los fibroblastos del estroma en el microambiente de los carcinomas gástricos promover la metástasis de tumores a través de la regulación positiva de TAGLN expression

fibroblastos del estroma en el microambiente de los carcinomas gástricos promover la metástasis de tumores a través de la regulación positiva de la expresión TAGLN
Abstract
Antecedentes
Los fibroblastos desempeñan un papel crítico en la tumorigénesis, tumor la progresión y la metástasis. Sin embargo, sus características moleculares detallados y significación clínica siguen siendo difícil de alcanzar. TAGLN es una proteína de unión a actina que juega un papel importante en la tumorigénesis.
Resultados
Se investigó la interacción entre las células cancerosas y el microambiente tumoral para determinar cómo los fibroblastos de carcinoma gástrico humano facilitan la tumorigénesis a través de TAGLN. QRT-PCR y Western blot indican que la expresión TAGLN se upregulated en fibroblastos de carcinoma asociado gástricas (CAF) que promueven la migración de células de cáncer gástrico y la invasión. El uso de pequeños ARN de interferencia (siRNA), se encontró que los CAF mejoran la metástasis del tumor a través TAGLN upregulated in vitro e in vivo. La expresión de metaloproteinasas de matriz-2 (MMP-2) fue significativamente menor después de TAGLN knock-down de siRNA. niveles TAGLN fueron elevados en estroma cáncer gástrico humano que estroma gástrico normal y asociados con la diferenciación y la metástasis de los ganglios linfáticos de cáncer gástrico.
Conclusión
CAF pueden promover la migración de células de cáncer gástrico y la invasión a través de la regulación positiva de TAGLN y TAGLN inducidos MMP-2 producción.
Palabras clave
TAGLN fibroblastos microambiente tumoral metástasis de carcinoma gástrico Antecedentes
carcinoma gástrico es la segunda causa más común de muerte por cáncer en el mundo, especialmente en Asia [1, 2]. La mayoría de los pacientes con cáncer gástrico murieron a causa de la recurrencia del tumor causado por metástasis a distancia. La metástasis es un proceso multi-etapa en la que células de cáncer de difundir de la neoplasia primaria e invaden los tejidos circundantes y la distancia órganos, con la participación de la motilidad de células de cáncer, intravasación, el tránsito en la sangre o la linfa y la extravasación de [3]. Este proceso depende fuertemente en el microambiente circundante y el desarrollo del tumor se basa en una diafonía continua entre las células cancerosas y microambientes extracelulares [4].
Transgelin (TAGLN, también conocido como SM22) es una proteína de reticulación de actina que está implicado en las interacciones de calcio y regula las propiedades contráctiles [5]. Se puede jugar un papel en la diferenciación celular, la invasión celular y migración celular remodelación de la matriz mediante la estabilización de la actina del citoesqueleto a través de la unión [6, 7]. La sobreexpresión de la proteína TAGLN se ha observado en los carcinomas de estómago, el hígado, y el esófago, mientras que si el se han observado niveles de ARNm TAGLN en líneas celulares de mama y cáncer de colon y tumores primarios [8].
Es generalmente aceptado que el tumor interacciones -stroma juegan un papel importante en el desarrollo y progresión del tumor. El estroma está constituida principalmente de la matriz extracelular (ECM) y elementos celulares, tales como fibroblastos [9, 10]. Los componentes celulares del estroma son bien reconocidos como teniendo un papel de apoyo en la carcinogénesis [11, 12]. Estos elementos del estroma actúan de una diafonía sinérgico con células de cáncer de los sitios primarios para sostener el crecimiento y la metástasis del cáncer [13, 14]. El estroma del tumor que se conoce como un "estroma reactivo" se asocia con un aumento del número de fibroblastos, la densidad capilar mejorada y la deposición de un nuevo ECM rico en tipo-1-colágeno y fibrina [15]. La acumulación de pruebas revela que las células estromales, tales como fibroblastos tienen una más profunda influencia en el desarrollo y progresión del carcinoma de lo que se apreció anteriormente [15-17].
