Stromálne fibroblasty v mikroprostredie žalúdočných karcinómov podporovať metastázovaniu nádoru prostredníctvom upregulating TAGLN expression

stromálne fibroblasty v mikroprostredie žalúdočných karcinómov podporovať metastázovaniu nádoru prostredníctvom upregulating TAGLN výraz
abstraktné
pozadia
Fibroblasty hrajú kritickú úlohu pri vzniku nádorov, nádorov progresie a metastáz. Avšak, ich detailné molekulárnej charakteristiky a klinický význam sú stále uniká. TAGLN je aktínu viažuci proteín, ktorý hrá dôležitú úlohu pri vzniku nádorov. Výsledky
sme skúmali interakciu medzi rakovinových buniek a mikroprostredie nádoru zistiť, ako fibroblasty z ľudského karcinómu žalúdka uľahčiť tumorigeneze cez TAGLN. QRT-PCR a Western blot naznačil, že TAGLN expresie bola up-regulovaná v žalúdočných fibroblastov karcinómu asociovaných (CAFS), ktoré podporujú žalúdočné migráciu a inváziu rakovinových buniek. Pomocou malé interferujúce RNA (siRNA), sme zistili, že zvýšená CAFS metastázovaniu nádoru prostredníctvom up-regulované TAGLN in vitro a in vivo. Expresie matrix metaloproteinázy-2 (MMP-2) bola významne nižšia po TAGLN knock-down pomocou siRNA. Hladiny TAGLN boli zvýšené u ľudskej rakoviny žalúdka stróma než normálne žalúdočnej väzivového tkaniva a spojená s diferenciácie a lymfatických uzlín rakoviny žalúdka.
Záver
CAFS môžu podporovať žalúdočné migráciu a inváziu rakovinových buniek pomocou upregulating TAGLN a TAGLN indukované MMP-2 výrobu.
Kľúčové
TAGLN fibroblastov mikroprostredie nádorových metastáz karcinómu žalúdka pozadí
karcinómu žalúdka je druhou najčastejšou príčinou úmrtí súvisiacich s rakovinou vo svete, najmä v Ázii [1, 2]. Väčšina pacientov s karcinómom žalúdka zomrel recidívy spôsobené vzdialených metastáz. Metastáza je viacstupňový proces, pri ktorom rakovinové bunky šíri z primárneho nádoru a nešírili do okolitých tkanív a orgánov vzdialenosť, zahŕňajúce rakovinových buniek pohyblivosť, intravasation, tranzit v krvi alebo lymfy a extravazácia [3]. Tento proces závisí tesne na okolité mikroprostredie a vývoj nádoru závisí na kontinuálne presluchu medzi rakovinových buniek a extracelulárnej mikroprostredia [4].
Transgelin (TAGLN, tiež známy ako SM22) je aktínu zesíťovací proteín, ktorý sa podieľa v interakciách vápnika a reguluje kontrakčnej vlastnosti [5]. To môže hrať úlohu v diferenciácii buniek, invázia buniek bunkovej migrácie a matice remodelácia stabilizáciou cytoskelet cez aktínu väzby [6, 7]. Nadmerná expresia TAGLN proteínu bola pozorovaná v karcinómov žalúdka, pečene, a pažeráka, pričom zníženej hladiny TAGLN mRNA boli pozorované v prsníku a rakovina hrubého čreva bunkových línií a primárnych nádorov [8].
Je všeobecne prijímaná, že tumor -stroma interakcie hrajú dôležitú úlohu v rozvoji a progresii nádorov. Stroma je tvorená hlavne z extracelulárnej matrix (ECM) a bunkových elementov, ako sú fibroblasty [9, 10]. Bunkové zložky podpornej väzivového tkaniva sú dobre známe ako majúce podpornú úlohu v karcinogenéze [11, 12]. Tieto stromálny elementy pôsobia synergicky presluchu s rakovinových buniek z primárnych miest na udržanie rastu a metastáz [13, 14] rakoviny. Tumor stróma, ktorý je označovaný ako "reaktívne" strómy je spojená so zvýšeným počtom fibroblastov, zvýšenú hustotu kapilár a ukladanie nového ECM bohaté na type-1-kolagénu a fibrínu [15]. Hromadia sa dôkazy ukazujú, že stromálne bunky, ako sú fibroblasty majú hlbší vplyv na rozvoj a progresiu karcinómu, než sa predtým ocenené [15-17].
