM rik på typ-1-kollagen och fibrin [15]. Ackumulerande bevis visar att stromaceller, såsom fibroblaster har en mer djupgående inflytande på utvecklingen och utvecklingen av cancer än vad som tidigare uppskattat [15-17].
Fibroblaster är väl kända för att spela roller i tumörbildning och progression. Fibroblaster uttrycker vimentin, fibronektin, α-glatt muskulatur aktin (α-SMA), fibroblast ytprotein liksom fibroblastiska markörer. Carcinoma-associerade fibroblaster (CAFS) är aktiverade fibroblaster, biologiskt skiljer sig från fibroblaster närvarande i godartade mikromiljöer i flera viktiga aspekter [17, 18]. CAFS är inte passiva åskådare i tumörbildning och metastas, men aktivt bidra till dessa processer [19]. Vår kunskap om betydelsen av vilande och aktiverade fibroblaster i cancer är fortfarande under utveckling. Här fokuserar vi på samspelet mellan cancerceller och deras mikromiljöer för att studera hur fibroblaster isolerade från humana gastriska karcinom underlättar tumörbildning.
Resultat
uttryck TAGLN uppregleras i magcancer-associerade fibroblaster
carcinoma -associated fibroblaster (cafs), motparts fibroblaster (CPFs) och normala fibroblaster (NFS) erhölls från primär vävnadsodling med användning av vävnader från cancerassocierade regioner, icke-cancer-associerade stroma och normal slemhinna, respektive. Vi verifierade sedan renheten hos de olika fibroblast populationer genom immunfärgning. Dessa fibroblast populationer uttryckte höga levls av fibroblastceller markörer som vimentin, α-SMA och fibronektin. Å andra sidan, har dessa celler inte uttrycka epitelceller markörer såsom cytokeratin (Figur 1A). Dessa data bekräftade renheten hos fiborblasts. Dessa observationer tyder på att odlingscellerna var huvudsakligen fibroblaster bereddes med minimal förorening av andra celler. Figur 1 Uttrycket av TAGLN uppregleras i magcancer associerade fibroblaster. A: karakterisering av gastric fibroblaster (ICC). A1: vimentin, positiv. A2: α-SMA, positiv. a3: fibronektin, positiv. a4: cytokeratin, negativ. Ursprungliga förstoringar: × 200. Skalstrecken, 100 ^ M. B: QRT-PCR-analys av TAGLN i CAF, CPF och NF. *, P Hotel < 0,05, **, P Hotel < 0,01, jämfört med NF. C: Western blot-analys av TAGLN i CAF, CPF och NF var TAGLN uttrycksnivå successivt minskat. D: fibroblaster tillväxtkurva bestämdes genom CCK-8-analysen, CAFS växte quickier än de andra. E: CAF hade högre förmåga att öka MKN-45: s migrationsförmåga än CPF och NF, *** P Hotel < 0,001 jämfört med MKN-45. F: CAF hade högre förmåga att öka MKN-45 invasion förmåga än CPF och NF, *, P Hotel < 0,05, **, P Hotel < 0,01, jämfört med MKN-45.
MRNA och proteinnivåer TAGLN var lägre i CPFs och NFS jämfört med CAFS (Figur 1B och C). Vi visade först att CAFS växte betydligt mer än CPFs och NF in vitro celltillväxt (figur 1D). Därefter genomförde vi cellinvasion och migration analys för att testa om invasionen och migration förmåga gastric cancerceller skulle kunna förbättras genom fibroblaster. Experimentet utformades för att undersöka effekterna av stroma TAGLN, som utsöndras av fibroblaster, om de mänskliga gastric cancerceller. De interna nivåer TAGLN i gastric cancerceller kan störa den experimentella processen. Därför valde vi MKN-45 cellinje, eftersom dess TAGLN uttrycksnivån var den lägsta på sju gastric cancercellinjer (SNU-1, AGS, NCI-N87, KATOIII, MKN-45, MKN-28 och SGC-7901, data inte visad). Intressant nog ökade invasionen och migration förmåga MKN-45 i samtliga tre grupper (CAF, CPFs och NFS), och ökade mest i gruppen med CAF (Figur 1E och F). Förvärvet av migration och invasiva beteende är ett steg i metastaserande process.