Fibroblastos son bien conocidos por jugar un papel en la tumorigénesis y progresión. Los fibroblastos expresan vimentina, fibronectina, la actina α-músculo liso (α-SMA), proteína de la superficie de los fibroblastos, así como marcadores de fibroblasto. fibroblastos de carcinoma asociada (CAF) Los fibroblastos son activados, biológicamente diferentes a partir de fibroblastos presentes en microambientes benignas en varios aspectos importantes [17, 18]. CAF no son espectadores pasivos en la tumorigénesis y metástasis, sino que contribuyen activamente a estos procesos [19]. Nuestro conocimiento sobre el papel de los fibroblastos en reposo y activadas en el cáncer está todavía en evolución. Aquí, nos centramos en la interacción entre las células cancerosas y sus microambientes para estudiar cómo los fibroblastos aislados de carcinomas gástricos humanos facilitan la tumorigénesis.
Resultados
La expresión de TAGLN es upregulated en fibroblastos de carcinoma gástrico asociado a Francia El carcinoma fibroblastos -asociado (CAF), fibroblastos de contrapartida (CPF) y fibroblastos normales (NFS) se obtuvieron a partir de cultivo de tejidos primarios utilizando tejidos de las regiones asociadas con el cáncer, estroma no asociado a cáncer y mucosa normal, respectivamente. a continuación, se verificó la pureza de las distintas poblaciones de fibroblastos por inmunotinción. Estas poblaciones de fibroblastos expresaron altos levls de marcadores fibroblásticas tales como la vimentina, α-SMA y fibronectina. Por otra parte, estas células no expresan marcadores epiteliales, tales como la citoqueratina (Figura 1A). Estos datos confirmaron la pureza de los fiborblasts. Estas observaciones indican que las células del cultivo fueron predominantemente fibroblastos se prepararon con una contaminación mínima por otras células. Figura 1 La expresión de TAGLN está regulada positivamente en los fibroblastos asociados con el cáncer gástrico. R: caracterización de los fibroblastos gástricos (ICC). A1: vimentina, positivo. a2: α-SMA, positivo. a3: fibronectina, positivo. a4: citoqueratina, negativo. magnificaciones originales: × 200. Las barras de escala, 100 m. B: Análisis de QRT-PCR de TAGLN en la CAF, la ACB y NF. *, P Hotel < 0,05, **, P Hotel < 0,01, en comparación con NF. C: Western blot de TAGLN en la CAF, la ACB y NF, TAGLN nivel de expresión se redujo sucesivamente. D: curva de crecimiento de fibroblastos se determinó por CCK-8 ensayo, CAF creció mas deprisa que los otros. E: CAF tuvo una mayor capacidad para mejorar la capacidad de migración de MKN-45 de la ACB y NF, ***, P Hotel < 0,001 en comparación con MKN-45. F: CAF tuvo una mayor capacidad para mejorar la capacidad de invasión de MKN-45 de la ACB y NF, *, P Hotel < 0,05, **, P Hotel < 0,01, en comparación con MKN-45. Comentario El mRNA y los niveles de proteína de TAGLN fueron más bajos en los MPP y las federaciones nacionales en comparación con los CAF (Figura 1B y C). En primer lugar, demostramos que los CAF crecieron significativamente más que los MPN y NFS en la proliferación celular in vitro (Figura 1D). A continuación, se llevó a cabo la invasión de células y ensayo de migración para probar si la capacidad de invasión y la migración de células de cáncer gástrico se vería reforzada por los fibroblastos. El experimento se diseñó para investigar los efectos de TAGLN estroma, que fue secretada por los fibroblastos, en células de cáncer gástrico humano. Los niveles internos de TAGLN en células de cáncer gástrico podrían interferir el proceso experimental. Por lo tanto, nos escogido MKN-45 línea celular, debido a que su nivel de expresión TAGLN fue el más bajo en siete líneas celulares de cáncer gástrico (SNU-1, AGS, NCI-N87, KATOIII, MKN-45, MKN-28 y SGC-7901; datos no mostrada). Curiosamente, la capacidad de invasión y migración de MKN-45 aumentó en todos los tres grupos (CAF, CPF y NFS), y aumentó más en el grupo con la CAF (Figura 1E y F). La adquisición de la migración y el comportamiento invasivo es uno de los pasos en el proceso metastásico.