Fibroblasty sú dobre známe, že hrá úlohu v progresii vzniku nádorov a. Fibroblasty vylučujú vimentin, fibronektín, α-hladkého-aktínu (α-SMA), povrchový proteín fibroblastov, rovnako ako fibroblastic markerov. Karcinóm spojené s fibroblasty (CAFS) sú aktivované fibroblasty, biologicky odlišné od fibroblastov prítomných v benígnych mikroprostredie v niekoľkých dôležitých aspektov [17, 18]. CAFS nie sú pasívne prizerajúci na vzniku nádorov a metastáz, ale aktívne prispievať k týmto procesom [19]. Naše znalosti o úlohe kľudových a aktivovaných fibroblastov u rakoviny sa stále vyvíja. Tu sa zameriavame na interakciu medzi rakovinových buniek a ich mikroprostredie študovať, ako fibroblasty izolované z ľudských žalúdočných karcinómov uľahčiť tumorigeneze.
Výsledky
vyjadrenie TAGLN je up-regulovaná v žalúdočných fibroblastov karcinómu spojené s
karcinómu -associated fibroblasty (CAFS), podvojné fibroblasty (CPFs) a normálne fibroblasty (NFS) boli získané z kultúry primárnych tkanív s využitím tkaniva z regiónov s rakovinou spojené, non-rakovinou spojené stróma a normálne sliznice, resp. Potom sme overili čistotu jednotlivých fibroblastov populácie imunobarvením. Tieto fibroblastov populácie vyjadril vysokej levls z fibroblastic markerov, ako je vimentinu, alfa-SMA a fibronektínu. Na druhej strane, tieto bunky sa nevyjadrujú epiteliálne markery, ako cytokeratin (obrázok 1A). Tieto dáta potvrdila čistotu fiborblasts. Tieto pozorovania ukazujú, že kultúra bunky boli prevažne fibroblasty boli pripravené s minimálnou kontamináciou inými bunkami. Obrázok 1 expresie TAGLN je up-regulovaná v žalúdočných fibroblastov s rakovinou spojené. A: charakterizácia žalúdočných fibroblastov (ICC). a1: vimentin, pozitívne. a2: α-SMA, pozitívne. a3: fibronektín pozitívny. a4: cytokeratin, negatívne. Pôvodný zväčšenie: × 200. Mierka tyče, 100 um. B: QRT-PCR analýza TAGLN v CAF, CPF a NF. *, P Hotel < 0,05, ** P Hotel < 0,01, v porovnaní s NF. C: Western blot analýza TAGLN v CAF, CPF a NF, úroveň expresie TAGLN bola postupne znížená. D: fibroblasty rastová krivka boli stanovené pomocou CCK-8 testu, CAFS rástol quickier ako ostatní. E: CAF mali vyššiu schopnosť zvýšiť MKN-45 je migračná schopnosť než CPF a NF, ***, P Hotel < 0,001 v porovnaní s MKN-45. F: CAF mali vyššiu schopnosť zvýšiť MKN-45 invázii schopnosť než CPF a NF, *, P Hotel < 0,05, ** P Hotel < 0,01, v porovnaní s MKN-45.
MRNA a proteínové hladiny TAGLN boli nižšie v CPFs a NF v porovnaní s CAFS (Obrázok 1B a C). prvý sme ukázali, že CAFS rástla podstatne viac než CPFs a NFS vitro proliferáciu buniek (obrázok 1D). Ďalej sme vykonali invázie buniek a migrácia testu na overenie, či je invázia a migrácia schopnosť rakovinových buniek žalúdka by sa rozšíriť o fibroblasty. Experiment bol navrhnutý tak, aby skúmať účinky strómy TAGLN, ktorý je vylučovaný fibroblasty, u ľudských buniek karcinómu žalúdka. Vnútorné hladiny TAGLN v rakovinových bunkách žalúdku môže ovplyvňovať experimentálne proces. Z tohto dôvodu sme choosed MKN-45 bunkové línie, pretože jeho TAGLN hladina expresie bola najnižšia v siedmich žalúdočných nádorových bunkových línií (SNU-1, AGS, NCI-N87, KATOIII, MKN-45, MKN-28 a SGC-7901; údaje neukázané). Je zaujímavé, že invázia a migrácia schopnosť MKN-45 vzrástla vo všetkých troch skupinách (CAFS, CPFs a NFS), a najviac zvýšili v skupine s CAF (Obrázok 1E a F). Akvizícia migrácie a invazívne správanie je jedným z krokov v metastatického procesu.
