Stromale fibroblaster i mikromiljøet af gastriske carcinomer fremme tumormetastase via opregulering TAGLN ekspression

Stromale fibroblaster i mikromiljøet af gastriske carcinomer fremme tumormetastase via opregulering TAGLN ekspression
Abstract
Baggrund
fibroblaster spiller en kritisk rolle i tumorigenese, tumor progression og metastase. Men deres detaljerede molekylære karakteristika og klinisk betydning er stadig undvigende. TAGLN er en actin-bindende protein, der spiller en vigtig rolle i tumorigenese. Search Results
Vi undersøgte samspillet mellem cancerceller og tumor mikromiljø at bestemme, hvordan fibroblasterne fra human gastrisk karcinom lette tumorgenese gennem TAGLN. QRT-PCR og Western blot viste, at TAGLN ekspression blev opreguleret i gastriske carcinoma-associerede fibroblaster (CAFS), der fremmer gastrisk cancer cellemigration og invasion. Brug af små interfererende RNA (siRNA), fandt vi, at CAF forbedret tumormetastase gennem opreguleret TAGLN in vitro og in vivo. Ekspressionen af ​​matrixmetalloproteinase-2 (MMP-2) var signifikant lavere efter TAGLN knock-down af siRNA. TAGLN niveauer blev forhøjet i human gastrisk cancer stroma end normalt gastrisk stroma og i forbindelse med differentiering og lymfeknude metastaser af mavekræft.
Konklusion
CAF kan fremme mavekræft celle migration og invasion via opregulere TAGLN og TAGLN induceret MMP-2 produktion.
Nøgleord
TAGLN fibroblast mikromiljø Tumor metastaser Gastrisk karcinom Baggrund
gastrisk karcinom er den anden mest almindelige årsager til kræft dødsfald i verden, især i Asien [1, 2]. De fleste af mavecancerpatienter døde af tumortilbagevenden forårsaget af fjernmetastaser. Metastase er en multi-trins proces, hvorved cancerceller formidler fra den primære neoplasme og invadere omkringliggende væv og afstand organer, der involverer kræft celle motilitet, intravasation, transit i blodet eller lymfen og ekstravasation [3]. Denne proces afhænger stramt af det omgivende mikromiljø og tumor udvikling forudsætter en kontinuerlig krydstale mellem cancerceller og ekstracellulære mikromiljøer [4].
Transgelin (TAGLN, også kendt som SM22) er en actin tværbindende protein, der er involveret i calcium interaktioner og regulerer kontraktile egenskaber [5]. Det kan spille en rolle i celledifferentiation, cellemigration celleinvasion og matrix remodellering ved at stabilisere cytoskelettet gennem actinbinding [6, 7]. Overekspression af TAGLN protein er blevet observeret i carcinomer i mave, lever, og spiserøret, medens nedsatte niveauer af TAGLN mRNA er blevet observeret i bryst- og coloncancer-cellelinjer og primære tumorer [8].
Det er almindeligt accepteret, at tumor -stroma interaktioner spiller en vigtig rolle i tumor udvikling og progression. Stroma udgøres hovedsagelig af ekstracellulær matrix (ECM) og cellulære elementer, såsom fibroblaster [9, 10]. De cellulære bestanddele af stroma er godt anerkendt som havende en støttende rolle i carcinogenese [11, 12]. Disse stromale elementer handle på en synergistisk krydstale med kræftceller fra de primære steder for at opretholde kræft vækst og metastase [13, 14]. Tumoren stroma, der omtales som en "reaktiv stroma" er associeret med et forøget antal af fibroblaster, forstærkede kapillær densitet og afsætning af en ny ECM rig på type 1-collagen og fibrin [15]. Akkumulere beviser viser, at stromale celler, såsom fibroblaster har en mere dybtgående indflydelse på udviklingen og progressionen af ​​carcinoma end tidligere værdsat [15-17]. Salg Fibroblaster er velkendte for at spille roller ved tumorigenese og progression. Fibroblaster udtrykker vimentin, fibronectin, α-glat-muskel-actin (α-SMA), fibroblast overfladeprotein såvel som fibroblastiske markører. Carcinoma-associerede fibroblaster (CAF) aktiveres fibroblaster, biologisk forskellige fra fibroblaster stede i godartede mikromiljøer i flere vigtige aspekter [17, 18]. CAF er ikke passive tilskuere i tumorgenese og metastase, men bidrager aktivt til disse processer [19]. Vores viden om den rolle, hvile og aktiverede fibroblaster i kræft er stadig under udvikling. Her fokuserer vi på samspillet mellem kræftceller og deres mikromiljøer at undersøge, hvordan de fibroblaster isoleret fra humane gastriske carcinomer letter tumorigenese.