CAF promueven la metástasis del tumor a través de la regulación positiva de TAGLN
Para examinar el efecto de TAGLN en fibrobalsts, se utilizó ARNi para derribar la expresión TAGLN. CAF, CPF y NFS se transfectaron con TAGLN-específica o no el silencio siRNA. RNA y proteína se obtuvieron a los 24, 48 o 72 horas después de la transfección, TAGLN ARNm y los niveles de proteína fueron investigados por QRT-PCR y Western blot. TAGLN ARNm y proteínas se inhibieron de manera significativa en las células tratadas con siRNA-TAGLN específico (Figura 2A y B). Figura 2 CAF mejorar la línea de células tumorales MKN-45 migraton y la invasión a través TAGLN upregulated. A: expresión TAGLN por QRT-PCR análisis después de siRNA desmontables en los fibroblastos. B: Expresión TAGLN por Western blot después de siRNA desmontables en los fibroblastos. ensayo de migración celular in vitro (fibroblastos con o sin la interferencia TAGLN siRNA): C. ensayo de células invasión in vitro (fibroblastos con o sin la interferencia TAGLN siRNA): D. Los valores representan la media ± SD de al menos tres experimentos separados, cada uno realizado por triplicado. *, P Hotel < 0,05, **, P Hotel < 0,01, ***, P Hotel < 0.001, mediante el análisis de una vía de la varianza (ANOVA).
A continuación se investigó si la capacidad de invasión y la migración de células de cáncer gástrico se verá reforzada por la expresión de TAGLN en los fibroblastos, se llevó a cabo la invasión celular y la migración de ensayo in vitro . Los fibroblastos y MKN-45 fueron co-cultivadas no contactedly. Curiosamente, la capacidad de invasión y migración de MKN-45 disminuyó de inmediato en el grupo con CAF y disminuyó ligeramente en el grupo con la CPF y NFS. Los resultados mostraron que la capacidad de invasión y la migración de MKN-45 puede disminuir a través de abajo de la regulación de la expresión de TAGLN (Figura 2C y D).
Con el fin de evaluar la contribución de los CAF-TAGLN a la metástasis del tumor in vivo, se emplyed un modelo de xenoinjerto. Mezclamos TAGLN siRNA CAF CAF, no silenciada, CPF y NFS con MKN-45 células de cáncer gástrico humano en una proporción de 2: 1 o MKN-45 solos y se inocularon estas células a través de la inyección intravenosa de cola en ratones desnudos inmunodeficientes. Después de 6 semanas, MKN-45 mezclado con CAF generado más pulmonares nódulos metastásicos que MKN-45 mezclado con TAGLN siRNA CAF, CPF y NFS, similar a MKN-45 mezclado con el silencio no siRNA CAF (Tabla 1). Estos datos sugirieron que los CAF muestran una mayor capacidad para estimular la metástasis tumoral (Figura 3A y B). Todas las observaciones indicaron que en presencia de CAF, los tumores se volvieron más agresivo, lo que sugiere que los CAF podría jugar un papel en la promoción de la metástasis en el cáncer gástrico. Figura 3 TAGLN potencia la metástasis del tumor a través del modelo de xenoinjerto de tumor humano in vivo. A: ratones desnudos nódulos metastásicos en el pulmón. A1: pulmón nódulos metastásicos de ratón Tomur-cojinete. Flecha: nódulo metastásico. a2: hay nódulos metastásicos en el pulmón. a3: H & E tinción para Nódulo pulmonar metastásico bajo el microscopio de campo claro. Barras de escala, 200 m. a4: H & E tinción de pulmón sin nódulo metastásico bajo el microscopio de campo claro. Barras de escala, 200 m. B: cuantificación de los ratones desnudos pulmonares nódulos metastásicos en varios grupos a través de la inyección intravenosa de cola. *, P Hotel < 0.05, por un solo sentido el análisis de varianza (ANOVA).