CAFS podporovať metastázovaniu nádoru cez upregulating TAGLN
Ak chcete skúmať účinok TAGLN v fibrobalsts sme použili RNAi zraziť TAGLN výraz. CAFS, CPFs a NFS boli transfekovány TAGLN špecifické alebo non-ticha siRNA. RNA a proteínu boli získané po 24, 48 alebo 72 hodín po transfekciu, TAGLN mRNA a proteínové hladiny boli skúmané pomocou QRT-PCR a Western blot. TAGLN mRNA a proteín bol významne inhibovaný v bunkách ošetrených TAGLN špecifickú siRNA (Obr 2A a B). Obrázok 2 CAFS zvýšenie nádorové bunkové línie MKN-45 migraton a inváziu cez stimulovaná TAGLN. A: TAGLN expresie QRT-PCR analýzou po siRNA Knockdown v fibroblastov. B: TAGLN expresie pomocou Western blot analýzou po siRNA príklepu vo fibroblastoch. migračný test bunka in vitro (fibroblasty s alebo bez TAGLN siRNA rušenia): C. invázie bunkovom teste in vitro (fibroblasty s alebo bez TAGLN siRNA rušenia): D. Hodnoty predstavujú priemer ± SD z aspoň troch oddelených pokusov, každý vykonaný trikrát. *, P Hotel < 0,05, ** P Hotel < 0,01, ***, P Hotel < 0,001, podľa jednocestné analýzy variance (ANOVA).
Ďalej sme skúmali, či je invázia a migrácia schopnosť buniek karcinómu žalúdka bude posilnená expresie TAGLN vo fibroblastoch, vykonali sme invázie buniek a migrácia teste in vitro , Fibroblasty a MKN-45 non-contactedly spoločne kultivované. Je zaujímavé, že invázia a migrácia schopnosť MKN-45 okamžite klesol v skupine s CAFS a v skupine s CPFs a NFS mierne znížili. Výsledky ukázali, že invázia a migrácia schopnosť MKN-45 môže znížiť cez down-reguláciu expresie TAGLN (Obrázok 2C a D).
Aby bolo možné posúdiť prínos CAFS-TAGLN na nádorových metastáz in vivo, sme emplyed modelu xenotransplantátov. mieša sme TAGLN siRNA CAFS, non-umlčaný CAFS, CPFs a NFS s MKN-45 ľudských buniek karcinómu žalúdka v pomere 2: 1 alebo MKN-45 sám a naočkuje týchto buniek prostredníctvom chvostovej intravenóznou injekciou v imunodeficitných nahých myší. Po 6 týždňoch, MKN-45 v zmesi s CAFS prinieslo viac pľúcna metastatických uzlín než MKN-45 v zmesi s TAGLN siRNA CAFS, CPFs a NFS, podobný MKN-45 v zmesi s non-ticha siRNA CAFS (tabuľka 1). Tieto údaje naznačujú, že CAFS vykazujú zvýšenú schopnosť stimulovať metastázovaniu nádoru (Obrázok 3A a B). Všetky pozorovania ukázali, že v prítomnosti CAFS, nádory sa stalo oveľa agresívnejší, čo naznačuje, že by mohol hrať úlohu CAFS pri podpore metastáz u karcinómu žalúdka. Obrázok 3 TAGLN zvyšuje metastázovaniu nádoru prostredníctvom ľudského modelu xenoimplantátu nádoru in vivo. A: holých myší metastatická uzlíky v pľúcach. a1: pľúc metastatická uzlíky z tomur nesúci myši. Arrow: metastatický uzlíky. a2: nie metastatická uzlina v pľúcach. a3: H & E farbenie na pľúcne uzlík metastatické pod jasnom poli mikroskopu. Scale bary, 200 um. a4: H &E farbenie na pľúcach bez metastatického uzlík pod jasnom poli mikroskopu. Scale bary, 200 um. B: kvantifikácia u nahých myší pľúcnych metastatických uzlíkov v rôznych skupín pomocou intravenóznou injekciou chvostovou. *, P Hotel < 0,05, jednosmernú analýzou rozptylu (ANOVA).
Tabuľka 1 nahých myší pľúcnej metastatické uzliny v rôznych skupinách prostredníctvom intravenóznej injekciou chvostovou (Každá skupina obsahovala 6 myší)
skupiny
TAGLN siRNA CAF -MKN45
non-mlčania siRNA CAF-MKN45
CAF-MKN45
CPF-MKN45
NF-MKN45
MKN45 sám EU počet nádorom u myší
2.