Resultater
udtryk for TAGLN opreguleres i gastrisk karcinom-associerede fibroblaster
karcinom associeret fibroblaster (CAFS), counterpart fibroblaster (CPFs) og normale fibroblaster (NFS) blev opnået fra primær vævskultur hjælp væv fra cancer-associerede regioner, ikke-cancer-associerede stroma og normal slimhinde henholdsvis. Vi verificerede derefter renheden af ​​de forskellige fibroblast populationer ved immunofarvning. Disse fibroblast populationer udtrykte høje levls af fibroblastiske markører, såsom vimentin, α-SMA og fibronectin. På den anden side har disse celler ikke udtrykke epiteliale markører, såsom cytokeratin (figur 1A). Disse data bekræftede renheden af ​​fiborblasts. Disse observationer indikerer, at de dyrkede celler var overvejende fibroblaster blev fremstillet med minimal kontaminering med andre celler. Figur 1 Ekspressionen af ​​TAGLN opreguleres i gastriske cancerassocierede fibroblaster. A: karakterisering af gastrisk fibroblaster (ICC). a1: vimentin, positiv. a2: α-SMA, positive. a3: fibronektin, positiv. a4: cytokeratin, negativ. Originale forstørrelser: × 200. Målestokke 100 uM. B: QRT-PCR-analyse af TAGLN i CAF, CPF og NF. *, P
< 0,05, ** P
< 0,01, i forhold til NF. C: Western blot analyse af TAGLN i CAF, CPF og NF, blev TAGLN udtryk niveau faldt successivt. D: fibroblaster vækstkurve blev bestemt ved CCK-8 assay CAF voksede quickier end de andre. E: CAF havde højere evne til at øge MKN-45 s migration evne end CPF og NF, ***, P
< 0,001 sammenlignet med MKN-45. F: CAF havde højere evne til at øge MKN-45 invasion evne end CPF og NF, *, P
< 0,05, ** P
< 0,01, sammenlignet med MKN-45.
MRNA og protein niveauer af TAGLN var lavere i CPFs og NFS forhold til CAF (figur 1B og C). Vi først viste, at CAF voksede markant mere end CPFs og NFS in vitro celleproliferation (figur 1D). Dernæst foretog vi celleinvasion og migration assay at teste, om invasionen og migration evne gastriske cancerceller ville blive styrket af fibroblaster. Forsøget blev designet til at undersøge virkningerne af stroma TAGLN, som blev udskilt af fibroblaster, på humane gastriske kræftceller. De interne niveauer af TAGLN i gastriske cancerceller kan forstyrre den eksperimentelle proces. Derfor har vi choosed MKN-45 cellelinie, fordi dens TAGLN ekspressionsniveauet var den laveste i syv gastrisk cancer cellelinier (SNU-1, AGS, NCI-N87, KATOIII, MKN-45, MKN-28 og SGC-7901; data ikke vist). Interessant, invasionen og migration evne MKN-45 steget i alle de tre grupper (cafeer, CPFs og NFS), og øget mest i gruppen med CAF (figur 1E og F). Købet af migration og invasive adfærd er en af ​​trin i den metastatiske proces.