Tabla 1 ratones desnudos pulmonares nódulos metastásicos en varios grupos a través de la inyección intravenosa de cola (Cada grupo contenía 6 ratones) Barcelona Grupos
TAGLN siRNA CAF -MKN45
no silencio siRNA CAF-MKN45
CAF-MKN45
CPF-MKN45
NF-MKN45
sola MKN45
Número de ratones portadores de tumores
2 5 página 5 página 3 página 2
2 Número de nódulos metastásicos
2 10 página 9 página 5 página 3
2 TAGLN promueve la metástasis tumoral mediante la regulación al alza de MMP-2
Muchos estudios se han centrado en el papel de las metaloproteinasas de matriz (MMP) a la invasión de los alrededores tejido conectivo y la metástasis de las células tumorales de la lesión primaria a sitios distantes en la progresión del tumor [20, 21]. En nuestro trabajo anterior, se analizó la MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 y MMP 9-niveles después TAGLN knock-down de siRNA través de ELISA, solamente MMP-2 nivel fue significativamente las reguladas, otras MMP niveles no mostraron cambios. Por lo tanto, focued en MMP-2 en este estudio. Como muestra la Figura 4A mostró, en comparación con MKN-45 co-coultured con la CAF /neg y la CAF /simulacro, los niveles de MMP-2 en el sobrenadante de MKN-45 co-cultivadas con CAF /siTAGLN fueron suprimidos de manera significativa. A continuación examinó la actividad de MMP-2 usando un ensayo de zimografía de gelatina. Encontramos la actividad de MMP-2 se inhibió de forma espectacular en el sobrenadante de MKN-45 co-cultivadas con CAF /siTAGLN que con CAF /neg y la CAF /simulacro (Figura 4B). Por lo tanto, TAGLN puede mejorar la metástasis del tumor a través de las MMP-2 enzimas degradan la membrana basal (por ejemplo, colágeno. IV). Figura 4 TAGLN potencia la metástasis tumoral por upregulated MMP-2. R: MMP-2 expresión en la CAF se redujo en promedio, obviamente, después de TAGLN RNAi por ELISA. *, P Hotel < 0,05 por análisis unidireccional de la varianza (ANOVA). Las barras de error representan el error estándar alrededor de la media. B:. Knockdown TAGLN deteriora la capacidad de CAF secreto MMP-2 por zimografía de gelatina expresión TAGLN
en el cáncer gástrico humano y su asociación con la diferenciación en los pacientes con cáncer gástrico
Para evaluar la expresión TAGLN en el cáncer gástrico, la inmunotinción TAGLN en 98 se examinaron tejidos de cáncer gástrico primario. expresión TAGLN se upregulated en el estroma cáncer gástrico humano en comparación con tejido gástrico normal (Figura 5A: tejido gástrica normal; Figura 5B: tejido de cáncer gástrico). La correlación de la expresión TAGLN con las características clínico-patológicas se muestra en la Tabla 2. Los niveles TAGLN fueron mayores en los tumores indiferenciados (pobremente diferenciados adenocarcinomas, carcinomas de células en anillo de sello y carcinomas mucinosos) que en los diferenciadas (así adnocarcinomas y moderados) (P
= 0,003). Por otra parte, los niveles de TAGLN se correlacionó con metástasis en los ganglios linfáticos (P = 0,029
). No hubo diferencias significativas en la expresión TAGLN tumoral de acuerdo con las otras características clínico-patológicas tales como el género, la edad, el tamaño del tumor, clasificación de Lauren, estadio T, metástasis a distancia y el estadio TNM (P
≥ 0,05). Figura 5 Expresión de TAGLN en tejidos de cáncer gástrico humano. A: nivel de expresión en el tejido TAGLN gástrica normal por IHC. Las barras de escala, 100 m. B: TAGLN se sobreexpresa en el estroma de cáncer gástrico humano por IHC. Las barras de escala, 100 m. C: TAGLN ARNm está regulada positivamente en el cáncer gástrico humano analizados por QRT-PCR. D: proteína TAGLN está regulada positivamente en el cáncer gástrico humano analizada por Western blot. Los valores representan la media ± SD de al menos tres experimentos separados, cada uno realizado por triplicado. *, P Hotel < 0,001 por paried T para muestras
prueba.
