Strome fibroblasti u mikro želučanog karcinoma promovirati metastaziranje tumora putem regulirajući TAGLN expression

strome fibroblaste u mikro želučanog karcinoma promovirati metastaziranje tumora putem regulirajući izraz TAGLN pregled apstraktne pregled pozadine pregled Fibroblasti igraju ključnu ulogu u nastanku tumora, tumora napredovanje i metastaza. Međutim, njihova detaljna molekularna svojstva i klinički značaj i dalje nedostižan. TAGLN je aktin-vezujući protein koji igra važnu ulogu u nastanku tumora. | Rezultati pregled smo istraživali interakcije između stanica raka i mikro tumora kako bi se utvrdilo kako su fibroblasti iz ljudskog želuca karcinoma olakšati tumorigenezi kroz TAGLN. QRT-PCR i Western blot pokazali da TAGLN ekspresija reguliran u fibroblastima želučanom karcinoma povezanih s (CAFs) koji potiču migraciju stanica raka želuca i invaziju. Koristeći mali ometa RNA (siRNA), otkrili smo da CAFs pojačan tumorskih metastaza kroz regulira prema gore TAGLN in vitro i in vivo. Izraz matrične metaloproteinaze-2 (MMP-2) bio je značajno niži nakon TAGLN knock-down by siRNA. Razine TAGLN su povišene u ljudskom želuca stromi karcinoma od normalne želuca strome i povezana s diferencijacijom i limfnih čvorova metastaza raka želuca. pregled Zaključak pregled CAFs može promovirati želučane migraciju stanica raka i invaziju preko regulirajući TAGLN i TAGLN izazvana MMP-2 proizvodnja. pregled Ključne riječi pregled TAGLN fibroblasta mikro okolinu metastaze tumora Pozadina Želučani karcinom pregled želučani karcinom je drugi najčešći uzrok smrti od raka povezanih u svijetu, posebno u Aziji [1, 2]. Većina pacijenata s rakom želuca umro od tumora recidiva uzrokovane udaljenih metastaza. Metastaza je višestupanjski postupak u kojem se stanice raka šire iz primarne neoplazme i upasti okolno tkivo i udaljenost organe, uključujući rak stanični motilitet, intravasation, tranzit u krvi ili limfe i izljeva [3]. Taj postupak čvrsto zavisi okolni mikrookolišu i razvoja tumora ovisi o kontinuiranom interferencija između stanica i ekstracelularnog mikrookoliša [4].
Transgelin (TAGLN, također poznat kao SM22) je aktinske umreživanje protein koji je uključen kalcijem interakcija i regulira kontraktilni svojstva [5]. To može imati ulogu u staničnoj diferencijaciji, invazije stanične migracije stanica i matriksa stabiliziranjem citoskeleta kroz aktin vezanja [6, 7]. Prekomjerna ekspresija TAGLN proteina je zapažena u karcinomima želuca, jetre i jednjaka, a smanjena razina TAGLN mRNA zabilježene su u rak debelog crijeva stanica dojke i linije i primarnih tumora, [8].
Općenito je prihvaćeno da je tumor -stroma interakcije imaju važnu ulogu u razvoju tumora i napredovanja. Strome je sastavljen uglavnom od izvanstaničnog matriksa (ECM) i staničnih elemenata, kao što su fibroblasti [9, 10]. Stanični komponente stromi su dobro prepoznali kao da ima podršku ulogu u procesu karcinogeneze [11, 12]. Ove strome elementi djeluju na sinergistički interferencija sa stanicama raka iz primarnih stranicama održati rast i metastaziranja raka [13, 14]. Tumor stroma koja se naziva kao "reaktivni strome" je povezan s povećanim brojem fibroblasta, pojačane gustoće kapilara i odlaganja novog ECM bogatog tipa-1-kolagen i fibrin [15]. Prikupljeni dokazi pokazuju da stanice strome, kao što su fibroblasti imaju više dubok utjecaj na razvoj i progresiju karcinoma nego što se ranije cijenio [15-17].