CAF fremmer tumor metastase gennem opregulering TAGLN
For at undersøge effekten af ​​TAGLN i fibrobalsts, vi brugte RNAi til at vælte TAGLN udtryk. Cafeer, CPFs og NFS blev transficeret med TAGLN-specifik eller ikke-tavshed siRNA. RNA og protein blev opnået ved 24, 48 eller 72 timer efter transfektion blev TAGLN mRNA og proteinniveauer undersøgt ved QRT-PCR og Western blot. TAGLN mRNA og protein blev hæmmet betydeligt i celler behandlet med TAGLN-specifikke siRNA (figur 2A og B). Figur 2 CAF forbedre tumorcellelinie MKN-45 migraton og invasion gennem opreguleres TAGLN. A: TAGLN ekspression ved QRT-PCR-analyse efter siRNA knockdown i fibroblaster. B: TAGLN ekspression ved Western blot-analyse efter siRNA knockdown i fibroblaster. C: cellemigrationsassay in vitro (fibroblaster med eller uden TAGLN siRNA interferens). D: celleinvasion assay in vitro (fibroblaster med eller uden TAGLN siRNA interferens). Værdier repræsenterer middel ± SD fra mindst tre separate forsøg, hver udført in triplo. *, P
< 0,05, ** P
< 0,01, ***, P
< 0,001 ved envejs variansanalyse (ANOVA).
Vi næste undersøgt, om invasionen og migration evne mavekræft celler vil blive styrket ved ekspression af TAGLN i fibroblaster, vi udført celle invasion og migration assay in vitro . Fibroblasterne og MKN-45 var ikke-contactedly samdyrket. Interessant, invasionen og migration evne MKN-45 faldt straks i gruppen med CAF og faldt lidt i gruppen med CPFs og NFS. Resultaterne viste, at invasionen og migration evne MKN-45 kan falde gennem nedregulering af ekspressionen af ​​TAGLN (figur 2C og D).
For at vurdere bidraget af CAF-TAGLN til tumormetastase in vivo, vi emplyed en xenograft model. Vi blandede TAGLN siRNA CAF, ikke-lyddæmpet CAF, CPFs og NFS med MKN-45 humane gastriske kræftceller i en 2: 1-forhold eller MKN-45 alene og podes disse celler gennem hale intravenøs injektion i immundefekte nøgne mus. Efter 6 uger, MKN-45 blandet med CAF genereret mere lunge metastatiske knuder end MKN-45 blandet med TAGLN siRNA CAF, CPFs og NFS, ligner MKN-45 blandet med ikke-tavshed siRNA CAF (tabel 1). Disse data antydede, at CAF udviser en forøget evne til at stimulere tumormetastase (figur 3A og B). Alle observationer indikerede, at i nærvær af CAF, tumorer blev mere aggressiv, hvilket antyder, at CAF kunne spille roller i fremme metastase i gastrisk cancer. Figur 3 TAGLN forbedrer tumormetastase gennem human tumor xenograft model in vivo. A: nøgne mus metastatiske knuder i lungerne. a1: lunge metastatiske knuder fra tomur-bærende mus. Pil: metastatisk knude. a2: nej metastatisk knude i lungen. a3: H &E farvning for lunge metastatisk knude under lyse-felt mikroskop. Scale barer, 200 um. a4: H &E farvning for lunge uden metastatisk knude under lyse-felt mikroskop. Scale barer, 200 um. B: kvantificering af nøgne mus lung metastatiske knuder i forskellige grupper gennem halen intravenøs injektion. *, P
< 0,05 ved envejs variansanalyse (ANOVA).
