Стромальные фибробласты в микросреде желудка карцином способствуют метастазирование опухолей с помощью повышающей регуляции TAGLN expression

фибробластами стромы в микросреде желудка карцином способствуют метастазирование опухоли
Фибробласты играют критическую роль в онкогенеза, опухоли с помощью повышающей регуляции экспрессии TAGLN
Аннотация
Справочная информация прогрессия и метастазирование. Тем не менее, их подробные молекулярные характеристики и клиническое значение до сих пор не удается. TAGLN является актин-связывающий белок, который играет важную роль в онкогенеза.
Результаты
Мы исследовали взаимодействие между раковыми клетками и микросреды опухоли, чтобы определить, как фибробласты от рака желудка человека облегчить туморогенез через TAGLN. QRT-PCR и Вестерн-блот показали, что экспрессия TAGLN был усиливается в карциномы желудка ассоциированных с фибробластами (CAFS), которые способствуют желудка миграции раковых клеток и инвазию. Использование малых интерферирующих РНК (миРНК), мы обнаружили, что CAFS усиливается метастазирование опухоли через активируемых TAGLN в пробирке и в естественных условиях. Экспрессия матриксных металлопротеиназ-2 (ММР-2) был значительно ниже, после того, как TAGLN нокдауна по миРНК. Уровни TAGLN были повышены у желудка человека стромы рака желудка по сравнению с нормальным стромы и связанные с дифференциацией и метастазов в лимфатических узлах рака желудка.
Заключение
CAFS может способствовать желудочный миграции раковых клеток и инвазию с помощью повышающей регуляции индуцированных TAGLN и TAGLN ММР-2 производство.
Ключевые слова
TAGLN Фибробласт опухолевого микроокружения метастазирование карциномы желудка Фон
карциномы желудка является второй наиболее распространенной причиной смертности от онкологических заболеваний в мире, особенно в Азии [1, 2]. Большинство больных раком желудка умер от рецидива опухоли, вызванной отдаленными метастазами. Метастазы представляет собой многоступенчатый процесс, с помощью которого раковые клетки распространения от первичной опухоли и вторгнуться в окружающие ткани и органы расстояния, с участием раковых клеток моторику, intravasation, транзит в крови или лимфы и экстравазации [3]. Этот процесс зависит плотно от окружающей микросреды и развитие опухоли опирается на непрерывной перекрестных помех между раковыми клетками и внеклеточной микросреде [4].
Transgelin (TAGLN, также известный как SM22) является актин сшивающий белок, который участвует во взаимодействиях кальция и регулирует сократительные свойства [5]. Он может играть определенную роль в дифференциации клеток, инвазию клеточную миграцию клеток и матрицы ремоделирования путем стабилизации цитоскелета через актина связывания [6, 7]. Избыточная экспрессия белка TAGLN наблюдается в карцином желудка, печени и пищевода, в то время как пониженные уровни мРНК TAGLN наблюдались в груди и раковых клеток толстой кишки линий и первичных опухолей [8].
Принято считать, что опухоль -stroma взаимодействия играют важную роль в развитии и прогрессии опухоли. Строма состоит в основном из внеклеточного матрикса (ЕСМ) и клеточных элементов, таких, как фибробласты [9, 10]. Клеточные компоненты стромы хорошо признаны как имеющие вспомогательную роль в канцерогенезе [11, 12]. Эти стромальные элементы действуют в синергетической перекрестного разговора с раковыми клетками из первичных сайтов для поддержания роста и метастазирование раковых [13, 14]. Строма опухоли, которая называется "реактивной стромы" связан с увеличенным количеством фибробластов с повышенной плотностью капилляров и отложением нового ECM, богатого типа-1-коллагена и фибрина [15]. Накопленные данные показывают, что стромальные клетки, такие как фибробласты, более глубокое влияние на развитие и прогрессирование рака, чем было ранее оценено [15-17].