Fibroblasti su poznati da igraju ulogu u nastanku tumora i napredovanje. Fibroblasti izraziti vimentin, fibronektina, α-glatkih mišića aktin (α-SMA), površinski protein fibroblasta kao i fibroblastičnom markeri. Karcinom povezane fibroblasti (CAFs) aktiviraju fibroblaste, biološki razlikuju od fibroblasta prisutnih u benignim mikrookoliša u nekoliko važnih aspekata [17, 18]. CAFs nisu pasivni promatrači u tumorigenezi i metastaza, nego aktivno sudjelovati u tim procesima [19]. Naše znanje o ulozi odmaraju i aktiviranih fibroblaste na rak još uvijek razvija. Ovdje ćemo se usredotočiti na interakciji između stanica raka i njihovih mikrookoliša za proučavanje kako se fibroblasti izolirane iz ljudskog želučanog karcinoma olakšati tumorigenezi. Pregled Rezultati
izražavanja TAGLN je reguliran u fibroblasta želučanog karcinoma povezanih s
karcinom -associated fibroblasti (CAFs), kolega fibroblasti (CPFs) i normalni fibroblasti (NFS) dobivene su iz kulture tkiva primarnog upotrebom tkiva iz rakom regije nisu povezane s rakom strome i normalne sluznice, respektivno. Zatim smo potvrdili čistoću različitih fibroblasta populacija od imunološko. Ove fibroblasti populacije izrazio visoke levls fibroblastične markera kao što su vimentin, a-SMA i fibronektina. S druge pak strane, stanice ne eksprimiraju epitelne biljega, poput citokeratin (Slika 1A). Ovi podaci potvrdili čistoću fiborblasts. Ta opažanja ukazuju na to da su stanice kulture su uglavnom fibroblasti bili pripremljeni s minimalnom onečišćenja ostalih stanica. Slika 1 Ekspresija TAGLN je reguliran u rak želuca povezane fibroblasta. A: karakterizacija želučanih fibroblasta (ICC). A1: vimentin, pozitivno. A2: α-SMA, pozitivno. A3: fibronektina, pozitivno. A4: keratin, negativan. Izvorni uvećanja: × 200. Mjerila, 100 uM. B: QRT-PCR analiza TAGLN u OS RH, HFP i NF. *, P izvoznici < 0,05, ** p izvoznici < 0,01, u usporedbi s NF. C: Western blot analiza TAGLN u OS RH, HFP i NF, razina TAGLN izraz bio smanjen sukcesivno. D: fibroblasti krivulja rasta su određena CCK-8 testu, CAFs rastao quickier od ostalih. E: CAF imao veću mogućnost za poboljšanje MKN-45 je migracijsku sposobnost od HFP-a i NF, *** P izvoznici < 0.001 u odnosu na MKN-45. F: CAF imao veću mogućnost za poboljšanje MKN-45 invazije sposobnost od HFP-a i NF, *, P izvoznici < 0,05, ** p izvoznici < 0,01, u usporedbi s MKN-45.
MRNA i razina proteina u TAGLN bile su niže u CPFs i NFS usporedbi s CAFs (Slika 1B i C). Mi smo prvi put pokazali da CAFs porastao znatno više od CPFs i NFS u proliferaciji vitro stanica (Slika 1D). Dalje, proveli smo staničnu invaziju i migraciju testa za testiranje da li invazija i migracija mogućnost želučanih stanica raka bi se povećati fibroblaste. Pokus je oblikovani tako da ispitaju učinak strome TAGLN, koji je luče fibroblasti, na stanice ljudskog raka želuca. Unutarnje razine TAGLN u želučanih stanica raka može smetati eksperimentalni postupak. Dakle, choosed smo MKN-45 stanične linije, jer je njegova razina TAGLN izraz lica bio je najniži u sedam želučanih staničnim linijama karcinoma (SNU-1, AGS, NCI-N87, KATOIII, MKN-45, MKN-28 i SGC-7901; podatke nisu prikazani). Zanimljivo je da je invazija i migracija sposobnost MKN-45 porasla u sve tri skupine (CAFs, CPFs i NFS), a porastao najviše u skupini s OS RH (Slika 1E i F). Stjecanje migracije i invazivno ponašanje je jedan od koraka u metastatskog procesa. Pregled CAFs promovirati metastaziranje tumora kroz regulirajući TAGLN