Tabel 1 nøgne mus lung metastatiske knuder i forskellige grupper gennem halen intravenøs injektion (Hver gruppe indeholdt 6 mus) Salg grupper
TAGLN siRNA CAF -MKN45
ikke-tavshed siRNA CAF-MKN45
CAF-MKN45
CPF-MKN45
NF-MKN45
MKN45 alene
Antal tumor-bærende mus
2
5
5
3
2
2
Antal metastatiske knuder
2
10
9
5
3
2
TAGLN fremmer tumor metastase ved opregulering MMP-2
Mange undersøgelser har fokuseret på rollen som matrixmetalloproteinaser (MMP'er) til invasionen af ​​omgivende bindevæv og metastase af tumorceller fra den primære læsion til fjerne steder i tumorudvikling [20, 21]. I vores tidligere arbejde, vi undersøgte MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 og MMP-9 niveauer efter TAGLN knock-down af siRNA gennem ELISA, kun MMP-2 niveau var signifikant nedreguleret, andre MMP niveauer viste ingen ændring. Derfor har vi focued på MMP-2 i dette studie. Som figur 4A viste, sammenlignet med MKN-45 co-coultured med CAF /neg og CAF /mock, MMP-2-niveauer i supernatant fra MKN-45 co-dyrket med CAF /siTAGLN blev undertrykt signifikant. Vi undersøgte dernæst aktiviteten af ​​MMP-2 ved anvendelse af gelatinezymografi assay. Vi fandt MMP-2-aktivitet blev dramatisk inhiberet i supernatant fra MKN-45 co-dyrket med CAF /siTAGLN end med CAF /neg og CAF /mock (figur 4B). Således kan TAGLN forbedre tumormetastase gennem MMP-2 enzymer nedbryder basalmembraner (f.eks. Collagen IV). Figur 4 TAGLN forbedrer tumormetastase ved opreguleret MMP-2. A: MMP-2-ekspression i CAF decresed naturligvis efter TAGLN RNAi ved ELISA. *, P
< 0,05 ved envejs variansanalyse (ANOVA). Fejlsøjler skildrer standardfejlen omkring gennemsnittet. B:. Knockdown TAGLN forringet evne CAF til hemmelige MMP-2 ved gelatinezymografi
TAGLN udtryk i human gastrisk kræft og dens tilknytning til differentiering i mavecancerpatienter
At evaluere TAGLN udtryk i mavekræft, TAGLN immunfarvning i 98 primære gastrisk cancer væv blev undersøgt. TAGLN ekspression blev opreguleret i human gastrisk cancer stroma forhold til normal gastrisk væv (figur 5A: normal gastrisk væv, figur 5B: mavekræft væv). Korrelationen af ​​TAGLN udtryk med de klinisk-patologiske træk blev vist i tabel 2. TAGLN niveauer var højere i udifferentierede tumorer (dårligt differentierede adenokarcinomer, signetring celle carcinomer og mucinøse karcinomer) end at i differentierede dem (godt og moderate adnocarcinomas) (P
= 0,003). Desuden blev TAGLN niveauer korreleret med lymfeknudemetastaser (P
= 0,029). Der var ingen signifikante forskelle i tumor TAGLN udtryk i overensstemmelse med de øvrige klinisk-patologiske funktioner såsom køn, alder, tumorstørrelse, Lauren klassificering, T scenen, afstand metastase og TNM stadie (P
≥ 0,05). Figur 5 Ekspression af TAGLN i humane gastriske cancer væv. A: TAGLN udtryk niveau i normalt gastrisk væv ved IHC. Målestokke 100 uM. B: TAGLN overudtrykkes i stroma af human gastrisk cancer ved IHC. Målestokke 100 uM. C: TAGLN mRNA opreguleres i human gastrisk cancer analyseret ved QRT-PCR. D: TAGLN protein opreguleres i human gastrisk cancer analyseret ved Western-blot. Værdier repræsenterer middel ± SD fra mindst tre separate forsøg, hver udført in triplo. *, P
< 0,001 ved paried-prøver T
test.
Tabel 2 klinisk-patologisk sammenslutninger af TAGLN udtryk i mavekræft
Antal sager
TAGLN immunfarvning
P

Svag (+)
Strong (++)
Køn
0,778
Mand
60
27
33
Female
38
16
22
Age
0,739
≤60y
46
21
25
> 60Y
52
22
30
Tumor størrelse
0,852
≤5 cm
58
25
33
> 5 cm
40
18
22
Differentiering
0,003
Nå + Moderat
46
13
33
Dårlig
52
30
22
Lauren klassificering
0,059
Intestinal
40
13
27
Diffus
58
30
28
T etape
0,142
T1 + T2
56
21
35
T3 + T4
42
22
20
lymfeknudemetastase
0,029
N0
27
11
16
N1
32
15
17
N2
26
7
19
N3
13
10
3
fjernmetastaser
0,709
Uden
95
42
53
Med
3
1
2
TNM stadie
0,722
jeg
20
7
13
II
25
11
14
III
30
10
20
IV
23
15
8
også, vi brugte QRT-PCR og Western blot for at evaluere udtrykket af TAGLN i gastrisk cancer væv (Figur 5C og D). Disse resultater antydede, at TAGLN udtryk i mavekræft væv var meget højere i mavekræft end i parrede normale væv.