Фибробласты хорошо известно, играет роль в онкогенеза и прогрессии. Фибробласты выразить виментин, фибронектин, α-гладкая-актин (α-SMA), поверхностный белок фибробластов, а также фибробластическая маркеры. Карциномные-ассоциированные фибробласты (CAFS) активируются фибробласты, биологически отличаются от фибробластов, присутствующих в доброкачественных микросреды в нескольких важных аспектах [17, 18]. CAFS не являются пассивными наблюдателями в онкогенеза и метастазирования, но активно участвовать в этих процессах [19]. Наши знания о роли отдыхавших и активированных фибробластов при раке все еще развивается. Здесь, мы обратили внимание на взаимодействие между раковыми клетками и их микросреды, чтобы изучить, как фибробласты, выделенные из желудка карциномы человека облегчить туморогенез.
Результаты
экспрессии TAGLN усиливает свою активность в карциномы желудка ассоциированных с фибробластами
карциномы -associated фибробласты (CAFS), параллельные фибробласты (РПС) и нормальные фибробласты (Nfs) были получены из культуры первичной ткани с использованием тканей от рака ассоциированных регионов, нераковых-ассоциированной стромы и нормальной слизистой соответственно. Затем мы проверили чистоту различных популяций фибробластами иммунным окрашиванием. Эти популяции фибробластов выражали высокие levls из фибробластовых маркеров, таких как виментину, a-SMA и фибронектина. С другой стороны, эти клетки не экспрессировали эпителиальные маркеры, такие как цитокератин (рисунок 1А). Эти данные подтвердили чистоту fiborblasts. Эти наблюдения показывают, что культуральные клетки были преимущественно фибробласты были подготовлены с минимальным загрязнением другими клетками. Рисунок 1 экспрессии TAGLN активируется в рака желудка ассоциированных с фибробластами. A: характеристика желудочных фибробластов (МКК). a1: виментин, положительный. a2: α-SMA, положительный. a3: фибронектин, положительный. a4: цитокератин, отрицательный. Оригинальные увеличениях: × 200. Шкала баров, 100 мкм. B: QRT-PCR анализ TAGLN в CAF, СПЛ и NF. *, P &
л; 0,05, ** P &
л; 0,01, по сравнению с NF. C: Вестерн-блот анализ TAGLN в CAF, СПЛ и NF, уровень экспрессии TAGLN уменьшалась последовательно. D: кривая роста фибробластов определяли с помощью ССК-8 анализа, CAFS вырос quickier, чем другие. E: CAF имели более высокую способность усиливать способность миграции MKN-45, чем СПЛ и NF, ***, P &
л; 0,001 по сравнению с MKN-45. F: CAF имели более высокую способность усиливать способность вторжения MKN-45, чем СПЛ и NF, *, P &
л; 0,05, ** P &
л; 0,01, по сравнению с MKN-45.
МРНК и уровни протеина TAGLN были ниже в РПС и Федерациями по сравнению с CAFS (рис 1B и C). Мы впервые показали, что CAFS выросли значительно больше, чем РПС и NFs пролиферации клеток пробирке (рис 1D). Затем мы провели вторжение и миграции клеток анализа, чтобы проверить, является ли вторжение и миграция способность клеток рака желудка будет повышена фибробластами. Эксперимент был разработан, чтобы исследовать влияние стромы TAGLN, который был секретируемый фибробластами, на клеток рака желудка человека. Внутренние уровни TAGLN в клеток рака желудка могут помешать экспериментальный процесс. Следовательно, мы выбранные клеточной линии MKN-45, так как его уровень экспрессии TAGLN был самым низким в семи желудочных линий раковых клеток (SNU-1, AGS, NCI-N87, KATOIII, MKN-45, MKN-28 и SGC-7901; данные не показано). Интересно, что вторжение и миграция способность MKN-45 увеличилась во всех трех группах (CAFS, РПС и Nfs), и больше всего выросло в группе с CAF (рис 1E и F). Приобретение миграции и инвазивного поведения является одним из шагов в метастатического процесса.