CAFS främja tumörmetastas genom uppreglering TAGLN
För att undersöka effekten av TAGLN i fibrobalsts använde vi RNAi att slå ner TAGLN uttryck. CAF, CPFs och NFS transfekterades med TAGLN specifika eller icke-tystnad siRNA. RNA och protein erhölls vid 24, 48 eller 72 timmar efter transfektion, var TAGLN mRNA och proteinnivåer undersökts av QRT-PCR och Western blöt. TAGLN mRNA och protein var signifikant mindre i celler behandlade med TAGLN specifika siRNA (figur 2A och B). Figur 2 CAFS förbättra tumörcellinjen MKN-45 migraton och invasion genom uppregleras TAGLN. A: TAGLN uttryck av QRT-PCR-analys efter siRNA knockdown i fibroblaster. B: TAGLN uttryck genom Western blot-analys efter siRNA knockdown i fibroblaster. C: cellmigrationsassay in vitro (fibroblaster med eller utan TAGLN siRNA störningar). D: cellinvasion analys in vitro (fibroblaster med eller utan TAGLN siRNA störningar). Värden representerar medelvärdet ± SD från minst tre separata experiment, vart och utfördes i triplikat. *, P Hotel < 0,05, **, P Hotel < 0,01, *** P Hotel < 0,001, genom en-vägs variansanalys (ANOVA).
Sökte vi därefter huruvida invasionen och migration förmåga av gastriska cancerceller kommer att förstärkas genom expression av TAGLN i fibroblaster, genomförde vi cellinvasion och migration assay in vitro . Fibroblaster och MKN-45 var icke-contactedly samodlade. Intressant, invasionen och migration förmåga MKN-45 minskade omedelbart i gruppen med CAFS och minskade något i gruppen med CPFs och NFS. Resultaten visade att invasionen och migration förmåga MKN-45 kan minska genom nedreglering av uttrycket av TAGLN (figur 2C och D).
För att bedöma bidrag CAFS-TAGLN till tumörmetastas in vivo, vi emplyed en xenograft modell. Vi blandade TAGLN siRNA CAFS, icke tystas CAFS, CPFs och NFS med MKN-45 humana gastriska cancerceller i en 2: 1-förhållande eller MKN-45 ensam och ympades dessa celler genom svans intravenös injektion i immundefekta nakna möss. Efter 6 veckor, MKN-45 blandat med CAFS genererat mer lungmetastatiska knölar än MKN-45 blandat med TAGLN siRNA CAFS, CPFs och NFS liknande MKN-45 blandat med icke-tystnad siRNA CAFS (tabell 1). Dessa data antydde att CAFS visar en ökad förmåga att stimulera tumörmetastaser (figur 3A och B). Alla observationer indikerade att i närvaro av CAFS, tumörer blev mer aggressiva, vilket tyder på att CAFS kan spela roller när det gäller metastas i magcancer. Figur 3 TAGLN förhöjer tumörmetastas genom human tumör xenograft model in vivo. A: nakna möss metastatiska knölar i lungorna. a1: lungmetastatiska knölar från tomur bärande mus. Pil: metastaserad knöl. a2: ingen metastaserad knöl i lungan. a3: H & E-färgning för lungmetastaserande knöl i starkt fält mikroskop. Skalstrecken, 200 ^ M. a4: H & E-färgning för lunga utan metastaserad knöl i starkt fält mikroskop. Skalstrecken, 200 ^ M. B: kvantifiering av nakna möss lungmetastatiska knölar i olika grupper genom svans intravenös injektion. *, P Hotel < 0,05, genom en-vägs variansanalys (ANOVA).