Diskussion
Akkumulerende beviser viser, at kræft initiering og progression involverer interaktioner mellem både tumor og stromale celler. Tumorceller kan aktivt rekruttere stromale celler, såsom vaskulære celler, glatte muskelceller og fibroblaster, i tumoren, hvorved der genereres mikromiljø til at fremme tumorvækst [16, 22, 23]. Fibroblaster udgør ofte størstedelen af ​​de stromale celler i en gastrisk karcinom, men de funktionelle bidrag fra disse celler til tumorigenese og tumormetastase forbliver dårligt forstået.
TAGLN er en af ​​de tidligste markører af glat muskulatur differentiering under embryogenese [24], og tidligere undersøgelser vedrørende TAGLN hovedsageligt fokuseret på glatte muskelceller [25]. Patologiske tilstande ledsaget med vævsomdannelse og fibrogenese, såsom sårheling og neoplastiske læsioner er kendetegnet ved fremkomsten af ​​stromaceller med ultrastrukturelle træk mellemliggende mellem værdierne for typiske fibroblaster og dem af glatte muskelceller. Disse fibroblaster udviser fænotypiske og funktionelle træk ved glatte muskelceller og dermed er opkaldt myofibroblaster [26], såsom CAF. I vores undersøgelse blev TAGLN overekspression også observeret i CAF. Det er rapporteret, at TAGLN proteinet er overudtrykt i gastrisk cancer når proteinekspression spektrum af mavekræft blev analyseret ved anvendelse todimensional gelelektroforese (2-DE) [27]. Endvidere TAGLN protein er en af ​​de to tumorassocierede antigener der blev identificeret i serum fra nyre carcinom patienter ved Klade anvendelse af 2-DE [28]. Disse rapporter er i overensstemmelse med resultaterne, som vi har observeret ved hjælp af real-time PCR og Western Blot. Interessant fandt vi, at TAGLN hovedsagelig blev påvist i fibroblaster afledt fra tumor stroma, snarere end i tumorceller. Tilsvarende andre forskere opdaget, at TAGLN ikke udtrykkes i de maligne celler, men i mesenkymale celler i tumorstroma [27]. Salg stromacellers fibroblaster regulere endotel- eller epitelcelle adfærd gennem direkte og indirekte celle-cel1 interaktioner. Aktivering af værtens stroma1 mikromiljø menes at være et kritisk trin i tumorvækst og progression [13, 29]. Proteiner udskilt af stromal celle i tumorerne kan positivt eller negativt påvirke tumorprogression. De mest fremtrædende virkninger af TAGLN kan begunstige tumorcellemotilitet og invasion [7, 30, 31]. Vi fandt, at TAGLN var signifikant forøget i lymfeknudemetastaser gruppen end lymfeknude negative gruppe. At c1arify rolle TAGLN i stromale fibroblaster under mavekræft tumorgenese og metastase, vi tavshed den TAGLN udtryk i menneskelige CAF. Det blev oplyst, at kun MKN-45 co-dyrket med CAF udtrykker højt niveau TAGLN udviste meget højere invasion og migration evne. Fibroblaster som TAGLN var blevet slået ned ikke vise denne funktion. Tilsammen foreslår vi, at TAGLN kunne være ansvarlig for en styrkelse af mavekræft celle metastase via stromale celler såsom CAF.