CAFS способствуют метастазирование опухоли через повышающей регуляции TAGLN
Для изучения влияния TAGLN в fibrobalsts, мы использовали RNAi, чтобы сбить выражение TAGLN. CAFS, РПС и НФ трансфицировали TAGLN конкретным или не молчаливого миРНК. РНК и белка были получены в 24, 48 или 72 ч после трансфекции TAGLN мРНК и уровни белка были исследованы с помощью QRT-PCR и Вестерн-блоттинга. TAGLN мРНК и белка были значительно ингибируется в клетках, обработанных TAGLN специфических миРНК (фиг.2А и В). Рисунок 2 CAFS повышения опухолевых клеток линии MKN-45 migraton и вторжения через активируемых TAGLN. A: выражение TAGLN с помощью анализа QRT-PCR после миРНК нокдауна в фибробласты. B: выражение TAGLN с помощью Вестерн-блот-анализа после миРНК нокдауна в фибробласты. Анализ клеточной миграции в пробирке (фибробласты с или без TAGLN миРНК помех): C. Анализ клеток вторжения в пробирке (фибробласты с или без TAGLN миРНК помех): D. Значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение по меньшей мере из трех отдельных экспериментов, каждый проводится в трех экземплярах. *, P &
л; 0,05, ** P &
л; 0,01, ***, P &
л; 0,001, по одну сторону дисперсионного анализа (ANOVA).
Далее мы исследовали, может ли вторжение и миграция способность клеток рака желудка будет усилено за счет экспрессии TAGLN в фибробласты, мы провели вторжение и миграции клеток в пробирке анализа , Фибробласты и MKN-45 не являлись contactedly сокультивируют. Интересно, что вторжение и миграция способность MKN-45 сразу уменьшилось в группе с CAFS и незначительно снизилась в группе с РПС и НФ. Результаты показали, что вторжение и миграция способность MKN-45 может уменьшиться через вниз-регулируя экспрессию TAGLN (рис 2C и D).
Для оценки вклада CAFS-TAGLN к метастазирования опухолей в естественных условиях, мы emplyed модель ксенотрансплантата. Мы смешали TAGLN миРНК CAFS, не являющихся притихли CAFS, CPFs и НФ с MKN-45 человека клеток рака желудка в соотношении 2: 1 или MKN-45 в одиночку и прививали эти клетки через хвостовую внутривенной инъекции в иммунодефицитных голых мышей. Через 6 недель, MKN-45 смешивают с CAFS генерируется более легких метастатических узелков, чем MKN-45 смешивают с TAGLN миРНК CAFS, РПС и NFs, похожий на MKN-45 смешивают с не-молчания миРНК CAFS (таблица 1). Эти данные свидетельствуют о том, что CAFS показывают повышенную способность стимулировать метастаз опухоли (фиг.3А и В). Все наблюдения показали, что в присутствии CAFS, опухоли стали более агрессивными, предполагая, что CAFS может играть роль в развитии метастазов при раке желудка. Рисунок 3 TAGLN усиливает метастазирование опухоли через человека модели опухоли ксенотрансплантата в естественных условиях. A: голых мышей метастатических узелков в легких. a1: легочные метастатические узелки из Томур фертильного мыши. Стрелка: метастатический узелок. a2: нет метастатическим узелок в легких. a3: H &Amp; E окрашивание для легкого метастатическим желвака под ярко-поле микроскопа. Шкала баров, 200 мкм. a4: H &Amp; E окрашивание для легкого без метастатического желвака под ярко-поле микроскопа. Шкала баров, 200 мкм. Б: определение количества голых мышах легких метастатических узелков в различных группах, через хвостовую внутривенной инъекции. *, P &
л; 0.05, с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA).