5
5 Sims 3
2
2
počet metastatických uzlíkov
2
10
9
5 Sims 3
2
TAGLN podporuje metastázovaniu nádoru podľa upregulating MMP-2
mnoho štúdií sa zamerala na rolu matrixových metaloproteinázy (MMP) k invázii do okolitých spojivového tkaniva a metastáz nádorových buniek z primárnej lézie do vzdialených miest v progresii nádoru [20, 21]. V našej predchádzajúcej práci sme sa zaoberali MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 a MMP-9 úrovní po TAGLN knock-down podľa siRNA prostredníctvom ELISA, iba MMP-2 na úrovni došlo k výraznému down-regulované, iné MMP úrovne nepreukázali zmenu. Z tohto dôvodu sme focued na MMP-2 v tejto štúdii. Ako ukazuje obrázok 4A ukázali, v porovnaní s MKN-45 spoločne s coultured CAF /neg a CAF /Mock, hladiny MMP-2 v supernatante z MKN-45 spoločne kultivujú s CAF /siTAGLN boli významne potlačené. Ďalej sme skúmali aktivitu MMP-2 s použitím želatíny zymografií testu. Zistili sme, MMP-2 aktivita bola významne inhibovaná v supernatante z MKN-45 spoločne kultivujú s CAF /siTAGLN než s CAF /neg a CAF /Mock (Obrázok 4B). Tak TAGLN môže zvýšiť metastázovaniu nádoru pomocou enzýmov MMP-2 degradujú suteréne membrány (napr. Kolagén IV). Obrázok 4 TAGLN zvyšuje metastázovaniu nádoru pomocou up-regulovaná MMP-2. A: MMP-2 expresie v CAF decresed samozrejme po TAGLN RNAi pomocou ELISA. *, P Hotel < 0,05 jednosmernú analýzou rozptylu (ANOVA). Chybové úsečky znázorňujú štandardné chybu okolo strednej hodnoty. B :. Porazený TAGLN narušená schopnosť CAF k tajným MMP-2 želatínou zymografií
TAGLN expresie v ľudskej rakovine žalúdka a jej súvislosť s diferenciáciou u pacientov s karcinómom žalúdka
na vyhodnotenie výrazu TAGLN v rakoviny žalúdka, TAGLN imunologické v 98 boli skúmané primárnej rakovina žalúdka tkaniva. TAGLN expresie bola up-regulovaná v ľudskom žalúdku rakoviny stróma v porovnaní s normálnou žalúdočnej tkanive (obr 5A: normálna žalúdočné tkaniva; Obrázok 5B: rakovina žalúdka tkanivo). Korelácia TAGLN expresie s klinicko-funkciami bol uvedený v tabuľke 2. úrovniach TAGLN boli vyššie v nediferencovaných nádorov (zle diferencované adenokarcinómy, karcinómy pečatný prsteň buniek a mucinózní karcinómov) ako tie, ktoré v diferencovaných (dobre a stredne adnocarcinomas) (P
= 0,003). Okrem toho hladiny TAGLN korelovala s lymfatických uzlín (P
= 0,029). Neboli zistené žiadne významné rozdiely v expresii tumor TAGLN podľa ostatných klinicko-funkciami, ako je pohlavie, vek, veľkosť nádoru, Lauren klasifikácii, T fáze, vzdialenosť metastázy a TNM štádiu (P
≥ 0,05). Obrázok 5 Expresia TAGLN v ľudských nádorových tkanivách žalúdka. A: TAGLN Hladina expresie v normálnej žalúdočnej tkaniva IHC. Mierka tyče, 100 um. B: TAGLN je nadmerne exprimovaný v stromálnych ľudskej rakoviny žalúdka u IHC. Mierka tyče, 100 um. C: TAGLN mRNA je up-regulovaná v ľudskej rakovine žalúdka analyzované QRT-PCR. D: TAGLN proteín je up-regulovaná v ľudskej rakovine žalúdka analyzované pomocou Western Blot. Hodnoty predstavujú priemer ± SD z aspoň troch oddelených pokusov, každý vykonaný trikrát. *, P Hotel < 0,001 tým paried vzorkách T
test.