Tabla 2 asociaciones Clinicopathological de expresión en el cáncer gástrico TAGLN
Número de casos
TAGLN inmunotinción
P

débil (+)
fuerte (++) guía empresas Sexo Masculino
0.778

60
27
33
Mujer
38
16
22
Edad
0.739
≤60y
46
21
25 Hotel > 60y 52

22
30
tamaño del tumor
0.852
≤5 cm
58
25
33 Hotel > 5 cm
40
18
22
Diferenciación
0,003
Bien Moderado +
46 página 13
33
Pobre
52
30
22
clasificación de Lauren
0,059
intestinal
40 página 13
27
difuso
58
30
28
estadio T
0,142
T1 + T2
56
21
35
T3 + T4
42
22
20
metástasis de ganglios linfáticos
0,029
N0
27
11
16
N1
32
15
17
N2
26 página 7 página 19
N3 página 13
10
3
metástasis a distancia
0,709 Online Sin
95 42 53

Con Sims 3
1
2 estadio TNM
0,722
I
20 página 7 página 13
II
25 página 11 página 14
III
30
10
20
IV
23
15 página 8
Además, se emplearon QRT-PCR y Western blot para evaluar la expresión de TAGLN en tejidos de cáncer gástrico (Figura 5C y D). Estos resultados sugieren que la expresión TAGLN en tejidos de cáncer gástrico fue mucho mayor en el cáncer gástrico que la de los tejidos normales emparejados.
Discusión
La acumulación de pruebas demuestra que la iniciación y progresión del cáncer implican interacciones entre ambos tumor y las células del estroma. Las células tumorales pueden reclutar activamente células estromales, tales como células vasculares, células de músculo liso y fibroblastos, en el tumor, generando así microambiente para promover el crecimiento del tumor [16, 22, 23]. Los fibroblastos a menudo constituyen la mayoría de las células estromales dentro de un carcinoma gástrico, sin embargo, las contribuciones funcionales de estas células a la tumorigénesis y metástasis tumoral siguen siendo poco conocidos.
TAGLN es uno de los primeros marcadores de diferenciación del músculo liso durante la embriogénesis [24], y los estudios previos relacionados con TAGLN se centraron principalmente en las células musculares lisas [25]. condiciones patológicas acompañados con la remodelación de tejidos y la fibrogénesis, tales como la curación de heridas y lesiones neoplásicas, se caracterizan por la aparición de células estromales con características ultraestructurales intermedias entre las de los fibroblastos típicos y los de las células musculares lisas. Estos fibroblastos exhiben características fenotípicas y funcionales de las células musculares lisas y miofibroblastos, por tanto, son nombrados [26], como la CAF. En nuestro estudio, TAGLN sobreexpresión también se observó en los CAF. Se ha informado de que la proteína TAGLN se sobreexpresa en el cáncer gástrico cuando espectro expresión de la proteína de cáncer gástrico se analizó mediante electroforesis en gel de dos dimensiones (2-DE) [27]. Además, la proteína TAGLN es uno de los dos antígenos asociados a tumores que se identificaron en suero de pacientes de carcinoma de riñón por Klade usando 2-DE [28]. Estos informes son consistentes con los resultados que hemos observado usando PCR en tiempo real y Western Blot. Curiosamente, se encontró que TAGLN se detectó principalmente en fibroblastos derivados de estroma tumoral, en lugar de en las células tumorales. Del mismo modo, otros investigadores descubrieron que la TAGLN no se expresa en las células malignas, pero en las células mesenquimales del estroma tumoral [27].
Fibroblastos del estroma regulan endotelial o el comportamiento de las células epiteliales a través de interacciones directas e indirectas de células-CEL1. La activación del microambiente stroma1 anfitrión se piensa que es un paso crítico en el crecimiento del tumor y la progresión [13, 29]. Las proteínas secretadas por las células del estroma en los tumores pueden afectar positiva o negativamente la progresión del tumor. Las acciones más destacadas de TAGLN pueden favorecer la motilidad de las células tumorales y la invasión [7, 30, 31]. Se encontró que la TAGLN, fue significativamente superior en el grupo de metástasis en ganglios linfáticos negativos que el grupo de ganglios linfáticos. Para c1arify el papel de TAGLN en los fibroblastos del estroma durante la tumorigénesis y metástasis de cáncer gástrico, que silenció a la expresión TAGLN en los CAF humanos. Se indicó que sólo el MKN-45 co-cultivadas con CAF que expresan TAGLN alto nivel exhibido mucho mayor capacidad de invasión y la migración. Fibroblastos que TAGLN había sido derribado no mostraron esta función. Tomados en conjunto, sugerimos que TAGLN podría ser responsable de la mejora de la metástasis de las células de cáncer gástrico a través de las células del estroma, como CAF.