Ispitati učinak TAGLN u fibrobalsts, koristili smo RNAi srušiti izraz TAGLN. CAFs, CPFs i NFS su transficirane TAGLN specifične ili ne-šutnja siRNA. RNA i proteina dobivene su na 24, 48 ili 72 sata nakon transfekcije, TAGLN mRNA i proteina ispitano je QRT-PCR i Western blot. TAGLN mRNA i protein su značajno inhibirane u stanicama tretiranim TAGLN specifične siRNA (slika 2a i B). Slika 2 CAFs poboljšanje linije tumorskih stanica MKN-45 migraton i invaziju kroz regulira prema gore TAGLN. A: TAGLN ekspresijom QRT-PCR analize nakon siRNA obaranje u fibroblaste. B: TAGLN ekspresije Western blot analizom nakon siRNA obaranje na fibroblaste. stanične migracije in vitro (fibroblasti, sa ili bez TAGLN siRNA smetnji): C. Test stanica invazija in vitro (fibroblasti, sa ili bez TAGLN siRNA smetnji): D. Vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost ± SD iz najmanje tri odvojena pokusa, svaki provode u triplikatu. *, P izvoznici < 0,05, ** p izvoznici < 0,01, *** P izvoznici < 0.001, po jednosmjernom analizom varijance (ANOVA). Pregled Potom smo istraživali je li invazija i migracija mogućnost želučanih stanica raka će se pojačana ekspresija TAGLN u fibroblasta, proveli smo staničnu invaziju i migraciju test in vitro , Fibroblasta i MKN-45 bili su ne-contactedly ko-kulturan. Zanimljivo je da je invazija i migracija sposobnost MKN-45 je odmah pala u skupini s CAFs i blago se smanjio u skupini s CPFs i NFS. Rezultati su pokazali da je invazija i migracija sposobnost MKN-45 može smanjiti kroz regulaciju na dolje izraz TAGLN (Slika 2C i D).
Kako bi se procijenio doprinos CAFs-TAGLN na tumorske metastaze in vivo, mi emplyed modelu ksenografta. mješoviti smo TAGLN siRNA CAFs, non-ušutkao CAFs, CPFs i NFS sa MKN-45 ljudskih stanica raka želuca u omjeru 2: 1 ili MKN-45 sam i inokuliraju ove stanice kroz rep intravenske injekcije u imunodeficijentnih golih miševa. Nakon 6 tjedana, MKN-45 pomiješan s CAFs generira više plućnih metastatskih čvorova od MKN-45 pomiješan s TAGLN siRNA CAFs, CPFs i NFS, slično MKN-45 pomiješan s ne-šutnja siRNA CAFs (Tablica 1). Ti podaci sugerira da CAFs pokazuju povećanu sposobnost stimuliranja metastaza (slika 3A i B). Svi promatranja pokazuju da u prisutnosti CAFs tumori postaje agresivniji, što ukazuje da bi CAFs imaju ulogu u promociji metastaze in raka želuca. Slika 3 TAGLN poboljšava tumorskih metastaza kroz ljudsku tumora modelu ksenografta in vivo. A: miševe metastatskih čvorova u plućima. A1: pluća metastatskih čvorova iz tomur-bearing miša. Arrow: metastatski kvržica. a2: ne metastatski kvržica u plućima. A3: H &E bojenje za plućne metastatskog kvržica ispod svijetle polju mikroskopa. Mjerila, 200 pm. A4: H &E bojenje za pluća bez metastatskog kvržica pod svijetlo-polju mikroskopa. Mjerila, 200 pm. B: kvantifikacija golim miševima pluća metastatskih čvorova u različitim skupinama kroz rep intravenske injekcije. *, P izvoznici < 0.05, jednosmjernom analizom varijance (ANOVA). Pregled Tablica 1 miševa pluća metastatskih čvorova u različitim skupinama kroz rep intravenske injekcije (Svaka grupa sadržavala 6 miševa)
Grupe
TAGLN siRNA OS RH -MKN45
ne-šutnja siRNA CAF-MKN45
CAF-MKN45
HFP-MKN45
NF-MKN45
MKN45 sama
Broj miševa koji nose tumor
2 pregled, 5
5
3
2 pregled, 2
Broj metastatskih čvorova
2
10 pregled, 9
5
3
2 pregled TAGLN potiče tumorski metastaziranje regulirajući MMP-2 pregled, mnoge studije su usmjerene na ulogu metaloproteinaza matriksa (MMP) do invazije okolnog vezivno tkivo i metastaze tumorskih stanica s primarnom lezijom na udaljena mjesta na progresiju tumora [20, 21]. U našem dosadašnjem radu ispitali smo MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 i MMP-9 razina nakon TAGLN knock-down po siRNA putem ELISA, samo MMP-2 razine bio je značajno dolje regulirane drugim MMP razine pokazalo nikakvu promjenu. Stoga focued smo na MMP-2 u ovoj studiji. Kao Slika 4A pokazali, u usporedbi s MKN-45 ko-coultured sa OS RH /neg i OS RH /mock, razina