Tabuľka 2 klinicko združenia TAGLN expresie v karcinómu žalúdka
počet prípadov
TAGLN imunologické farbenie
P

Slabá (+)
Strong (++)
Pohlavie
0,778
Male
60
27
33
Žena
38
16
22
Vek
0,739
≤60y
46
21
25 Hotel > 60y
52
22
30 veľkosť nádoru
0,852
≤5 cm
58
25
33 Hotel > 5 cm
40
18
22
Diferenciácia
0,003
studňa + Mierne
46
13
33
Poor
52
30
22
klasifikácie Laurena
0,059
Črevné
40
13
27
Difúzna
58
30
28
T etapa
0,142
T1 + T2
56
21
35
T3 + T4
42
22
20
lymfatických uzlín
0,029
N0
27
11
16
N1
32
15
17
N2
26
7
19
N3
13
10
3
vzdialenej metastázy
0,709
Bez
95
42
53
S Sims 3 foto 1
2
TNM štádiu
0,722
Aj
20
7
13
II
25
11
14
III
30
10
20
IV
23
15
8
Tiež sme použili QRT-PCR a Western blot na vyhodnotenie expresie TAGLN v žalúdočných rakovinových tkanív (Obrázok 5C a D). Tieto výsledky naznačujú, že expresia TAGLN v žalúdočných rakovinových tkanivách bola oveľa vyššia, než je rakovina žalúdka v párových normálnych tkanivách.
Diskusia
Hromadí sa dôkazy ukazujú, že iniciácie a progresie rakoviny zahrňuje interakcie medzi oboma tumoru a stromálne bunky. Nádorové bunky môžu aktívne regrutovať stromálnych buniek, ako sú napríklad cievne bunky, bunky hladkého svalstva a fibroblasty, do nádoru, a sú tak mikroprostredie podporovať rast nádoru [16, 22, 23]. Fibroblasty často predstavujú väčšinu bunky strómy v karcinómu žalúdka, ale funkčné príspevky týchto buniek k tvorbe nádorov a nádorových metastáz zostáva zle pochopený.
TAGLN je jedným z prvých markerov hladkého svalstva v priebehu embryogenézy diferenciácie [24], a predchádzajúce štúdie týkajúce sa TAGLN zameraná predovšetkým na hladkých svalových buniek [25]. Patologické stavy sprevádzané remodeláciu tkanív a fibrogeneze, ako je hojenie rán a neoplastické lézie, sú charakterizované výskytom stromálnych buniek s ultrastrukturální rysy medzi vlastnosťami typickými fibroblastov a tie z buniek hladkého svalstva. Tieto fibroblasty vykazujú fenotypické a funkčné vlastnosti buniek hladkého svalstva, a tým sú pomenované myofibroblasty [26], ako je napríklad CAFS. V našej štúdii TAGLN nadmerná expresia bol tiež pozorovaný v CAFS. Uvádza sa, že TAGLN proteín je nadmerne vystavený u karcinómu žalúdka, ak expresia proteínu spektrum karcinómu žalúdka bola analyzovaná pomocou dvojrozmernej gélovej elektroforézy (2-DE) [27]. Okrem toho je TAGLN proteín je jedným z dvoch s nádorom spojených antigénov, ktoré boli zistené v sére pacientov s karcinómom obličiek podľa Kladie za použitia 2-DE [28]. Tieto správy sú v súlade so zisteniami, ktoré sme pozorovali pomocou real-time PCR a Western Blot. Zaujímavé je, že sme zistili, že TAGLN bol zistený hlavne v fibroblasty odvodené z nádoru strómy, skôr ako v nádorových bunkách. Podobne, iní výskumníci zistili, že TAGLN nie je exprimovaný v malígnych bunkách, ale v mezenchymálnych bunkách strómy nádorového tkaniva [27].
Stromálne fibroblasty reguláciu endoteliálny alebo správanie epitelových buniek prostredníctvom priamych alebo nepriamych interakcií bunka-cel1. Aktivácia hostiteľ stroma1 mikroprostredie je myšlienka byť kritickým krokom v raste nádoru a progresie [13, 29]. Proteíny vylučované stromálne bunky v nádoroch môže mať pozitívny alebo negatívny vplyv na progresiu nádoru. Medzi najvýznamnejšie akcie TAGLN môže uprednostňovať nádorových buniek pohyblivosť a invázie [7, 30, 31]. Zistili sme, že TAGLN sa v lymfatických uzlín skupiny významne zvýšil, než lymfatických uzlín negatívny skupiny. Ak chcete c1arify úlohu TAGLN vo stromálnych fibroblastov počas žalúdočné vzniku nádorov rakoviny a metastáz, sme umlčal výraz TAGLN v ľudských CAFS. Bolo uvedené, že iba MKN-45 spoločne kultivujú s CAFS exprimujúce vysokej úrovni TAGLN vykazovali oveľa vyššiu invázie a migračnej schopnosti. Fibroblasty, ktoré TAGLN bol zrazený ani túto funkciu zobrazenia. Celkovo vzaté, odporúčame, aby TAGLN by mohol byť zodpovedný za zvýšenie žalúdočnej metastáz nádorových buniek pomocou buniek strómy, ako je CAFS.