TAGLN udtryk øges betydeligt i gastrisk CAF. CAF med øget TAGLN ekspressionsniveauer kan forstærke tumorcelleinvasion og migration evne, som fremmer en forøget ekspression af MMP-2. Stimuleringen af ​​MMP-ekspression i fibroblaster enten efter direkte kontakt med tumorceller eller efter kontakt med tumorcelle-afledte opløselige faktorer fra tumorer, der stammer fra epitelceller er blevet vist i adskillige undersøgelser [32-35]. Afklaring de underliggende mekanismer kan derfor svække tumor tilbagefald og metastaser i mavecancerpatienter.
Konklusioner
Sammenfattende vores undersøgelse viser, at CAF kan fremme mavekræft celle migration og invasion via øget MMP-2 produktion forårsaget af TAGLN opregulering .
Metoder
Vævsprøver
i alt 40 par af kræft væv og tilsvarende normal slimhinde for QRT-PCR og Western blot og 98 primære gastrisk kræft for immunfarvning blev indsamlet fra kirurgisk fjernet mavekræft diagnosticeret ved Institut of Surgery, Ruijin hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Normale mucosa-prøver blev taget fra margenen af ​​resektion hvor tumorerne placeret i det mindste over 6 cm afstand fra det. Denne undersøgelse protokol blev godkendt af uafhængige etiske komité af Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong Universitet, School of Medicine. Det informerede samtykke blev skrevet. Alle prøver blev lynfrosset i flydende nitrogen natten over og holdes ved -80 ° C før brug. 4% formaldehyd-fikserede vævssnit af både tumor og slimhinde blev farvet med H &E og undersøgt og verificeret histopatologisk ved to patologer. Hver prøve blev tilskrevet en diagnose og scorede for Lauren klassificering, differentiering, pTNM fase. Tumor størrelse, placering og andre kliniske patologiske karakteristika blev opnået fra kliniske poster med patient tilladelse
Cellelinjer
mavekræft cellelinjer SNU-1 (ATCC: CRL-5971)., AGS (ATCC: CRL-1739), NCI-N87 (ATCC: CRL-5822) og KATOIII (ATCC: HTB-103) blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Yderligere 3 gastrisk cancer cellelinjer, MKN-45, MKN-28 og SGC-7901, blev bevaret på vores institut. Alle cellelinier blev holdt i RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS).
Antistoffer Salg primære antistoffer, der anvendes til farvning inkluderet humant specifikt anti-vimentin (Abcam, Cambridge, UK), anti-fibronectin ( Abcam, Cambridge, UK), anti-α-glat-muskel-actin (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA), anti-pan-cytokeratin (Abcam, Cambridge, UK), anti-SM22 (Abcam, Cambridge, UK) og muse-anti-GAPDH (Kangchen, Kina).
Isolering af humane gastriske fibroblaster
fibroblaster blev isoleret fra cancerrelaterede og ikke-cancer-associerede regioner af gastriske væv dissekeret fra patienter med mavekræft under radikal gastrisk resektion fra Department of Surgery, Ruijin hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medcine. De cancerassocierede regioner blev udvalgt til at være minimalt nekrotiske områder af tumormassen. Ikke-cancer-associeret stroma, som blev isoleret fra væv mindst 2 cm distalt for den ydre margen af ​​kræft masse. Normale mucosa-prøver blev taget fra margenen af ​​resektion hvor tumorerne placeret i det mindste over 6 cm afstand fra det. Væv blev hakket i organoids på ca. 1 mm 3 og podet på ikke-overtrukket plastmateriale i RPMI 1640 medium indeholdende human basisk fibroblastvækstfaktor, 20% føtalt kalveserum (FCS) og penicillin og streptomycin som antibiotika. Disse betingelser frembragte en homogen fibroblastisk cellepopulation efter 7 dages dyrkning. Hver fibroblast blev derefter udvidet med en 1: 3-forhold ved trypsin-EDTA i 10 cm petriskåle. Vi anvendte fibroblaster passeret for op til 8 populationsfordoblinger (PDS) for efterfølgende forsøg, for at minimere klonselektion og kultur stress, som kunne forekomme under forlænget vævskultur.