Expresión TAGLN es significativamente mayor en los CAF gástricos. CAF con el aumento de los niveles de expresión pueden aumentar TAGLN invasión de células tumorales y la migración capacidad que promueven una mayor expresión de MMP-2. La estimulación de la expresión de MMP en los fibroblastos, ya sea después del contacto directo con las células tumorales o después del contacto con los factores solubles derivados de células tumorales de los tumores procedentes de células epiteliales se ha demostrado en varios estudios [32-35]. Por lo tanto, evidencia los mecanismos subyacentes puede atenuar la recurrencia del tumor y la metástasis en pacientes con cáncer gástrico.
Conclusiones
En resumen, nuestro estudio demuestra que los CAF puede promover la migración de células de cáncer gástrico y la invasión a través de aumento de la producción de MMP-2 causados ​​por la regulación positiva TAGLN .
Métodos las muestras de tejido

un total de 40 pares de tejidos de cáncer y la mucosa normal para QRT-PCR y Western blot y 98 cánceres gástricos primarios para la inmunotinción correspondientes se obtuvieron de cáncer gástrico diagnosticado extirpado quirúrgicamente en el Departamento de Cirugía, Ruijin hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. muestras de mucosa normal se tomaron desde el margen de la resección en los tumores localizados al menos más de 6 cm de distancia de ella. Este protocolo de estudio fue aprobado por el comité de ética independiente del Hospital Ruijin, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine. El consentimiento informado por escrito. Todas las muestras se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido durante la noche y se mantuvieron a -80 ° C antes de su uso. 4% de formaldehído cortes de tejido fijados con tanto del tumor y la mucosa se tiñeron con H & E y examinaron y verificaron histopatológicamente por dos patólogos. Cada muestra se atribuye un diagnóstico y anotó para la clasificación de Lauren, la diferenciación, la etapa pTNM. El tamaño del tumor, la ubicación y otras características patológicas clínicas se obtuvieron de la historia clínica del paciente con permiso de líneas celulares
líneas celulares de cáncer gástrico SNU-1 (ATCC: CRL-5971)., AGS (ATCC: CRL-1739), NCI-N87 (ATCC: CRL-5822) y KATOIII (ATCC: HTB-103) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Otras 3 líneas celulares de cáncer gástrico, MKN-45, MKN-28 y SGC-7901, se conservaron en nuestro instituto. Todas las líneas celulares se mantuvieron en RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS).
Anticuerpos
anticuerpos primarios utilizados para la tinción incluyen humano anti-vimentina específico (Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-fibronectina ( Abcam, Cambridge, Reino Unido), actina anti-α-músculo liso (Sigma Chemical, St Louis, MO, EE.UU.), anti-pan-citoqueratina (Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-SM22 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) , y el ratón anti-GAPDH (Kangchen, china).
Aislamiento de fibroblastos gástricos humanos
Los fibroblastos se aislaron de regiones por cáncer y asociados no cáncer de los tejidos gástricos disecados de pacientes con cáncer gástrico durante la resección gástrica radical de el Departamento de Cirugía, Ruijin hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medcine. Se seleccionaron las regiones asociadas con el cáncer para ser mínimamente regiones necróticas de la masa tumoral. No asociada a cáncer estroma, que se aisló a partir de tejido de al menos 2 cm distal al margen exterior de la masa de cáncer. muestras de mucosa normal se tomaron desde el margen de la resección en los tumores localizados al menos más de 6 cm de distancia de ella. Los tejidos se desmenuzaron en organoides de aproximadamente 1 mm 3 y se sembraron en material plástico sin recubrir en RPMI 1640 que contenía factor de crecimiento de fibroblastos humano básico, 20% de suero de ternera fetal (FCS) y penicilina y estreptomicina como antibióticos. Estas condiciones producen una población celular fibroblástica homogénea después de 7 días de cultivo. A continuación, cada fibroblastos se expandió a una proporción de 1: 3 por la tripsina-EDTA en 10 cm placas de Petri. Utilizamos los fibroblastos a pases para un máximo de 8 duplicaciones de la población (PDS) para los experimentos posteriores, con el fin de reducir al mínimo la selección clonal y estrés cultural que podría ocurrir durante el cultivo de tejidos extendida.