TAGLN expresie je významne zvýšená v žalúdočných CAFS. CAFS so zvýšenými hladinami expresie TAGLN môže zvýšiť inváziu nádorových buniek a migračné schopnosti, ktoré podporujú zvýšenú expresiu MMP-2. Stimulácia expresia MMP vo fibroblastoch buď po priamom kontakte s nádorovými bunkami, alebo po kontakte s nádorových buniek odvodených rozpustných faktorov, z nádorov pochádzajúcich z epitelových buniek bola preukázaná v niekoľkých štúdiách [32-35]. Objasnenie základných mechanizmov teda môže zmierniť recidíve nádoru a metastáz u pacientov s karcinómom žalúdka.
Závery
Stručne povedané, naša štúdia ukazuje, že CAFS môžu podporovať žalúdočné migráciu a inváziu rakovinových buniek cez zvýšenú produkciu MMP-2 spôsobené TAGLN upregulací .
Metódy
vzorky tkaniva
celkom 40 párov rakovinových tkanív a príslušné normálne sliznicu pre QRT-PCR a Western blot a 98 primárnych karcinómov žalúdka pre immunostaining boli získané z chirurgicky odstránený rakovinou žalúdka diagnostikovaná u ministerstva chirurgická Ruijin nemocnice, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Normálne vzorky sliznice boli odobraté z okraja resekcia, kde sa nachádza nádory aspoň cez 6 cm na rozdiel od neho. Táto štúdia protokol bol schválený nezávislou etickou komisiou Ruijin nemocnice, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine. Informovaný súhlas bol napísaný. Všetky vzorky boli rýchlo zmrazený v kvapalnom dusíku cez noc a udržiava sa pri -80 ° C pred použitím. 4% formaldehydom fixovaných rezy oboch nádoru a sliznice boli zafarbené H &E a skúmané a overené histopatologicky dvoma patológmi. Každá vzorka bol pripočítaný diagnózu a skóroval Lauren klasifikácie, diferenciácie pTNM fáze. veľkosť nádoru, umiestnenie a iné klinické patologické charakteristiky boli získané z klinických záznamov s povolením pacienta
bunkové línie
rakovinou žalúdka bunkové línie SNU-1 (ATCC CRL-5971)., AGS (ATCC CRL-1739), NCI-N87 (ATCC: CRL-5822), a KATOIII (ATCC: HTB-103) boli získané z American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Ďalších 3 žalúdočné rakovina bunkové línie, MKN-45, MKN-28 a SGC-7901, boli zachované v našom ústave. Všetky bunkové línie boli udržiavané v RPMI-1640 doplnenom 10% fetálneho hovädzieho séra (FBS).
Protilátky
Primárne protilátky použité na farbenie súčasťou ľudského špecifickú anti-vimentin (abca, Cambridge, UK), anti-fibronektín ( abca, Cambridge, UK), anti-α-hladkého svalstva aktínu (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA), anti-pan-cytokeratin (abca, Cambridge, UK), anti-SM22 (abca, Cambridge, UK) a myšou anti-GAPDH (Kangchen, Čína).
Izolácia ľudských fibroblastov žalúdočných
fibroblasty boli izolované z karcinóm a non-rakovinou asociovaných oblastí žalúdočných tkanív pitvaných od pacientov s rakovinou žalúdka pri radikálnej resekcii žalúdka z department of Surgery, Ruijin nemocnice, Shanghai Jiao Tong University School of Medcine. Regióny s rakovinou spojené sa volí tak, aby minimálne nekrotické oblasti nádorovej hmoty. Non-rakovinou spojené stróma, ktorý bol izolovaný z tkaniva najmenej 2 cm distálne k vonkajšiemu okraju hmoty rakoviny. Normálne vzorky sliznice boli odobraté z okraja resekcia, kde sa nachádza nádory aspoň cez 6 cm na rozdiel od neho. Tkanivá boli namletej na organoids o približne 1 mm 3 a schovať na nepotiahnuté plastového materiálu, v RPMI 1640 médiu obsahujúcom ľudský základné fibroblastový rastový faktor, 20% fetálne teľacie sérum (FCS) a penicilínu a streptomycínu ako antibiotiká. Tieto podmienky produkovali homogénna fibroblastickou bunkovú populáciu po 7 dňoch kultivácie. Každý fibroblastov bola expandovaná v pomere 1: 3 pomocou trypsín-EDTA v 10 cm Petriho misiek. Použili sme fibroblasty pasážovania až 8 zdvojenie populácie (PDS) pre následné experimenty, aby sa minimalizovala klonálnej selekcie a kultúrne napätie, ktoré by mohlo dôjsť v priebehu predĺženej tkanivovej kultúre.