Immunohistokemisk farvning (IHC)
Celler eller væv blev fikseret i 30 minutter med 4% formalin og skyllet med phosphatbufret saltvand (PBS). Efter endogen peroxidaseaktivitet blev standset med 0,3% H 2O 2 blev celler blokeret med normalt immunt serum i 30 min forud for at blive inkuberet med primært antistof ved 37 ° C i 2 timer. Celler eller væv blev derefter mærket med streptavidin-biotin-peberrodsperoxidase-farvning kit (Dako, Carpinteria, CA, USA). Tilstedeværelsen af ​​mærket peroxidase på sektionerne blev visualiseret ved inkubation med 3,3 '- diaminobenzidin, DAB + substrat chromogen og blev snittene modfarvet med hematoxylin. Negative kontrolglas blev udført ved udeladelse af det primære antistof.
TAGLN ekspression blev vurderet ved intensiteten af ​​farvede celler, og bestemt i to kategorier (svagt positive og stærkt positive). Den farvningsintensitet blev klassificeret i fire grader (intensitet scores): Ingen farvning (grad 0), lysebrun farvning (grad 1), brun farvning (grad 2), og mørkebrune farvning (grad 3). Grade 0 og grad 1 blev defineret som svagt positive, var grad 2 og grad 3 defineret som stærkt positivt.
Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR)
Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. cDNA blev opnået med 1 ug RNA ved anvendelse Reverse Transcription System Kit (Promega, Madison, WI, USA) og QRT-PCR blev udført af SYBR Green PCR core reagenskittet (Applied Biosystems, Warrington, UK). Primere specifikke for TAGLN var som følger: 5 '- GAGCAAGCTGGTGAACAGCC-3 ' (øverst), 5 '- GACCATGGAGGGTGGGT TCT-3 ' (lavere). Glyceral-dehyde-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som det endogene reference. Dens sekvenser var 5 '- GGACCTGACCTGCCGTCT AG-3 ' (øverst), 5 '- GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 ' (lavere). QRT-PCR til kvantificering af mRNA-niveauer af TAGLN blev udført på en ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Data blev analyseret ved anvendelse af den sammenlignende Ct-metoden. Specificitet af resulterende PCR-produkter blev bekræftet ved smeltekurver.
Western blot
Celler blev høstet og lyseret med pattedyrprotein ekstraktion reagens (Pierce, Rockford, IL, USA). Proteinkoncentrationer blev bestemt med et bicinchoninsyre (BCA) proteinassaykit (Pierce, Rockford, IL, USA). Prøver indeholdende 50 ug totalt protein blev påsat hver bane på 12% acrylamidgel i en minigel apparat (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). De separerede proteiner blev overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Efter at være blevet inkuberet med primært antistof (1: 1.000) og HRP-konjugeret sekundært antistof (1: 5000). Fik henholdsvis immunkomplekser detekteres af forstærket kemiluminescerende (ECL) systemet (Millipore, Bedford, MA, USA)
Enzyme -forbundet immunosorbent assay (ELISA)
den proteinniveauer af MMP-2 i supernatanterne blev målt ved et ELISA-kit (R &D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) ifølge producentens instruktioner
cellevækst. assay
De forskellige grupper af celler (1 x 10 3) blev podet i plader med 96 brønde i tre eksemplarer. Antallet af levedygtige celler blev bestemt dagligt ved anvendelse af Cell Counting Kit (CCK-8) ved at anvende en yderst vandopløseligt tetrazoliumsalt WST-8 [2- (2-methoxy-4- nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, mononatriumsalt] (Dojindo, Japan). Kort beskrevet blev 20 pi CCK-8 tilsat til plader, blev absorbansen ved 450 nm målt efter 4 timer inkubation.