Таблица 1 безволосых мышей легких метастатических узелков в различных группах через хвостовую внутривенной инъекции (Каждая группа содержала 6 мышей)
групп

TAGLN миРНК CAF -MKN45

без молчания миРНК CAF-MKN45

CAF-MKN45

CPF-MKN45

NF-MKN45

MKN45 в одиночку

Количество мышей с опухолями
2 страница 5 из 5 страница 3 2 страница 2 Количество метастатических узелков страница 2 10
9 страница 5 3 страница 2 TAGLN способствует метастазирование опухоли путем повышающей регуляции ММР-2
Многие исследования были сосредоточены на роли матричных металлопротеиназ (ММР) до вторжения окружающих соединительной ткани и метастазирование опухолевых клеток из первичного очага в отдаленные участки в прогрессии опухоли [20, 21]. В нашей предыдущей работе мы исследовали ММР-1, ММР-2, ММР-3, MMP-7 и-ПММ 9 уровней после TAGLN нокдауна по миРНК через ELISA, только ММР-2 уровень был значительно понижающей регуляции, другие ММР уровни не показали никаких изменений. Следовательно, мы focued на ММР-2 в данном исследовании. Как показано на фиг.4А, по сравнению с MKN-45 совместно с CAF coultured /нег и CAF /поругание уровни ММР-2 в надосадочной жидкости из MKN-45 культивировали совместно с CAF /siTAGLN были значительно подавлены. Далее мы исследовали активность ММР-2 с использованием желатина зимографии анализа. Мы обнаружили, ММР-2 активность резко тормозится в надосадочной жидкости из MKN-45 культивировали совместно с CAF /siTAGLN, чем с CAF /нег и CAF /Мок (рис 4б). Таким образом, TAGLN может усиливать метастазирование опухоли через ММР-2 ферменты ухудшают базальные мембраны (например, коллаген IV). Рисунок 4 TAGLN усиливает метастазирование опухоли путем повышающей регуляции ММР-2. A: экспрессия ММР-2 в CAF decresed, очевидно, после того, как TAGLN RNAi с помощью ELISA. *, P &
л; 0,05 с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA). Столбики ошибок показывают стандартную ошибку вокруг среднего значения. B:. Нокдаун TAGLN нарушена способность CAF к секретным ММР-2 с помощью желатиновой зимографии
выражение TAGLN при раке желудка человека и его связь с дифференциацией в больных раком желудка
Чтобы оценить экспрессию TAGLN при раке желудка, TAGLN иммунное в 98 были исследованы первичные раковые ткани желудка. TAGLN экспрессия усиливается в желудка человека стромы рака по сравнению с нормальной желудочной ткани (рис 5A: нормальная желудочная ткани; Рисунок 5B: желудка раковой ткани). Корреляция экспрессии TAGLN с клинико-патологическими особенностями было показано в таблице 2. Уровни TAGLN были выше в недифференцированных опухолей (слабо дифференцированной аденокарциномы, карциномы перстневидно клеток и муцинозных карцином), чем в дифференцированных из них (ну и умеренных adnocarcinomas) (P <бр> = 0,003). Кроме того, уровни TAGLN коррелировала с метастазов в лимфатических узлах (P = 0,029
). Там не было никаких существенных различий в экспрессии опухолевых TAGLN в соответствии с другими клинико-патологическими особенностями, такими как пол, возраст, размер опухоли, классификации Lauren, Т стадии, расстояние метастазирования и стадии TNM (P ≥ 0,05 изображения). Рисунок 5 Выражение TAGLN в желудочном раковых тканей человека. A: уровень экспрессии TAGLN в нормальной желудочной ткани с помощью IHC. Шкала баров, 100 мкм. B: TAGLN избыточно экспрессируется в строме рака желудка человека с помощью IHC. Шкала баров, 100 мкм. C: TAGLN мРНК усиливается в рака желудка человека анализировали с помощью QRT-PCR. D: TAGLN белок усиливает свою активность при раке желудка человека анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. Значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение по меньшей мере из трех отдельных экспериментов, каждый проводится в трех экземплярах. *, P &
л; 0,001 по paried-образцов Т
тест.
Таблица 2 клинико-патологическими ассоциации экспрессии TAGLN при раке желудка

Число случаев

TAGLN иммунным

P <бр>
Слабый (+)

Strong (++)

Пол
0,778
Мале
60
27
33
Женский
38
16
22
Возраст
0,739
≤60y
46
21
25
&GТ; 60y
52
22
30 размер
Опухоль
0,852
≤5 см
58
25
33
&К раствору 5 см
40
18
22
Дифференциация
0,003
Колодец + Умеренная
46
13
33
Бедной
52
30
22
Лорен классификации <бр> 0,059
Кишечные
40
13
27
Диффузный
58
30
28
T этап
0,142
T1 + T2
56
21
35
T3 + T4
узел метастазирование 42
22
20
лимфа
0,029
n0
27
11
16
N1
32
15
17
N2
26
7
19
N3
13
10
3
Отдаленные метастазы
0,709
Без
95
42
53 с услугой страница 3 1 страница 2 TNM стадии
0,722
I
20
7
13
II
25
11
14
III
30
10
20
IV
23
15
8
Кроме того, мы использовали QRT-PCR и Вестерн-блоттинга для оценки экспрессии TAGLN в желудочном раковых тканей (рис 5С и D). Эти результаты свидетельствуют о том, что экспрессия TAGLN в желудочном раковых тканях была значительно выше при раке желудка, чем в парных нормальных тканях.