Tabell 1 nakna möss lungmetastatiska noduler i olika grupper genom svans intravenös injektion (Varje grupp innehöll 6 möss)
grupper
TAGLN siRNA CAF -MKN45
icke-tystnad siRNA CAF-MKN45
CAF-MKN45
CPF-MKN45
NF-MKN45
MKN45 ensam
antalet tumörbärande möss 2
5
5
3 2
2 Review Antal metastatiska knölar 2
10
9
5
3 2
TAGLN främjar tumörmetastaser genom uppreglering MMP-2 Review Många studier har fokuserat på rollen av matrismetalloproteinaser (MMP) till invasionen av omgivande bindväv och metastas av tumörceller från den primära lesionen till avlägsna ställen i tumörprogression [20, 21]. I vårt tidigare arbete undersökte vi MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 och MMP-9 nivåer efter TAGLN knock-down av siRNA genom ELISA, bara MMP-2 nivå var betydligt nedregleras, andra MMP nivåerna visade ingen förändring. Hence, vi focued på MMP-2 i denna studie. Som figur 4A visade, jämfört med MKN-45 co-coultured med CAF /neg och CAF /mock, MMP-2 våningar i supernatanten från MKN-45 samodlades med CAF /siTAGLN signifikant undertryckt. Vi undersökte nästa aktiviteten hos MMP-2 användning av gelatin zymografi analys. Vi hittade MMP-2 aktiviteten dramatiskt inhiberades i supernatanten från MKN-45 samodlades med CAF /siTAGLN än med CAF /neg och CAF /mock (Figur 4B). Sålunda kan TAGLN förbättra tumörmetastas genom MMP-2-enzymer nedbryta basalmembran (t.ex.. Kollagen IV). Figur 4 TAGLN förbättrar tumörmetastas genom uppreglerad MMP-2. A: MMP-2 uttryck i CAF decresed uppenbarligen efter TAGLN RNAi genom ELISA. *, P Hotel < 0,05 av en-vägs variansanalys (ANOVA). Felstaplar visar standardfelet kring medelvärdet. B:. Knockdown TAGLN nedsatt förmåga CAF till hemlig MMP-2 av gelatin zymografi
TAGLN uttryck i human magcancer och dess samband med differentiering i gastric cancerpatienter
att utvärdera TAGLN uttryck i magcancer, TAGLN immunofärgning i 98 primära gastriska cancervävnader undersöktes. TAGLN uttryck uppregleras i human magcancer stroma jämfört med normal gastrisk vävnad (Figur 5A: normal gastrisk vävnad Figur 5B: gastric cancervävnad). Korrelationen mellan TAGLN uttryck med kliniskt patologiska drag visade i tabell 2. TAGLN nivåerna var högre i odifferentierade tumörer (dåligt differentierade adenokarcinom, signetring cellscancer och slem karcinom) än i differentierade ettor (väl och måttliga adnocarcinomas) (P
= 0,003). Dessutom var TAGLN nivåer korrelerade med lymfkörtelmetastaser (P
= 0,029). Det fanns inga signifikanta skillnader i tumör TAGLN uttryck enligt de andra kliniskt patologiska egenskaper som kön, ålder, tumörstorlek, Lauren klassificering, T skede avstånd metastaser och TNM stadium (P
≥ 0,05). Figur 5 Expression av TAGLN i humana gastriska cancervävnader. A: TAGLN expressionsnivån i normal gastrisk vävnad med IHC. Skalstrecken, 100 ^ M. B: TAGLN är överuttryckt i stroma av human magcancer med IHC. Skalstrecken, 100 ^ M. C: TAGLN mRNA uppregleras i human magsäckscancer analyserades med QRT-PCR. D: TAGLN protein uppregleras i human gastric cancer analyserades med Western blöt. Värden representerar medelvärdet ± SD från minst tre separata experiment, vart och utfördes i triplikat. *, P Hotel < 0,001 av paried-prov T
test.