Vurdering af tumorinvasion og migration
Tumor invasion og migration assay blev udført med QCMTM24-brønd invasion kit (Millipore, Bedford, MA, USA) og QCMTM24-brønd migration kit (Millipore, Bedford, MA, USA) ifølge protokollen tilvejebragt af producenten hhv. Tilføj forberedt MKN-45 cellesuspension (2 × 10 5 celler /brønd) til det øvre kammer og tilføje pre-suspenderet fibroblaster (5 x 10 4 celler /brønd i RPMI 1640 medium indeholdende 20% FBS) til det nedre kammer. Den TAGLN af nogle fibroblaster i nedre kamre blev inhiberet under anvendelse af siRNA 24 timer senere. MKN-45 og fibroblaster blev co-dyrket ikke-contactedly i 48 timer, derefter lysised cellerne og bestemmes RFU værdier med en fluorescenspladelæser ved anvendelse 480/520 nm filtersæt.
TAGLN siRNA
Qiagen software blev anvendt at designe RNAi sekvenser rettet mod humant TAGLN (accessionsnr NM_003186.), og den siRNA-sekvens med den højeste formodede effekt (sense: 5 '- AAAUCGAGAAGAAGUAUGAdtdt-3 ', antisense: 5 '- UCAUAC UUCUUCUCGAUUUdtdt -3 «) blev syntetiseret af Shanghai GeneChem Co, Ltd siRNA med randomiserede sekvens (forstand: 5 '- UUCUCCGAACGUGUCACG UTT-3 ', antisense: 5 '- ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 «) mod ingen gen (krypteret siRNA gruppe) blev transficeret som intern kontrol. Til forsøg blev celler transficeret med DOTAP liposomal transfektionsreagens (Roche, Tyskland). Celler blev podet ved 2 × 10 5 celler /brønd i 6-brønds plader. Efter 24 timer, når cellerne var i fasen med log vækst, 250 pi Opti-MEM I blev blandet med 5 pi 20 pM siRNA duplex, mens en anden 250 pi Opti-MEM I separat inkuberet med 11,88 pi DOTAP liposom. De to blandinger blev forsigtigt blandet og inkuberet i ca. 30 minutter ved stuetemperatur. Til transfektion blev hele blandingen tilsat til hver brønd i 1,5 ml frisk medium uden antibiotika. Den endelige transficerede koncentration af siRNA var 20 nM. Celler blev opsamlet til yderligere analyse ved 24, 48 og 72 timer efter transfektion.
Gelatinezymografi
Kultursupernatanterne blev høstet ved 24 timer og blandet med en gel prøvebuffer (0,5 M Tris-HCI, glycerol, 10% natriumdodecylsulfat [SDS], β-mercaptoethanol og 0,5% bromphenolblåt). Ti mikrogram protein blev taget ved SDS-PAGE separation; SDS-PAGE-geler indeholdt 0,1% gelatine (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Efter elektroforese blev gelerne vasket i 50 mM Tris-buffer indeholdende 2,5% Triton X-100. Gelerne blev inkuberet i yderligere 24 timer i inkubation væske (50 mM Tris-buffer [pH 7,6], 10 mM CaCI 2, og 200 mM NaCl). Gelerne blev farvet med 0,5% Coomassie blue, hvide bånd (72 kDa) på en blå baggrund angivne zoner af fordøjelse svarende til tilstedeværelsen af ​​MMP-2.
Musemodel
BALB /c nu /nu
nøgne mus, alder-matchede mellem 4-5 uger (Institut for Zoologi Chinese Academy of Sciences), blev huset i en SPF-miljø i Animal Laboratory Unit, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Kina. Fibroblaster og MKN-45 blev blandet i forholdet 1: 4 i 0,1 ml PBS og injiceret i den laterale halevene. Seks mus blev inkluderet i hver gruppe i alle forsøg, og hvert forsøg blev udført to gange. Dyr blev aflivet, og lungerne metastatiske knuder blev registreret 6 uger efter tumorcelleimplantation. Tumorprøver blev opsamlet, blandet i formalin, indlejret i paraffin, og udsat for H &E farvning. P
< Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Co-forekomst af flere cerebrale infarkter grund hyperkoagulabilitet forbundet med malignitet og meningeal carcinomatose som den første manifestation af gastrisk cancer
• Er gastrisk tonometri-vejledt terapi reducere det samlede dødelighed i kritisk syge patienter?