Обсуждение
Накопленные данные показывают, что инициирование рака и прогрессии включают взаимодействие между опухолью и как стромальных клеток. Опухолевые клетки могут активно набирать стромальные клетки, такие как клетки сосудов, гладкомышечные клетки и фибробласты, в опухоль, тем самым генерируя микросреды для стимулирования роста опухоли [16, 22, 23]. Фибробласты часто составляют большинство стромальных клеток в раке желудка, но функциональный вклад этих клеток к онкогенеза и метастазирования опухоли остаются плохо понятыми.
TAGLN является одним из самых ранних маркеров дифференцировки гладких мышц во время эмбриогенеза [24], и предыдущие исследования, связанные с TAGLN в основном сосредоточены на гладких мышечных клеток [25]. Патологические состояния, сопровождающиеся с ремоделирование тканей и фиброгенеза, такие как заживление ран и опухолевых поражений, характеризуются появлением стромальных клеток с ультраструктурных особенностей промежуточными между свойствами типичных фибробластов и тех гладкомышечных клеток. Эти фибробласты демонстрируют фенотипические и функциональные особенности клеток гладких мышц и, следовательно, названы миофибробласты [26], такие как CAFS. В нашем исследовании, TAGLN избыточная экспрессия наблюдалась также в CAFS. Сообщается, что белок TAGLN избыточно экспрессируется при раке желудка, когда экспрессия белка спектр рака желудка анализировали с использованием двумерного гель-электрофореза (2-DE) [27]. Кроме того, белок TAGLN является одним из двух ассоциированных с опухолью антигенов, которые были идентифицированы в сыворотке больных раком почки с помощью Klade с использованием 2-DE [28]. Эти отчеты согласуются с результатами, которые мы наблюдали с помощью ПЦР в реальном времени и Вестерн-блот. Интересно, что мы обнаружили, что TAGLN в основном обнаружен в фибробластах, полученных из опухоли стромы, а не в опухолевых клетках. Кроме того, другие исследователи обнаружили, что TAGLN не экспрессируется в злокачественных клетках, но в мезенхимальных клетках опухоли стромы [27].
Стромальные фибробласты регулируют эндотелиальные или эпителиальные поведение клеток с помощью прямых и косвенных взаимодействий клеток CEL1. Активация хозяина stroma1 микросреды, как полагают, является важным шагом в росте опухоли и прогрессирования [13, 29]. Белки, секретируемые стромальной клетки в опухоли могут положительно или отрицательно влияют на развитие опухоли. Наиболее заметные действия TAGLN могут способствовать моторику опухолевых клеток и инвазию [7, 30, 31]. Мы обнаружили, что TAGLN была значительно увеличена в метастазов в лимфатических узлах группы лимфатических узлов, чем отрицательной группы. Для того, чтобы c1arify роль TAGLN в стромальных фибробластов при желудочном онкогенеза и метастазирования рака, мы притихли выражение TAGLN в человеческих CAFS. Было отмечено, что только MKN-45 культивировали совместно с CAFS, выражающих высокий уровень TAGLN обладают гораздо более высокой инвазии и миграции способность. Фибробласты, который TAGLN был сбит вниз не показывать эту функцию. Взятые вместе, мы полагаем, что TAGLN может нести ответственность за усиление желудочной метастазирования раковых клеток с помощью стромальных клеток, таких как CAFS. Выражение
TAGLN значительно увеличивается в желудочном CAFS. CAFS с повышенными уровнями экспрессии TAGLN может увеличить инвазию опухолевых клеток и миграции способности, которые способствуют повышенную экспрессию ММР-2. Стимуляция экспрессии ММР в фибробластах либо после того, как непосредственный контакт с опухолевыми клетками или после контакта с опухолевых клеток, полученных из растворимых факторов опухолей, происходящих из эпителиальных клеток, как было показано в ряде работ [32-35]. Поэтому Разъяснение основные механизмы могут ослабить рецидива опухоли и метастазов в больных раком желудка.