La tinción inmunohistoquímica (IHC)
se fijaron las células o tejidos durante 30 minutos con formalina al 4% y se enjuagó con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de la actividad de peroxidasa endógena se inactivó con 0,3% H 2O 2, las células se bloquearon con suero no inmune normal para 30 min antes de ser incubadas con anticuerpo primario a 37 ° C durante 2 horas. Las células o tejidos se marcaron a continuación con el kit de tinción de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante-biotina (Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.). La presencia de marcado con peroxidasa en las secciones se visualizó por incubación con 3,3 '- diaminobencidina, DAB + cromógeno sustrato y las secciones se contratiñeron con hematoxilina. Los portaobjetos de control negativo se realizaron por omisión del anticuerpo primario. TAGLN expresión
se evaluó por la intensidad de las células teñidas, y determinó en dos categorías (débil positivo y positivo fuerte). La intensidad de la tinción se clasificó en cuatro grados (puntuaciones de intensidad): ninguna tinción (grado 0), tinción de color marrón claro (grado 1), de coloración marrón (grado 2), y de coloración marrón oscuro (grado 3). Grado 0 y grado 1 se definió como débilmente positivo, grado 2 y grado 3 se definieron como positivos fuertes.
Cuantitativo PCR en tiempo real (QRT-PCR)
ARN total fue extraído utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. cDNA se obtuvo con 1 g de ARN usando el kit del sistema de transcripción inversa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) y QRT-PCR se realizó mediante el kit de reactivo de núcleo SYBR Green PCR (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido). Cebadores específicos para TAGLN fueron los siguientes: 5 '- GAGCAAGCTGGTGAACAGCC-3 ' (superior), 5 '- GACCATGGAGGGTGGGT TCT-3 ' (inferior). se utilizó Glyceral-dehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como la referencia endógena. Sus secuencias fueron 5 '- GGACCTGACCTGCCGTCT AG-3 ' (superior), 5 '- GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 ' (inferior). QRT-PCR para la cuantificación de los niveles de mRNA de TAGLN se llevó a cabo en un ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Los datos se analizaron utilizando el método comparativo Ct. La especificidad de los productos resultantes de la PCR se confirmó mediante curvas de fusión.
Western blot
Las células se recogieron y se lisaron con reactivo de extracción de proteínas de mamíferos (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Las concentraciones de proteínas se determinaron con un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Las muestras que contienen 50 mg de proteína total fueron cargados en cada carril del gel de acrilamida al 12% en un aparato minigel (Bio-Rad, Richmond, CA, EE.UU.). Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad, Richmond, CA, EE.UU.). Después de haber sido incubadas con el anticuerpo primario (1: 1000) y el anticuerpo conjugado con HRP secundario (1: 5.000). Respectivamente, los complejos inmunes se detectaron por el sistema quimioluminiscente intensificado (ECL) (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.)
Enzyme -vinculada ensayo inmunoenzimático (ELISA) Francia el niveles de proteína de MMP-2 en los sobrenadantes se midieron mediante un kit ELISA (I + & D Systems Inc, Minneapolis, MN, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante crecimiento celular
. ensayo de
Los diferentes grupos de células (1 × 10 3) se sembraron en placas de 96 pocillos, por triplicado. Se determinó el número de células viables al día utilizando el Kit de Recuento celular (CCK-8) mediante la utilización de un muy soluble en agua de sal de tetrazolio WST-8 [2- (2-metoxi-4- nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) 5- (2,4-disulfofenil) -2H-tetrazolio, sal monosódica] (Dojindo, Japón). Brevemente, se añadieron 20 l de solución de CCK-8 en placas, se midió la absorbancia a 450 nm después de 4 horas de incubación.