Imunohistochemické farbenie (IHC)
Bunky alebo tkanivá boli fixované po dobu 30 minút s 4% formalínu a premyje fyziologickým roztokom pufrovaným fosfáty (PBS). Po endogénnej aktivita peroxidázy bola zastavená 0,3% H 2O 2, boli bunky blokované s normálnym neimúnnych sére po dobu 30 minút predtým, ako sa inkubujú s primárnou protilátkou pri teplote 37 ° C po dobu 2 hodín. Bunky alebo tkanivá potom boli označené peroxidáza farbiaca súprava streptavidín-biotín-chrenová (Dako, Carpinteria, CA, USA). Prítomnosť značeného peroxidáze na sekciách bola vizualizované inkubáciou s 3,3 '- Diaminobenzidine, DAB + substrát chromogén a rezy boli kontrastne zafarbené hematoxylínom. Negatívne kontrolné sklíčka bola vykonaná vynechaním primárnej protilátky.
TAGLN expresie bola hodnotená intenzitou farbených buniek a stanovená v dvoch kategóriách (slabo pozitívna a silne pozitívne). Intenzita farbenie bol klasifikovaný podľa štyroch tried (skóre intenzita): Žiadne farbenie (stupeň 0), svetlo hnedé sfarbenie (trieda 1), hnedá farbenie (trieda 2) a tmavo hnedé farbenie (stupeň 3). Stupeň 0 a stupeň 1 bol definovaný ako slabo pozitívna, stupeň 2 a stupeň 3 boli definované ako veľmi pozitívne.
Kvantitatívne PCR v reálnom čase (QRT-PCR)
Celková RNA bola extrahovaná za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) podľa inštrukcií výrobcu. cDNA bola získaná s 1 ug RNA s použitím Reverse Transcription System Kit (Promega, Madison, WI, USA) a QRT-PCR bola vykonaná pomocou súpravy jadra činidla SYBR Green PCR (Applied Biosystems, Warrington, Veľká Británia). Primery špecifické pre TAGLN boli nasledovné: 5 '- GAGCAAGCTGGTGAACAGCC-3 ' (horná), 5 '- GACCATGGAGGGTGGGT TCT-3 "(nižšia). Glyceral-dehyd-3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH) bol použitý ako referenčný endogénne. Jeho sekvencie boli 5 '- GGACCTGACCTGCCGTCT AG-3 ' (horná), 5 '- GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 ' (nižšie). QRT-PCR pre kvantifikáciu hladiny mRNA TAGLN bola vykonaná na prístroji ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Dáta boli analyzované za použitia porovnávacej metódy Ct. Špecifickosť výsledných produktov PCR bola potvrdená tavením kriviek.
Western blot
Bunky boli zozbierané a lyžovanie cicavčie proteín extrakčným činidlom (Pierce, Rockford, IL, USA). Koncentrácie proteínu boli stanovené pomocou kyseliny bicinchoninic (BCA) Protein Assay kitu (Pierce, Rockford, IL, USA). Vzorky obsahujúce 50 ug celkového proteínu bolo nanesené do každej dráhy 12% akrylamidového gélu v Minigel zariadení (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Separované proteíny boli prenesené na polyvinylidendifluoridovou (PVDF) membránu (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Potom, čo bol inkubuje sa s ním s primárnou protilátkou (1: 1000) a HRP-konjugovanou sekundárnou protilátkou (1: 5000). V tomto poradí, imunitný komplexy boli zistené zvýšené chemiluminiscenčná systém (ECL) (Millipore, Bedford, MA, USA)
Enzyme viazaná na imunosorbent (ELISA)
hladín proteínov z MMP-2 v supernatante boli merané pomocou ELISA (R &D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) podľa inštrukcií výrobcu
rast buniek. test
rôzne skupiny buniek (1 x 10 3) boli schovať do 96-jamkových doštičiek v troch vyhotoveniach. Počet životaschopných buniek bol stanovený s použitím denne Cell počítanie Kit (CCK-8) s využitím vysoko vo vode rozpustné tetrazoliové soli WST-8 [2- (2-metoxy-4-nitrofenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, monosodná soľ] (Dojindo, Japonsko). V stručnosti, 20 ul CCK-8 roztoku sa pridá do doštičky, absorbancia pri 450 nm bola meraná po 4 hodinách inkubácie.