Выводы
В целом, наше исследование показывает, что CAFS может способствовать желудочный миграции раковых клеток и инвазии за счет увеличения производства MMP-2, вызванное TAGLN повышающей регуляцией .
Методы
образцы тканей
в общей сложности 40 пар раковых тканей и соответствующие нормальной слизистой оболочке для QRT-PCR и Вестерн-блоттинга и 98 первичных рака желудка для иммуноокрашиванием были собраны из удаленного хирургическим путем рака желудка диагностируется в Департаменте хирургии, Жуйцзинь больницы, Shanghai Jiao Tong University школы медицины. Нормальные образцы слизистой оболочки были взяты из края резекции, где опухоли, расположенной по крайней мере, более чем на 6 см друг от друга от нее. Этот протокол исследования был одобрен независимой комиссией по этике Жуйцзинь больницы, Шанхайский университет, факультет медицины. Информированное согласие было написано. Все образцы замораживали в жидком азоте в течение ночи и хранили при -80 ° С перед использованием. 4% формальдегиде фиксированных срезов ткани как опухоли и слизистых оболочек окрашивали H &Amp; E и исследовали и проверены гистопатологически двумя патологоанатомов. Каждый образец был приписан диагноз и забил Лорен классификации, дифференциации, стадии pTNM. Размер опухоли, местоположение и другие клинические патологические характеристики были получены из клинических записей с разрешения пациента
Клеточные линии
Желудочный линий раковых клеток СНУ-1 (АТСС: CRL-5971)., AGS (АТСС: CRL-1739), NCI-N87 (АТСС: CRL-5822) и KATOIII (АТСС: HTB-103) были получены из американской коллекции типовых культур (Manassas, VA, USA). Еще 3 желудка клеточные линии рака, MKN-45, MKN-28 и ЮГК-7901, были сохранены в нашем институте. Все клеточные линии поддерживали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
Антитела
Первичные антитела, используемые для окрашивания включали человека специфических анти-виментин (Abcam, Кембридж, Великобритания), анти-фибронектин ( Abcam, Кембридж, Великобритания), анти-α-гладкомышечное актина (Sigma Chemical, Сент-Луис, штат Миссури, США), анти-пан-цитокератин (Abcam, Кембридж, Великобритания), анти-SM22 (Abcam, Кембридж, Великобритания) и мышь анти-GAPDH (Kangchen, Китай).
Выделение желудочного фибробластов человека
фибробласты выделяли из и железы с нераковых ассоциированных областей желудка тканей расчлененный от больных раком желудка во время радикальной резекции желудка с Департамент хирургии, Жуйцзинь больницы, Shanghai Jiao Tong University Школа Medcine. Раковые ассоциированные области были выбраны, чтобы быть минимально некротические участки опухолевой массы. Нераковых-ассоциированной стромы, который был выделен из ткани, по меньшей мере 2 см дистальнее наружного края массы рака. Нормальные образцы слизистой оболочки были взяты из края резекции, где опухоли, расположенной по крайней мере, более чем на 6 см друг от друга от нее. Ткани измельчали ​​в органоидам приблизительно 1 мм 3 и высевают на непокрытой пластичного материала в среде RPMI 1640, содержащей основной фактор роста фибробластов человека, 20% фетальной сыворотки теленка (FCS) и пенициллин и стрептомицин в качестве антибиотиков. Эти условия производства гомогенной популяции клеток фибробластов после 7 дней культивирования. Каждый фибробласты затем расширен в соотношении 1: 3 по трипсин-ЭДТА в 10 см чашки Петри. Мы использовали фибробласты пассировать до 8 удвоений клеточной популяции (PDS) для последующих экспериментов, с целью минимизации клональной селекции и культура стресс, который может произойти во время длительного культивирования тканей.