Tabell 2 kliniskt patologiska sammanslutningar av TAGLN uttryck i magcancer
Antal fall
TAGLN immunfärgning
P
vid Svag (+)
Stark (++)
Kön
0,778
Man
60
27
33
Kvinna
38
16
22
Ålder
0,739
≤60y
46
21
25
> 60Y
52
22
30
Tumörstorlek storlek~~POS=HEADCOMP
0,852
≤5 cm
58
25
33 Hotel > 5 cm
40
18
22
Differentiering
0,003
Väl + Medel
46
13
33
Dålig
52
30
22
Lauren klassificering
0,059
Intestinal
40
13
27
Diffusa
58
30
28
T-steget
0,142
T1 + T2
56
21
35
T3 + T4
42
22
20
Lymfkörtel metastaser
0,029
N0
27
11
16
N1
32
15
17
N2
26
7
19
N3
13
10
3
fjärrmetastaser
0,709
Utan
95
42
53 hotell med
3 1
2 Review TNM stadium
0,722
I
20
7
13
II
25
11
14
III
30
10
20
IV
23
15
8
Dessutom använde vi QRT-PCR och Western blot för att utvärdera uttrycket av TAGLN i magcancer vävnader (figur 5C och D). Dessa resultat tyder på att TAGLN uttryck i magcancer vävnader var mycket högre i magcancer än den parade normala vävnader.
Diskussion
Ackumulerande bevis visar att cancer initiering och progression innebär samverkan mellan både tumör och stromaceller. Tumörceller kan aktivt rekrytera stromala celler, såsom vaskulära celler, glatta muskelceller och fibroblaster, in i tumören, vilket genererar mikromiljö för att främja tumörtillväxt [16, 22, 23]. Fibroblaster utgör ofta de flesta av de stromala celler inom en gastrisk karcinom, men de funktionella bidragen av dessa celler till tumörbildning och tumörmetastas förblir dåligt förstådda.
TAGLN är en av de tidigaste markörerna för glatt muskulatur differentiering under embryogenes [24], och tidigare studier relaterade till TAGLN främst inriktad på glatta muskelceller [25]. Patologiska tillstånd åtföljda med vävnadsombildning och fibrogenes, såsom sårläkning och neoplastiska lesioner, kännetecknas av förekomsten av stromala celler med ultrastrukturella egenskaper som ligger mellan egenskaperna för typiska fibroblaster och de av glatta muskelceller. Dessa fibroblaster uppvisar fenotypiska och funktionella egenskaper hos glatta muskelceller och därmed benämns myofibroblaster [26], såsom CAFS. I vår studie var TAGLN överuttryck även observerats i CAFS. Det har rapporterats att TAGLN proteinet överuttrycks i gastrisk cancer när proteinuttryck spektrum av magcancer analyserades med användning av två-dimensionell gelelektrofores (2-DE) [27]. Vidare är TAGLN proteinet en av de två tumörassocierade antigener som identifierades i serum hos njurkarcinom patienter genom Klade med användning av 2-DE [28]. Dessa rapporter är i överensstämmelse med resultaten som vi har observerat med hjälp av realtids-PCR och Western blot. Intressant nog fann vi att TAGLN huvudsakligen upptäcktes i fibroblaster härledda från tumörstroma, snarare än i tumörceller. På liknande sätt upptäcktes andra forskare att TAGLN inte uttrycks i de maligna cellerna men i mesenkymala celler av tumörstroma [27].
Stromaceller och fibroblaster reglerar endotelcell eller epitelial cellbeteende genom direkta och indirekta cell CEL1 interaktioner. Aktivering av värd stroma1 mikro tros vara ett kritiskt steg i tumörtillväxt och progression [13, 29]. Proteiner utsöndrade av stromaceller i tumörerna kan positivt eller negativt påverka tumörprogression. De mest framträdande åtgärder TAGLN kan gynna tumörcellrörlighet och invasion [7, 30, 31]. Vi fann att TAGLN ökade signifikant i lymfkörtelmetastaser grupp än lymfkörtel negativ grupp. Att c1arify roll TAGLN i stromala fibroblaster under magcancer tumörbildning och metastas, tystade vi TAGLN uttryck i humana CAFS. Det angavs att endast MKN-45 samodlades med CAFS uttrycker hög nivå TAGLN uppvisade mycket högre invasion och migration förmåga. Fibroblaster som TAGLN hade blivit nedslagen inte visa den här funktionen. Sammantaget föreslår vi att TAGLN skulle vara ansvarig för att höja magcancer cell metastaser via stromaceller såsom CAFS.