MMP-2 u supernatant od MKN-45 ko-kultiviran s OS RH /siTAGLN su značajno je smanjen. Sljedeće smo ispitali aktivnost MMP-2 pomoću želatinske zimografije testa. Našli smo aktivnost MMP-2 značajno je inhibirana u supernatant od MKN-45 ko-kultiviran s OS RH /siTAGLN nego s OS RH /neg i OS RH /Mock (slika 4b). Dakle, TAGLN može poboljšati tumorskih metastaza pomoću MMP-2 enzima razgrađuju podrumske membrane (npr. Kolagen IV). Slika 4 TAGLN poboljšava metastaza po doreguliran MMP-2. A: MMP-2 u OSRH decresed očito nakon TAGLN RNAi pomoću ELISA. *, P izvoznici < 0,05 jednosmjernom analizom varijance (ANOVA). Stupci pogrešaka prikazuju standardnu ​​pogrešku oko srednje vrijednosti. B:. Obaranje TAGLN umanjena sposobnost Oružanih snaga Republike Hrvatske na tajne MMP-2 pomoću želatinske zimografije
TAGLN izraz ljudskog karcinoma želuca i njegova povezanost s diferencijacijom u bolesnika s karcinomom želuca
Da bi se procijenila izraz TAGLN kod raka želuca, TAGLN imunološko u 98 ispitane su primarni želučani tkiva raka. TAGLN ekspresija je reguliran u ljudskom stromi karcinoma želuca u odnosu na normalnu želučanog tkiva (slika 5A: normalno želučanog tkiva Slika 5B: rak želuca tkivo). Korelacija TAGLN izražavanja s kliničkopatološkim značajki prikazan je u tablici 2. razine TAGLN bila je viša u nediferenciranih tumora (slabo diferencirane adenokarcinoma, karcinomi pečatni prsten i mucinozni karcinoma) nego da u diferenciranim one (dobro i umjereno adnocarcinomas) (P
= 0.003). Osim toga, razina TAGLN je povezana s limfnih čvorova metastaza (P
= 0,029). Nije bilo značajne razlike u tumor TAGLN izražavanja prema drugim kliničkopatološkim značajkama kao što su spol, dob, veličina tumora, Lauren klasifikaciji, T pozornici, udaljenost metastazama i TNM fazi (P
≥ 0,05). Slika 5 Iskazivanje TAGLN u tkivima čovjeka s rakom želuca. A: TAGLN razina ekspresije u normalnom želučane tkivu IHC. Mjerila, 100 uM. B: TAGLN je izraženo u stromi ljudskog karcinoma želuca temelju IHC. Mjerila, 100 uM. C: TAGLN mRNA je reguliran u ljudskom raka želuca analizirala QRT-PCR. D: TAGLN protein reguliran u ljudskom karcinomu želuca analizirane Western blot. Vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost ± SD iz najmanje tri odvojena pokusa, svaki provode u triplikatu. *, P izvoznici < 0.001 po paried uzorcima T pregled testa. Pregled Tablica 2 kliničkopatološkim udruge izražavanja TAGLN kod raka želuca
Broj slučajeva
TAGLN imunološko
P
pregled Slab (+)
Strong (++)
Spol pregled 0,778 pregled muški pregled 60
27
33
Ženski pregled, 38 pregled, 16 pregled, 22 pregled Starost
0,739 pregled ≤60y pregled 46 pregled, 21 pregled, 25 izvoznici > 60y pregled 52 Netlogu 22 pregled, 30 veličina pregled tumora pregled 0,852 pregled ≤5 cm pregled 58 pregled, 25 pregled, 33 izvoznici > 5 cm
40 pregled, 18 pregled 22 pregled Diferencijacija
0.003
Pa + umjerene pregled 46 pregled, 13 pregled, 33
Poor Netlogu 52 pregled, 30 pregled, 22 pregled, Lauren klasifikacije
0,059 pregled crijeva pregled 40 pregled, 13 pregled, 27 pregled difuznu pregled 58 pregled, 30 pregled, 28 pregled, T stadij pregled 0,142 pregled T1 + T2
56 pregled, 21 pregled, 35 pregled, T3 + T4 pregled, 42 pregled, 22 pregled, 20 pregled limfnih čvorova metastaze pregled 0,029 pregled N0 pregled 27 Netlogu 11 pregled, 16 pregled n1 pregled, 32 pregled, 15 pregled, 17 pregled, N2 pregled 26 pregled 7
19 pregled N3 pregled 13 pregled 10
3. pregled udaljene metastaze pregled 0,709
Bez
95 pregled, 42 pregled, 53 Netlogu Uz pregled 3
1 pregled 2
TNM stadiju
0,722
sam 20 pregled 7
13 pregled II pregled, 25 pregled, 11 pregled, 14 pregled, III
30 pregled, 10