Иммуногистохимического окрашивания (IHC)
клетки или ткани фиксировали в течение 30 мин с 4% -ным формалином и промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). После того, как эндогенная активность пероксидазы гасили 0,3% Н <суб> 2O <суб> 2, клетки были блокированы с нормальной неиммунной сывороткой в ​​течение 30 мин до того, инкубировали с первичным антителом при 37 ° С в течение 2 часов. Клетки или ткани были затем метили стрептавидин-биотин-пероксидаза хрена окрашивания комплект (Dako, Carpinteria, CA, США). Присутствие меченого пероксидазой на секциях визуализировали путем инкубации с 3,3 '- диаминобензидин, ДАБ + хромоген субстрат и срезы подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином. Негативные контрольные слайды были выполнены пропуском первичного антитела.
Выражение TAGLN оценивали по интенсивности окрашенных клеток, и определяли в двух категориях (слабый положительный и сильный положительный). Интенсивность окрашивания была классифицирована по четырем сортах (партитур интенсивность): нет окрашивания (класса 0), светло-коричневого окрашивания (1-й класс), коричневый цвет окрашивания (класс 2), и темно-коричневого окрашивания (3-й степени). Оценка 0 и 1-й степени был определен как слабый положительный, класс 2 и класс 3, были определены как сильный положительный.
Количественная ПЦР в реальном времени (QRT-ПЦР)
Суммарную РНК экстрагировали с использованием реагента тризола (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. кДНК получали с 1 мкг РНК с помощью обратной транскрипцией System Kit (Promega, Madison, WI, USA) и QRT-ПЦР проводили с помощью набора реагентов для ядра SYBR Green PCR (Applied Biosystems, Warrington, UK). Праймеры, специфичные для TAGLN распределились следующим образом: 5 '- GAGCAAGCTGGTGAACAGCC-3 ' (верхняя часть), 5 '- GACCATGGAGGGTGGGT TCT-3 ' (ниже). Glyceral-вого альдегида-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) использовали в качестве эндогенного ссылки. Его последовательности были 5 '- GGACCTGACCTGCCGTCT AG-3 ' (верхняя часть), 5 '- GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 ' (ниже). QRT-ПЦР для количественного определения уровней мРНК TAGLN было сделано на ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, США). Данные были проанализированы с использованием сравнительного метода Ct. Специфичность полученных ПЦР-продуктов была подтверждена кривые плавления.
Вестерн-блот
Клетки собирали и подвергали лизису с реагентом для экстракции белка млекопитающего (Pierce, Rockford, IL, USA). Концентрации белка определяли с помощью бицинхониновой кислоты (ВСА) набора для анализа белка (Pierce, Rockford, IL, США). Пробы, содержащие 50 мкг общего белка наносили на каждую дорожку 12% -ном акриламидом в минигелей аппарат (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Разделенные белки переносили на поливинилиденфторид (ПВДФ) мембрану (Bio-Rad, Richmond, CA, США). После инкубации с первичными антителами (1: 1000) и HRP-конъюгированного вторичного антитела (1: 5000). Соответственно, иммунные комплексы были обнаружены с помощью усиленной хемилюминесцентной системы (ECL) (Millipore, Bedford, MA, USA)
Фермент -связанной иммуноферментный анализ (ELISA),
уровни белка ММР-2 в супернатантах измеряли с помощью набора ELISA (R &Amp; D Systems, Inc, Миннеаполис, штат Миннесота, США) в соответствии с инструкциями производителя
роста клеток. анализ
различных групп клеток (1 × 10 3) были посеяны в 96-луночные планшеты в трех экземплярах. Число жизнеспособных клеток определяли ежедневно с использованием клеточной счетная Kit (CCK-8) за счет использования хорошо растворимых в воде соли тетразолия WST-8 [2- (2-метокси-4- нитрофенил) -3- (4-нитрофенил) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-тетразолия, мононатриевой соли] (Dojindo, Япония). Вкратце, 20 мкл CCK-8 раствора добавляют в пластины, оптическая плотность при 450 нм измеряли через 4 часа инкубации.