TAGLN uttryck ökar avsevärt i mag CAFS. CAFS med ökade TAGLN uttrycksnivåer kan öka tumörcellinvasion och migration förmåga som främjar en förbättrad uttryck av MMP-2. Stimuleringen av MMP-uttryck i fibroblaster antingen efter direkt kontakt med tumörceller eller efter kontakt med tumörcellhärledda lösliga faktorer från tumörer med ursprung från epitelceller har visats i ett flertal studier [32-35]. Klargöra de bakomliggande mekanismerna kan därför dämpa tumörrecidiv och metastaser i mag cancerpatienter.
Slutsatser
Sammanfattningsvis visar vår studie att CAFS kan främja magcancer cellmigration och invasion genom ökad MMP-2 produktion orsakad av TAGLN uppreglering .
metoder
Vävnadsprov prov~~POS=HEADCOMP sälja totalt 40 par av cancervävnader och motsvarande normal slemhinna för QRT-PCR och Western blot och 98 primära gastric cancer för immunfärgning samlades från avlägsnas kirurgiskt magcancer diagnostiseras vid institutionen Kirurgiska, Ruijin sjukhus, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Normal slemhinna Prover togs från kanten av den resektion där tumörerna belägen åtminstone över 6 cm bortsett från den. Denna studieprotokoll godkändes av oberoende etisk kommitté av Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine. Informerat samtycke skrevs. Alla prov snabbfrystes i flytande kväve över natten och hölls vid -80 ° C före användning. 4% formaldehydfixerade vävnadssnitt både tumör och slemhinna färgades med H & E och granskas och verifieras histopatologiskt av två patologer. Varje prov tillskrevs en diagnos och gjorde för Lauren klassificering, differentiering, pTNM skede. Tumörens storlek, placering och andra kliniska patologiska egenskaper erhölls från kliniska register med patient tillstånd
Cellinjer
magcancer cellinjer SNU-1 (ATCC: CRL-5971)., AGS (ATCC: CRL-1739), NCI-N87 (ATCC: CRL-5822) och KATOIII (ATCC: HTB-103) erhölls från American Type Culture CoUection (Manassas, VA, USA). Ytterligare 3 gastric cancercellinjer, MKN-45, MKN-28 och SGC-7901, konserverades vid vårt institut. Alla cellinjer hölls i RPMI-1640 kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS).
Antikroppar
Primära antikroppar som används för färgning ingår human specifik anti-vimentin (Abcam, Cambridge, UK), anti-fibronektin ( Abcam, Cambridge, UK), anti-α-glatt muskulatur aktin (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA), anti-pan-cytokeratin (Abcam, Cambridge, UK), anti-SM22 (Abcam, Cambridge, UK) och mus anti-GAPDH (Kangchen, Kina).
Isolering av mänskliga gastric fibroblaster
fibroblaster isolerades från cancer- och icke-cancerassocierade regionerna i mag vävnader dissekerade från patienter med magcancer under radikal gastric resektion från Institutionen för kirurgi, Ruijin sjukhus, Shanghai Jiao Tong University School of medcine. Cancerassocierade regioner valdes ut för att vara minimalt nekrotiska regioner i tumörmassan. Icke-cancer-associerade stroma, som isolerades från vävnad åtminstone 2 cm distalt till den yttre marginalen av cancermassa. Normal slemhinna Prover togs från kanten av den resektion där tumörerna belägen åtminstone över 6 cm bortsett från den. Vävnaderna finfördelats genom organoids av approximativt 1 mm 3 och såddes på obelagda plastmaterialet i RPMI 1640-medium innehållande human basisk fibroblasttillväxtfaktor, 20% fetalt kalvserum (FCS) och penicillin och streptomycin som antibiotika. Dessa förhållanden gav en homogen fibroblastisk cellpopulation efter 7 dagars odling. Varje fibroblast ades sedan expanderat i en 1: 3-förhållande av trypsin-EDTA i 10 cm petriskålar. Vi använde fibroblaster passe för upp till 8 populationsfördubblingar (PDS) för efterföljande experiment, i syfte att minimera klonurvalet och kultur påkänning som skulle kunna inträffa under förlängd vävnadsodling.
