Stromos fibroblastai į skrandžio karcinoma mikroaplinkos skatinti naviko metastazių per upregulating TAGLN expression

stromos fibroblastus į skrandžio karcinoma mikroaplinkos skatinti naviko metastazių per upregulating TAGLN išraišką
tezės
Background
Fibroblastai vaidina svarbų vaidmenį Tumorigenesis, naviko progresavimo ir metastazių. Tačiau, jų išsamūs molekulinės savybės ir klinikinė reikšmė vis dar yra silpnas. TAGLN yra aktino-privalomas baltymas, kuris vaidina svarbų vaidmenį Tumorigenesis.
Rezultatai
Mes ištirti ryšį tarp vėžio ląsteles ir nustatyti, kaip fibroblastai iš žmogaus skrandžio karcinoma palengvinti tumorigenezei per TAGLN naviko mikroaplinkos sąveiką. KRL-PGR ir Vakarų dėmė nurodė, kad TAGLN išraiška buvo aktyvinama skrandžio karcinoma susijusių fibroblastų (CAFS), kurios skatina skrandžio vėžio ląstelių migraciją ir invazija. Naudojant sirnr (siRNA), mes nustatėme, kad kovos su sukčiavimu strategijoje sustiprintas naviko metastazių per aktyvinama TAGLN in vitro ir in vivo. Iš matricos metaloproteinazės-2 ekspresija (MMP-2) buvo reikšmingai mažesnis po TAGLN trankyti į apačią iki siRNA. TAGLN koncentracija buvo padidėjusi žmogaus skrandžio vėžio stromos nei normalus skrandžio stromos ir susijęs su diferenciacijos ir limfmazgių metastazių skrandžio vėžio.
Sudarymo
kovos su sukčiavimu strategijoje gali skatinti skrandžio vėžio ląstelių migraciją ir invazija per upregulating TAGLN ir TAGLN sukeltas MMP-2 gamybą.
Raktiniai žodžiai
TAGLN Fibroblastų mikroaplinka naviko metastazės Skrandžio vėžys faktai
Skrandžio vėžys yra antra labiausiai paplitusi priežastis vėžio mirčių pasaulyje, ypač Azijoje [1, 2]. Dauguma skrandžio vėžiu sergančių pacientų mirė nuo auglio augimą sukelia tolimoje metastazių. Metastazės yra kelių pakopų procesas, kurio vėžinės ląstelės skleidžia nuo pirminio navikas ir įsiveržti aplinkinių audinių ir nuotolinio organus, įskaitant vėžio ląstelių judrumą, intravasation, tranzito į kraujo ar limfos ir kraujo išsiliejimo [3]. Šis procesas priklauso sandariai ant aplinkinių mikroaplinkos ir naviko plėtra priklauso nuo nepertraukiamo kryžminio aptarimas tarp vėžinių ląstelių ir ekstraląsteliniuose mikroaplinkos [4].
Transgelin (TAGLN, taip pat žinomas kaip SM22) yra aktino skersinių baltymo, kuris dalyvauja kalcio sąveika ir reguliuoja susitraukimo savybės [5]. Jis gali vaidinti svarbų vaidmenį ląstelių diferenciacijos, ląstelių migracijos ląstelių invazija ir matricos remodeling stabilizuojant citoskeleto per aktino privalomas [6, 7]. Padidėjusi TAGLN baltymų buvo pastebėta karcinoma, skrandžio, kepenų, stemplės, o sumažėjo pastebėtos krūties ir storosios žarnos vėžio ląstelių linijas lygiai TAGLN mRNR ir pirminiai navikai [8].
Visuotinai pripažįstama, kad navikas -stroma sąveika vaidina svarbų vaidmenį navikų vystymąsi ir progresavimą. Stromos sudaro daugiausia matriksą (ECM) ir korinių elementų, pavyzdžiui, fibroblastų [9, 10]. Korinio komponentai stromos yra gerai pripažintas kaip turintis palankią vaidmenį kancerogenezėje [11, 12]. Šie stromos elementų veikti sinergetinį kryžminio aptarimas su vėžio ląsteles nuo pirminių svetainių išlaikyti vėžio augimą ir metastazes [13, 14]. Navikas stromos, kuri yra vadinama "reaktyviosios stromos" yra susijęs su padidėjusia skaičius fibroblastų, didesnio kapiliarinio tankumo ir jų nusėdimą naują ECM turtingą tipo-1-kolageno ir fibrino [15]. Daugėja įrodymų matyti, kad stromos ląstelės, pavyzdžiui, fibroblastų turėti daugiau didelę įtaką kuriant ir progresavimo karcinoma, nei anksčiau buvo vertinama [15-17].
Fibroblastai yra gerai žinoma, vaidina vaidmenis Tumorigenesis ir progresavimą. Fibroblastai išreikšti vimentin, fibronektiną, α-lygiųjų raumenų aktino (α-SMA), fibroblastų paviršiaus baltymas taip pat fibroblastq žymekliai. Karcinomos susijęs fibroblastai (CAFS) yra aktyvuotas fibroblastus, biologiškai skiriasi nuo fibroblastų esančių gerybinių mikroaplinkos keliais svarbiais aspektais [17, 18]. Kovos su sukčiavimu strategijoje nėra pasyvūs stebėtojai į Tumorigenesis ir metastazių, bet ir aktyviai prisidėti prie šių procesų [19]. Mūsų žinios apie ramybės ir aktyvuota fibroblastų vaidmenį vėžio vis dar vystosi. Čia mes orientuojamės į tarp vėžinių ląstelių ir jų mikroaplinkos sąveikos mokytis kaip fibroblastai išskirti iš žmogaus skrandžio karcinoma palengvinti tumorigenezei.