Оценка опухолевой инвазии и миграции
Опухоли вторжения и анализа миграции были выполнены с комплектом инвазии QCMTM24-луночного (Millipore, Bedford, MA, США) и QCMTM24-луночного комплект миграции (Millipore, Bedford, MA, США) в соответствии с протоколом, предоставленного производителем, соответственно. Добавить подготовленный MKN-45 клеточной суспензии (2 × 10 5 клеток /лунку) в верхнюю камеру и добавить предварительно приостановлено фибробласты (5 × 10 4 клеток /лунку в среде RPMI 1640, содержащей 20% FBS) до нижняя палата. TAGLN некоторых фибробластов в нижних камерах подавлялось с помощью миРНК через 24 часа. MKN-45 и фибробласты культивировали без contactedly в течение 48 ч, затем lysised клеток и определяют значения блоков СВЧ с флуоресцентном счетчике планшета с использованием 480/520 нм набора фильтров.
TAGLN Серна
использовали программное обеспечение Qiagen проектировать RNAi последовательности с таргетингом человека TAGLN (присоединение нет NM_003186.), а последовательность миРНК с самой высокой предполагаемой эффективности (смысл: 5 '- AAAUCGAGAAGAAGUAUGAdtdt-3 ', антисмысловой: 5 '- UCAUAC UUCUUCUCGAUUUdtdt -3 ') был синтезирован Shanghai GeneChem Co, Ltd. миРНК с рандомизированном последовательностью (смысл: 5 ' - UUCUCCGAACGUGUCACG УТТ-3 ', антисмысловая: 5 ' - ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 ') против нет гена (закодированная миРНК группа) трансфицировали в качестве внутреннего контроля. Для экспериментов клетки трансфицировали ДОТАП липосомальный трансфекция реагента (Roche, Германия). Клетки высевали при 2 × 10 5 клеток /лунку в 6-луночные планшеты. Через 24 ч, когда клетки находились в фазе роста журнала, 250 мкл Opti-MEM I смешивали с 5 мкл 20 мкМ киРНК дуплекса, в то время как еще 250 мкл OPTI-MEM I был отдельно инкубировали с 11,88 мкл DOTAP липосом. Эти две смеси осторожно перемешивают и инкубируют в течение примерно 30 мин при комнатной температуре. Для трансфекции, всю смесь добавляли в каждую лунку в 1,5 мл свежей среды без антибиотиков. Окончательный трансфицировали концентрация миРНК составляла 20 нМ. Клетки собирали для дальнейшего анализа на 24, 48 и 72 часов после трансфекции.
Желатин зимографии
Супернатанты культур собирали через 24 ч и смешивают с буфером для образца гель (0,5 М Трис-HCl, глицерин, 10% додецилсульфата натрия [SDS], β-меркаптоэтанола, и 0,5% бромфенол синий). Десять микрограммов белка были взяты путем разделения SDS-PAGE; в SDS-PAGE гели содержали 0,1% желатина (Sigma Chemical, Сент-Луис, штат Миссури, США). После электрофореза гели промывали в 50 мМ Трис-буфере, содержащем 2,5% Тритон Х-100. Гели инкубировали еще в течение 24 ч в инкубационной жидкости (50 мМ Трис-буфере [рН 7,6], 10 мМ CaCl <суб> 2, и 200 мМ NaCl). Гели окрашивали 0,5% кумасси синий, белый полос (72 кДа) на голубом фоне указаны зоны пищеварения, соответствующие наличию ММР-2.
Мышиная модель
Женский BALB /C Nu /Nu
голых мышей, возраст подобранная между 4-5 недель (институт зоологии Академии наук Китая), были размещены в определенном патогена среде в лаборатории группы животных, Shanghai Jiao Tong University школы медицины, Китай. Фибробласты и MKN-45 были смешаны в соотношении 1: 4 в 0,1 мл PBS, и вводили в боковую хвостовую вену. Шесть мышей были включены в каждой группе во всех экспериментах, и каждый эксперимент проводили дважды. Животные были умерщвлены и метастатических узелков легких регистрировали через 6 недель после имплантации опухолевых клеток. Образцы Опухолевые собирали, смешивали в формалине, заливали в парафин и подвергали H &Amp; E окрашивание. P
&л; Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Совместное появление множественных инфарктов мозга вследствие гиперкоагуляции, связанного с злокачественн…
• Снижает ли желудка тонометрию наведением терапии общей смертности больных в критическом состоянии?