20 pregled IV pregled 23 pregled, 15 pregled, 8 pregled Također, koristili smo QRT-PCR i Western blot procijeniti izraz TAGLN u želučanog tkiva raka (Slika 5c i D). Ovi rezultati sugeriraju da je TAGLN izraz u želučanom tkivu raka bio mnogo veći kod raka želuca nego da spareni normalnog tkiva. Pregled Rasprava pregled Prikupljeni dokazi pokazuju da pokretanje i napredovanja raka uključuju interakcije između tumorskih i stanica strome. Tumorske stanice mogu aktivno privući stromalnih stanica, kao što su vaskularne stanice, stanice glatkih mišića i fibroblastima u tumor, tako nastaje mikrookruženje za poticanje rasta tumora [16, 22, 23]. Fibroblasti često čine većinu stanica strome unutar želuca karcinoma, ali funkcionalne doprinose tih stanica do nastanka tumora i metastaziranja tumora ostaju slabo razumio. Pregled TAGLN je jedan od prvih biljega glatkih mišića diferencijacije tijekom embriogeneze [24], i prethodne studije koje se odnose na TAGLN uglavnom usmjerena na stanice glatkih mišića [25]. Patološka stanja popraćena s remodeliranja tkiva i fibrogeneze, kao što je zarastanje rana i neoplastičnih lezija, karakterizirana pojavom stromalnih stanica s ultrastrukturnih značajkama intermedijarnih između onih tipičnih fibroblasta i onih glatkih mišićnih stanica. Ove fibroblasti pokazuju fenotipske i funkcionalne značajke glatkih mišićnih stanica i stoga su nazvani miofibroblasta [26], kao što je CAFs. U našoj studiji, TAGLN prekomjerna ekspresija također je zabilježena u CAFs. To je izvijestio da je TAGLN protein izraženo u rak želuca kad je analizirana ekspresija proteina spektar raka želuca pomoću dvodimenzionalne gel elektroforeze (2-DE) [27]. Nadalje, TAGLN protein je jedan od dva antigena povezanih s tumorom, koji su identificirani u serumu bolesnika s karcinomom bubrega od Klade Upotrebom 2-DE [28]. Ta izvješća su u skladu s nalazima koje smo promatrane koristeći stvarnom vremenu PCR i Western blot. Zanimljivo, otkrili smo da TAGLN uglavnom je otkriven u fibroblasta koji su izvedeni iz tumora strome, nego u stanicama tumora. Isto tako, drugi istraživači su otkrili da TAGLN nije izražen kod malignih stanica, ali u mezenhimske stanicama tumora strome [27].
Strome fibroblasti regulirati stanice endotela ili ponašanje epitelnih stanica kroz izravne i neizravne stanica cel1 interakcije. Aktivacija domaćin stroma1 mikro okolinu Smatra se da je kritičan korak u rastu tumora i progresije [13, 29]. Proteini izlučuju strome stanica u tumorima može pozitivno ili negativno utjecati na progresiju tumora. Najistaknutiji akcije TAGLN mogu favorizirati pokretljivost stanica tumora i invaziji [7, 30, 31]. Otkrili smo da je TAGLN se značajno povećao u limfnih čvorova metastaza skupini nego s negativnim limfnim čvorovima grupi. Za c1arify ulogu TAGLN u strome fibroblasta tijekom želučane tumorigenezi raka i metastaza, utišao smo ekspresiju TAGLN u ljudskim CAFs. Utvrđeno je da je samo MKN-45 ko-kultiviran s CAFs izražavaju visoku razinu TAGLN pokazuju mnogo veću invaziju i migraciju sposobnosti. Fibroblasti koji TAGLN je srušen nisu prikazali tu funkciju. Uzeti zajedno, predlažemo da TAGLN mogao biti odgovoran za jačanje želuca metastaza stanica raka preko stanice strome, kao što su CAFs. Pregled TAGLN izraz je značajno povećana u želučanom CAFs. CAFs s povećanim razinama ekspresije TAGLN može poboljšati invaziju tumorskih stanica i migracijske sposobnosti kojima se promiče poboljšanu ekspresiju MMP-2. Poticanje MMP ekspresije u fibroblastima bilo nakon kontakt s tumorskim stanicama, ili nakon kontakta sa tumorskih stanica dobivenih topivih faktora od tumora koji potječu iz epitelnih stanica je pokazano je u nekoliko studija [32-35]. Pojašnjenje temeljne mehanizme stoga može razrijediti recidiva tumora i metastaza u bolesnika s rakom želuca.