Immunohistokemisk färgning (IHC) Review Celler eller vävnader fixerades under 30 min med 4% formalin och sköljdes med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Efter endogen peroxidasaktivitet släcktes med 0,3% H 2O 2 ades cellerna blockerades med normalt icke-immunt serum under 30 min innan de inkuberades med primär antikropp vid 37 ° C under 2 timmar. Celler eller vävnader märktes sedan med streptavidin-biotin-pepparrotsperoxidas färgningskit (Dako, Carpinteria, CA, USA). Närvaron av märkt peroxidas på sektionerna visualiserades genom inkubation med 3,3 '- diaminobenzidin, DAB + substrat kromogen och sektionerna motfärgades med hematoxylin. Negativa kontrollobjektglas utfördes genom utelämnande av den primära antikroppen.
TAGLN uttryckning bedömdes genom intensiteten av färgade celler och bestämdes i två kategorier (svagt positivt och starkt positivt). Färgningsintensiteten klassificerades enligt fyra grader (intensitetspoäng): ingen färgning (grad 0), ljusbrun färgning (grad 1), brun färgning (grad 2), och mörkbrun färgning (grad 3). Grad 0 och klass 1 definierades som svagt positiv, var klass 2 och klass 3 definieras som starkt positiv.
Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) Review Totalt RNA extraherades med användning av Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. cDNA erhölls med en ^ g RNA med användning av omvänd transkription System Kit (Promega, Madison, WI, USA) och QRT-PCR utfördes med SYBR Green PCR kärnreagens kit (Applied Biosystems, Warrington, UK). Primers som är specifika för TAGLN var följande: 5 '- GAGCAAGCTGGTGAACAGCC-3 ' (övre), 5 '- GACCATGGAGGGTGGGT TCT-3 ' (lägre). Glyceral-dehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) användes som den endogena referensen. Dess sekvenser var 5 '- GGACCTGACCTGCCGTCT AG-3 ' (övre), 5 '- GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 ' (lägre). QRT-PCR för kvantifiering av mRNA-nivåer av TAGLN gjordes på en ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Data analyserades med hjälp av jämförande Ct metoden. Specificiteten hos resulterande PCR-produkterna bekräftades genom smältkurvor.
Western blöt
Celler skördades och lyserades med däggdjursprotein extraktion reagens (Pierce, Rockford, IL, USA). Proteinkoncentrationer bestämdes med en bicinkoninsyra (BCA) proteinanalyskitet (Pierce, Rockford, IL, USA). Prover innehållande 50 | j, g av totalt protein laddades på varje bana av 12% akrylamidgel i en minigel-apparat (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). De separerade proteinerna överfördes till ett polyvinylidendifluorid (PVDF) -membran (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Efter att ha blivit inkuberades med primär antikropp (1: 1000) och HRP-konjugerad sekundär antikropp (1: 5000). Respektive, immunkomplex detekteras av förstärkt kemiluminiscent (ECL) -systemet (Millipore, Bedford, MA, USA) Review Enzym -kopplad immunosorbentanalys (ELISA) sälja The protein nivåer av MMP-2 i supernatanter mättes med ett ELISA-kit (R &D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) enligt tillverkarens instruktioner
Celltillväxt tillväxt~~POS=HEADCOMP. assay
De olika grupperna av celler (1 x 10 3) såddes i 96-brunnars plattor i tre exemplar. Antalet livsdugliga celler bestämdes dagligen med användning av Cell Counting Kit (CCK-8) genom att utnyttja en mycket vattenlösligt tetrazoliumsalt WST-8 [2- (2-metoxi-4- nitrofenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5- (2,4-disulfofenyl) -2H-tetrazolium, mononatriumsalt] (Dojindo, Japan). I korthet tillsattes 20 pl av CCK-8-lösning till plattor, var absorbansen vid 450 nm mättes efter 4 timmar inkubation.