Evaluación de la invasión tumoral y la migración
ensayo de invasión tumoral y la migración se realizaron con el kit de invasión QCMTM24 pocillos (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) y kit de migración QCMTM24 pocillos (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) según el protocolo proporcionado por el fabricante, respectivamente. Añadir preparado MKN-45 suspensión de células (2 × 10 5 células /pocillo) a la cámara superior y añadir fibroblastos pre-suspendida (5 × 10 4 células /pocillo en medio RPMI 1640 que contiene 20% de FBS) a la cámara inferior. El TAGLN algunos de los fibroblastos en las cavidades inferiores se inhibió mediante siRNA 24 horas más tarde. MKN-45 y fibroblastos fueron co-cultivadas no contactedly durante 48 horas, luego lysised las células y determinado los valores RFU con un lector de placas de fluorescencia usando conjunto de filtros de 480/520 nm.
TAGLN siRNA
Se utilizó el software de Qiagen para diseñar secuencias de RNAi dirigidas a TAGLN humano (no la adhesión NM_003186.), y la secuencia de siRNA con la eficacia putativa más alta (sentido: 5 '- AAAUCGAGAAGAAGUAUGAdtdt-3 ', antisentido: 5 '- UCAUAC UUCUUCUCGAUUUdtdt -3 ') se sintetizó por Shanghai GeneChem Co, Ltd siRNA con secuencia aleatoria (sentido: 5 ' - UUCUCCGAACGUGUCACG Utt-3 ', antisentido: 5 ' - ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 ') en contra de ningún gen (grupo siRNA codificado) se transfectó como control interno. Para los experimentos, las células se transfectaron con el reactivo de transfección liposomal DOTAP (Roche, Alemania). Las células se sembraron a 2 × 10 5 células /pocillo en placas de 6 pocillos. Después de 24 horas cuando las células estaban en la fase de crecimiento log, 250 l Opti-MEM I se mezcló con 5 l de 20 mM siRNA dúplex, mientras que otro 250 l Opti-MEM I se incubó separadamente con 11,88 l de DOTAP liposomas. Las dos mezclas se mezclaron suavemente y se incubaron durante aproximadamente 30 min a temperatura ambiente. Para la transfección, se añadió toda la mezcla a cada pocillo en 1,5 ml de medio fresco sin antibióticos. La concentración final transfectadas de siRNA fue de 20 nM. Las células se recogieron para su posterior ensayo a los 24, 48 y 72 horas después de la transfección.
Zimografía de gelatina
Los sobrenadantes de cultivo se recogieron a las 24 horas y se mezcla con un tampón de muestra de gel (0,5 M Tris-HCl, glicerol, 10% dodecilsulfato de sodio [SDS], β-mercaptoetanol, y 0,5% de azul de bromofenol). Diez microgramos de proteína fueron tomadas por separación SDS-PAGE; los geles de SDS-PAGE contenían 0,1% de gelatina (Sigma Chemical, St Louis, MO, EE.UU.). Después de la electroforesis, los geles se lavaron en tampón Tris 50 mM que contiene 2,5% de Triton X-100. Los geles se incubaron durante 24 horas adicionales en el líquido de incubación (50 mM tampón Tris [pH 7,6], CaCl 10 mM 2, y NaCl 200 mM). Los geles se tiñeron con azul de Coomassie al 0,5%, bandas blancas (72 kDa) sobre un fondo azul indican las zonas de la digestión que corresponden a la presencia de MMP-2.
Modelo de ratón
hembra Balb /c nu /nu
ratones desnudos, emparejados por edad entre 4-5 semanas (Instituto de Zoología de la Academia china de Ciencias), fueron alojados en un entorno libre de patógenos específicos en la Unidad de Animales de Laboratorio, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, china. Fibroblastos y MKN-45 se mezclaron en la proporción de 1: 4 en 0,1 ml de PBS y se inyectaron en la vena lateral de la cola. Seis ratones fueron incluidos en cada grupo en todos los experimentos, y cada experimento se realizó dos veces. Los animales fueron sacrificados y nódulos metastásicos de pulmón se registraron 6 semanas después de la implantación de células tumorales. Se recogieron muestras de tumor, mezclado en formalina, incluidas en parafina, y se sometieron a H & E tinción. P Hotel < Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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