Zaključci pregled Ukratko, naša studija pokazuje da CAFs mogu promovirati želučane migraciju stanica raka i invaziju putem povećane MMP-2 proizvodnji uzrokovane TAGLN ranijim koracima .
Metode pregled uzorci tkiva
ukupno 40 parova tkiva raka i odgovarajuće normalnu sluznicu za QRT-PCR i Western blot i 98 osnovnih želučanog karcinoma za imunološko su prikupljeni iz kirurški uklonjeni želuca dijagnosticiran rak na Odjelu kirurgije, Ruijin bolnica, Shanghai Jiao Tong University School of medicine. Normalni uzorci sluznice uzeti su iz marginu resekcije, gdje su tumori koji se nalazi u razmaku od najmanje preko 6 cm od njega. Ova studija protokol je odobren od strane neovisnih Etičko povjerenstvo Ruijin bolnice, Šangaj Jiaotong Medicinskog fakulteta. Informirani pristanak je napisano. Svi uzorci bili su naglo zamrznuti u tekućem dušiku i čuvaju preko noći na -80 ° C prije upotrebe. 4% formaldehida fiksiranih sekcije tkiva iz tumorskih i sluznice su obojeni s H &E i ispituje i potvrđena histopatološki dva patologa. Svaki uzorak se pripisuje dijagnoze i zabio za Lauren klasifikacije, diferencijaciju pTNM fazi. Veličina tumora, mjesto i drugih kliničkih patološki karakteristike dobivene su iz kliničkih zapisa s dopuštenjem pacijenta
Stanične linije
Želučani stanične linije raka SNU-1 (ATCC: CRL-5971)., AGS (ATCC: CRL-1739), NCI-N87 (ATCC: CRL-5822) i KATOIII (ATCC: HTB-103) dobiveni su od American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Još 3 želučani stanične linije raka, MKN-45, MKN-28 i SGC-7901, sačuvane su u našem institutu. Sve stanične linije su održavane u RPMI-1640, uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS). Pregled protutijela
Primarni antitijela se koriste za bojenje uključuju humani specifičnu anti-vimentin (Abcam, Cambridge, UK), anti-fibronektin ( Abcam, Cambridge, UK), anti-α-glatkih mišića aktin (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA), anti-pan-keratin (Abcam, Cambridge, UK), anti-SM22 (Abcam, Cambridge, UK) i miš anti-GAPDH (Kangchen, Kina). pregled Izolacija ljudskih želučanih fibroblasta pregled fibroblasti su izolirani iz cancer- i ne-povezane s rakom regijama želučanog tkiva izvađenih iz bolesnika s karcinomom želuca tijekom radikalne želučane resekcija iz Odjel za kirurgiju, Ruijin bolnica, Shanghai Jiao Tong University School of Medcine. Regije karcinomom povezane su odabrani da se minimalno nekrotične regije mase tumora. Nisu povezane s rakom stroma koja je izolirana iz tkiva kod najmanje 2 cm distalno od vanjskog ruba mase raka. Normalni uzorci sluznice uzeti su iz marginu resekcije, gdje su tumori koji se nalazi u razmaku od najmanje preko 6 cm od njega. Tkiva su isjeckane su u organoids od približno 1 mm 3 i posađene neprevučene plastičnog materijala u RPMI 1640 mediju koji sadrži humani bazični faktor rasta fibroblasta, 20% fetalnog goveđeg seruma (FCS), te penicilin i streptomicin kao antibiotika. Tim je uvjetima dobivena homogene populacije fibroblastične stanične nakon 7 dana kulture. Svaki fibroblasta zatim se ekspandira u omjeru 1: 3 do tripsin-EDTA u 10 cm petrijevim posudama. Koristili smo fibroblaste pasaža do 8 dioba (PD) za kasnije eksperimente, kako bi se smanjio klonsku izbor i kulture stres koji bi mogao nastati za vrijeme produženog kulturi tkiva.