Bedömning av tumörinvasion och migration
tumörinvasion och migration analys utfördes med QCMTM24 brunnar invasion kit (Millipore, Bedford, MA, USA) och QCMTM24 brunnar migration kit (Millipore, Bedford, MA, USA) enligt protokollet som tillhandahålls av tillverkaren, respektive. Add beredda MKN-45 cellsuspension (2 x 10 5 celler /brunn) till den övre kammaren och lägga pre-suspenderades fibroblaster (5 × 10 4 celler /brunn i RPMI 1640-medium innehållande 20% FBS) för att den undre kammaren. Den TAGLN vissa fibroblaster i nedre kammare hämmades med hjälp av siRNA 24 timmar senare. MKN-45 och fibroblaster samodlades icke-contactedly under 48 h, lysised sedan cellerna och bestämdes RFU värden med en fluorescensplattläsare med användning av 480/520 nm filter set.
TAGLN siRNA
Qiagen programvara användes att utforma RNAi-sekvenser som riktar humant TAGLN (accessionsnummer ingen NM_003186.) och siRNA-sekvensen med den högsta förmodade effekt (sense: 5 '- AAAUCGAGAAGAAGUAUGAdtdt-3 ', antisense: 5 '- UCAUAC UUCUUCUCGAUUUdtdt -3 ') syntetiserades av Shanghai GeneChem Co, Ltd siRNA med randomiserad sekvens (sense: 5 ' - UUCUCCGAACGUGUCACG Utt-3 ', antisense: 5 ' - ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 ') mot ingen gen (oordning siRNA grupp) transfekterades som intern kontroll. För experiment, transfekterades celler med DOTAP liposomala transfektionsreagens (Roche, Tyskland). Celler såddes vid 2 x 10 5 celler /brunn i 6-brunnsplattor. Efter 24 timmar när cellerna var i fas av log tillväxt, 250 ul Opti-MEM I blandades med 5 pl av 20 pM siRNA duplex, medan en annan 250 pl Opti-MEM jag separat inkuberades med 11,88 il DOTAP liposom. De två blandningarna blandades försiktigt och inkuberades under ca 30 min vid rumstemperatur. För transfektion, ades hela blandningen sattes till varje brunn i 1,5 ml färskt medium utan antibiotika. Den slutliga transfekterade koncentration av siRNA var 20 nM. Celler uppsamlades för ytterligare analys vid 24, 48 och 72 timmar efter transfektion.
Gelatin zymografi
Odlingssupernatanterna skördades vid 24 h och blandades med en gel-provbuffert (0,5 M Tris-HCl, glycerol, 10% natriumdodecylsulfat [SDS], β-merkaptoetanol och 0,5% bromfenolblått). Tio mikrogram av protein togs genom SDS-PAGE separation; de SDS-PAGE-geler innehöll 0,1% gelatin (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Efter elektrofores överfördes gelerna tvättades i 50 mM Tris-buffert innehållande 2,5% Triton X-100. Gelerna inkuberades under ytterligare 24 timmar i inkubation vätska (50 mM Tris-buffert [pH 7,6], 10 mM CaCb 2, och 200 mM NaCl). Gelerna färgades med 0,5% Coomassie-blått, vitt band (72 kDa) på en blå bakgrund indikerade zoner av matsmältningen som motsvarar närvaron av MMP-2.
Musmodell
BALB /c nu /nu
nakna möss, åldersmatchade mellan 4-5 veckor (Institute of Zoology Chinese Academy of Sciences), inhystes vid en specifik patogen miljö i djurlaboratorieenhet, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Kina. Fibroblaster och MKN-45 blandades i förhållandet 1: 4 inom 0,1 ml PBS och injicerades i den laterala svansvenen. Sex möss inkluderades i varje grupp i samtliga försök, och varje experiment utfördes två gånger. Avlivades djuren och lungmetastatiska noduler registrerades 6 veckor efter tumörcell implantation. Tumörprover samlades upp, blandades i formalin, inbäddades i paraffin, och utsattes för H & E-färgning. P Hotel < Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Samtidig förekomst av flera hjärninfarkter på grund av hyperkoagulerbarhet samband med malignitet och meningeal karcinomatos som den initiala manifestation av magcancer
• Har gastric tonometri styrd terapi minska den totala dödligheten i kritiskt sjuka patienter?