Hodnotenie nádorové invázie a migrácie
invázie tumoru a migračného testu boli vykonané s QCMTM24 jamkami invázie kit (Millipore, Bedford, MA, USA) a QCMTM24-no migrácia kit (Millipore, Bedford, MA, USA), podľa protokolu dodaného výrobcom, resp. Pridať pripravenej suspenzie MKN-45 buniek (2 x 10 5 buniek /jamku) do hornej komory a pridať vopred suspenduje fibroblasty (5 x 10 4 buniek /jamku v médiu RPMI 1640 obsahujúcom 20% FBS) do dolná komora. TAGLN niektorých fibroblastov v dolných komorách bola inhibovaná pomocou siRNA 24 hodín neskôr. MKN-45 a fibroblasty boli spoločne kultivované non-contactedly po dobu 48 hodín, potom lysised bunky a určí hodnoty RFU čítačkou fluorescencie dosku pomocou nastavenia filtra 480/520 nm.
TAGLN siRNA
softvér bol použitý Qiagen navrhnúť RNAi sekvencie, zameraný na ľudské TAGLN (prístupové číslo NM_003186)., a siRNA sekvencie s najvyššou domnelé účinnosti (sense: 5 '- AAAUCGAGAAGAAGUAUGAdtdt-3 ", antisencie: 5 ' - UCAUAC UUCUUCUCGAUUUdtdt -3 ") bol syntetizovaný Shanghai génoch Co., Ltd. siRNA s náhodnom poradí (sense: 5 '- UUCUCCGAACGUGUCACG uTT-3 ', nezmyselné: 5 '- ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 "), a to bez náhrady génu (miešaná siRNA skupina) bol transfekován ako vnútornej kontroly. Pre experimenty boli bunky transfekovány s DOTAP lipozomálny transfekčního činidla (Roche, Nemecko). Bunky boli nasadené v množstve 2 x 10 5 buniek /jamka v 6-jamkových doštičkách. Po 24 hodinách, keď bunky boli vo fáze rastu log, 250 ul Opti-MEM I sa zmieša s 5 ul 20 uM duplexu siRNA, zatiaľ čo ďalších 250 ul Opti-MEM I sa zvlášť inkubuje sa s ním s 11,88 ul DOTAP lipozómov. Obe zmesi boli jemne zmiešané a inkubované po dobu asi 30 minút pri teplote miestnosti. Pre transfekciu, celá zmes sa pridá do každej jamky 1,5 ml čerstvého média bez antibiotík. Konečná koncentrácia transfekované siRNA bola 20 nM. Bunky boli odobraté pre ďalší test po 24, 48 a 72 hodín po transfekciu.
Želatína zymografií
Supernatanty kultúr boli zozbierané po 24 hodín a zmieša so vzorkou gél pufru (0,5 M Tris-HCl, glycerol, 10% dodecylsulfát sodný [SDS], β-mercaptoetanolu a 0,5% brómfenolovej modro). Desať mikrogramov proteínu boli odobraté separáciou SDS-PAGE; SDS-PAGE gély obsahovali 0,1% želatíny (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Po elektroforéze boli gély premyjú v 50 mM Tris pufri s obsahom 2,5% Triton X-100. Gély sa inkubujú po dobu ďalších 24 hodín v inkubačnej kvapaliny (50 mM Tris-pufra [pH 7,6], 10 mM Cacia 2, a 200 mM NaCl). Gély boli zafarbené 0,5% Coomassie blue, biele pásy (72 kDa) na modrom pozadí je uvedené zóny trávenie zodpovedajúce prítomnosti MMP-2.
Mouse Model
Balb /c nu /nu
nahých myší, vek-uzavreté medzi 4-5 týždne (Institute of zoológie Čínskej akadémie vied), boli umiestnení v určitom prostého patogénov prostredie v Animal Laboratory Unit, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Čína. Fibroblasty a MKN-45 boli zmiešané v pomere 1: 4 v 0,1 ml PBS a podať do laterálnej chvostovej žily. Šesť myší boli zahrnuté v každej skupine vo všetkých experimentoch, a každý experiment bol vykonaný dvakrát. Zvieratá boli zabité a pľúcna metastatické uzliny boli zaznamenané 6 týždňov po implantácii nádorových buniek. Vzorky nádorov boli zhromaždené, zmiešané vo formalínu, vložené do parafínu, a podrobí sa H &E farbenie. P Hotel < Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Co-výskyt rôznych mozgových infarktov v dôsledku hyperkoagulability spojenú s malignitou a meningeálnej karcinosou ako počiatočný manifestáciu karcinómu žalúdka
• Má žalúdočné tonometria vedená terapia znížiť celkové úmrtnosti u kriticky chorých pacientov?