imunohistokemijsku bojanje (IHH) pregled, stanice ili tkiva su fiksirani 30 min sa 4% formalinu i isprane sa puferom fosfatne soli (PBS). Nakon endogena peroksidazna aktivnost ugašena s 0,3% 'H-sub> 2O 2, stanice su bile blokirane s normalnim serumom neimunološkog 30 minuta prije nego se inkubiraju s primarnim antitijelom na 37 ° C kroz 2 sata. Stanice ili tkiva su zatim obilježeni streptavidin-biotin-peroksidaza kompleta za bojanje (Dako, Carpinteria, CA, USA). Prisutnost obilježenog peroksidazom na dijelovima je vizualizirana inkubacijom s 3,3 '- diaminobenzidinu DAB supstrat + kromogena i sekcije su prebrojane s hematoksilinom. Negativna kontrola slajdovi su obavljali propusta primarnog protutijela. Pregled TAGLN izraz je određena intenzitetom obojenih stanica, a određuje se u dvije kategorije (slaba pozitivna i jaka pozitivna). Intenzitet bojenja se klasificiraju prema četiri razreda (rezultatima intenzitet): nema bojanja (razreda 0), svijetlo smeđe obojenje (ocjena 1), smeđa obojenja (ocjena 2), i tamno smeđe boje (ocjena 3). Ocjena 0 i stupnja 1 bio je definiran kao slabe pozitivni stupnja 2 i stupnja 3 su definirani kao jaki pozitivni. Pregled Kvantitativni PCR u realnom vremenu (QRT-PCR) pregled Ukupna RNA je ekstrahirana pomoću trizolne reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) u skladu s uputama proizvođača. cDNA se dobije s 1 ug RNA pomoću sustava reverzne transkripcije, pribora (Promega, Madison, WI, USA) i QRT-PCR je SYBR Green PCR reagense jezgre (Applied Biosystems, Warrington, UK). Početnicama specifičnim za TAGLN bili su kako slijedi: 5 '- GAGCAAGCTGGTGAACAGCC 3 ' (gornja), 5 '- GACCATGGAGGGTGGGT TCT-3 ' (donji). Glyceral-dehyde-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) je korišten kao endogeni referenca. Njegovi sekvence bile 5 '- GGACCTGACCTGCCGTCT AG-3 ' (gornja), 5 '- GTAGCCCAGGATGCCCTTGA 3 ' (donji). QRT-PCR za određivanje sadržaja razine mRNA TAGLN je učinjeno na ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Podaci su analizirani pomoću komparativnu Ct metodu. Specifičnost nastalih PCR proizvoda je potvrđena topi krivulje.
Western blot pregled stanice su sakupljene i lizirane s reagentom za ekstrakciju proteina sisavca (Pierce, Rockford, IL, USA). Koncentracije proteina su određene s bicinkroniničnoj kiselini (BCA) komplet za određivanje proteina (Pierce, Rockford, IL, USA). Uzorci koji sadrže 50 ug ukupnog proteina su stavljene na svaku traku 12% akrilamidnom gelu u aparatu minigel (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Razdvojene Proteini su prebačeni na polivinilidenfluorid (PVDF) membranu (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Nakon inkubirane s primarnim protutijelom (1: 1000) i HRP konjugiranih sekundarnih antitijela (1: 5000). Respektivno, Imunološki kompleksi su detektirani poboljšane kemiluminiscentne (ECL) sustav (Millipore, Bedford, MA, USA) pregled enzim -linked imunosorpcijske analize (ELISA)
razine proteina MMP-2 u supernatantima izmjerena su ELISA kitom (R &D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) prema uputama proizvođača
rast stanica. test pregled različitih skupina stanica (1 × 10 3) posađeno je u pločice s 96 jamica u triplikatu. Broj viabilnih stanica određena je na dan pomoću brojanja Kit (CCK-8) pomoću visoko topiv u vodi tetrazolium sol WST-8 [2- (2-metoksi-4-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) 5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolij, mononatrijeva sol] (Dojindo, Japan). Ukratko, 20 ul CCK-8 otopini se doda u ploče, apsorbancija pri 450 nm je mjerena nakon inkubacije 4 sata. Pregled Procjena tumorskoj invaziji i migraciju
tumorske invazije i testa migracije su izvedeni sa QCMTM24 jamica invazije kit (Millipore, Bedford, MA, USA) i QCMTM24 jažica migracije kit (Millipore, Bedford, MA, USA) prema protokolu koji dobavlja proizvođač, respektivno. Dodati pripravljeni MKN-45 stanične suspenzije (2 × 10 5 stanica /jažici) u gornju komoru i dodati prethodno suspendiran fibroblasti (5 × 10 4 stanica /jažici u RPMI 1640 mediju koji sadrži 20% FBS) do donje komore. TAGLN nekih fibroblasta u niže komore je inhibirana pomoću siRNA 24 sati kasnije. MKN-45 i fibroblasti bili ko-kultivirane bez contactedly tokom 48 sati, a zatim lysised stanica i određuje RFU vrijednosti s ploči fluoresentnog čitača korištenjem 480/520 nm filteri.
TAGLN siRNA pregled Primijenjena je Qiagen Softver dizajnirati RNAi sekvence koje ciljaju ljudski TAGLN (prist NM_003186.), a siRNA slijed s najvećim Pretpostavljena učinkovitost (smisao: 5 '- AAAUCGAGAAGAAGUAUGAdtdt-3 ', suprotne: 5 '- UCAUAC UUCUUCUCGAUUUdtdt -3 ') sintetiziranje Shanghai GeneChem Co, Ltd siRNA nasumičnim redoslijedom (smisao: 5 ' - UUCUCCGAACGUGUCACG UTT-3 ', negativna: 5 ' - ACGUGACACGUUCGGAGAAtt 3 ') protiv bez gena (kodirani siRNA grupa), bilo je ubačeno kao unutarnje kontrole. Za pokuse, stanice su transfektirane s DOTAP liposomalni transfekcijski reagens (Roche, Njemačka). Stanice su nasađene na 2 × 10 5 stanica /jamici u ploče sa 6 jažica. Nakon 24 sati, kada su stanice u fazi rasta log, 250 jal Opti-MEM sam pomiješano s 5 ul 20 uM siRNA duplex, dok je još 250 ul Opti-MEM sam odvojeno inkubira se s 11,88 ul DOTAP liposoma. Dvije smjese lagano miješaju i inkubiraju od oko 30 minuta na sobnoj temperaturi. Za transfekciju, cijela smjesa je dodana u svaku jažicu u 1,5 ml svježeg medija bez antibiotika. Konačna transfektirane koncentracija siRNA je 20 nM. Stanice su skupljene za daljnje ispitivanje na 24, 48 i 72 sati nakon transfekcije. Pregled želatinske zimografije pregled Supernatanti kultura su sakupljeni nakon 24 sati te je pomiješan s puferom gel uzorak (0,5 M Tris-HCl, glicerol, 10% natrijev dodecil sulfat [SDS] β-merkaptoetanola i 0,5% bromfenol plavo). Deset mikrograma proteina su uzeti odvajanjem SDS-PAGE; SDS-PAGE gelovima sadržavala 0,1% želatina (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Nakon elektroforeze, gelovi su isprani u 50 mM Tris puferu sadržaja 2.5% Triton X-100. Gelovi su inkubirani još 24 sati u tekućinu za inkubaciju (50 mM Tris puferu [pH 7,6], 10 mM CaClz 2 i 200 mM NaCl). Gelovi su obojene s 0.5% Coomassie blue, bijelim pojasevima (72 kDa) na plavoj podlozi naznačeno zone probave odgovara prisutnosti MMP-2. Pregled mišji model pregled Ženke BALB /c nu /nu
golih miševa, dob podudaranja između 4-5 tjedna (Institut za zoologiju kineske akademije znanosti), smještene su u određenom okruženju bez patogenih organizama u životinjskom Laboratorijska jedinica, Shanghai Jiao Tong University School of medicine, Kina. Fibroblasti i MKN-45 su pomiješani u omjeru 1: 4 u 0.1 ml PBS i ubrizgava u lateralnu repnu venu. Šest miševi bili su uključeni u svakoj skupini u sve pokuse, a svaki Pokus je izveden dvaput. Životinje su žrtvovane i pluća metastatskih čvorova zabilježeni su 6 tjedana nakon usađivanja tumorskih stanica. Uzorci tumora su sakupljene, pomiješana u formalinu, uklopljeno u parafin, te podvrgne H &E bojanja. P izvoznici < Svi autori pročitali i odobrili konačnu rukopis. Pregled

• Co-pojava višestrukih moždani infarkti zbog hiperkoagulabilnosti povezane s malignosti i meningealni karcinomatoza kao početnu manifestacije raka želuca
• Da li želučani Tonometrija vođena terapija smanjiti ukupnu smrtnost u kritično bolesnih pacijenata?