Rezultatai Viesbutis The iš TAGLN išraiška yra aktyvinama skrandžio karcinoma susijusių fibroblastų
karcinoma -associated fibroblastai (CAFS), pasitiktiniai fibroblastai (CPFs) ir normalus fibroblastai (NFS) buvo gauti iš pirminių audinių kultūroje naudojant audinius nuo vėžio susijusių regionų, ne vėžio, susijusio stromos ir normalios gleivinės, atitinkamai. Tada patikrino įvairių fibroblastus gyventojų grynumą, imunodažymu. Šie fibroblastų populiacijos išreiškė dideles levls iš fibroblastq žymenų, tokių kaip vimentin, alfa-SMA ir fibronektino. Kita vertus, šios ląstelės nebuvo išreikšti epitelio tokios žymės kaip citokeratino (1A pav). Šie duomenys patvirtino, kad fiborblasts grynumą. Šios pastabos rodo, kad kultūra ląstelės daugiausia buvo fibroblastai buvo parengta su minimaliomis užterštumo kitas ląsteles. Pav 1 d TAGLN išraiška yra aktyvinama skrandžio vėžiu susijęs fibroblastų. A: charakterizavimas skrandžio fibroblastų (TBT). A1: vimentin, teigiamas. A2: α-SMA, teigiamas. A3: fibronektino, teigiamas. A4: citokeratino, neigiamas. Originalios priartinimas: × 200. Mastelis barai, 100 mkm. B: KRL-PGR analizė TAGLN į BVM, CPF ir NF. *, P
< 0,05, **, P
< 0,01, palyginti su NF. C: Vakarų dėmė analizė TAGLN į BVM, CPF ir NF, TAGLN išraiška lygis buvo paeiliui mažėjo. D: fibroblastai augimo kreivė lėmė CCK-8 tyrime, kovos su sukčiavimu strategijoje išaugo quickier nei kiti. El: BVM turėjo aukštąjį gebėjimą padidinti MKN-45 migracijos galimybes nei CPF ir NF, *** P
< 0,001, palyginti su MKN-45. F: BVM turėjo aukštąjį gebėjimą padidinti MKN-45 invazijos galimybes nei CPF ir NF, * P
< 0,05, **, P
< 0,01, palyginti su MKN-45.
MRNR ir baltymų lygiai TAGLN buvo mažesnis CPFs ir NFS palyginti su kovos su sukčiavimu strategijoje (1b ir C pav.) Mes pirmą kartą parodė, kad kovos su sukčiavimu strategijoje augo gerokai daugiau nei CPFs ir NFS in vitro ląstelių proliferaciją (1d pav.) Be to, mes atlikti ląstelių invaziją ir migracijos tyrimą siekiant patikrinti, ar invazija ir migracija gebėjimas skrandžio vėžio ląsteles būtų sustiprintas fibroblastų. Eksperimentas buvo sukurta siekiant ištirti trakto stromos TAGLN, kuris buvo išskiriami fibroblastų, dėl žmogaus skrandžio vėžio ląstelių poveikį. Vidiniai lygiai TAGLN skrandžio vėžio ląstelių gali trukdyti eksperimentinį procesą. Taigi, mes pasirinkto MKN-45 ląstelių linijos, nes jos TAGLN išraiška lygis buvo mažiausias per septynis skrandžio vėžio ląstelių linijų (SNU-1, AGS, NVI-N87, KATOIII, MKN-45, MKN-28 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901; duomenis neparodyta). Įdomu tai, kad invazija ir migracijos gebėjimas MKN-45 padidėjo visose trijose grupėse (kovos su sukčiavimu strategijoje, CPFs ir NFS) ir padidėjo labiausiai grupėje su CAF (1E ir F pav.) Migracijos ir invazinę elgesį įsigijimas yra vienas iš etapų metastazavusiu procese.
CAFS skatinti naviko metastazių per upregulating TAGLN
išnagrinėti TAGLN poveikį fibrobalsts, mes panaudojome RNAi numušti TAGLN išraiška. Kovos su sukčiavimu strategijoje, CPFs ir NFS buvo pernešta su TAGLN konkretaus ar ne tyla siRNA. RNR ir baltymų buvo gauti 24, 48 arba 72 val po transfekciją, TAGLN iRNR ir baltymų kiekis buvo tiriamas KRL-PGR ir Vakarų dėmė. TAGLN iRNR ir baltymų buvo žymiai slopinamas ląstelių gydomiems TAGLN konkrečių siRNA (2A ir B pav.) 2 pav CAFS padidinti vėžinių ląstelių linijos MKN-45 migraton ir invazija per aktyvinama TAGLN. A: TAGLN išraiška pagal KRL-PGR analizei po siRNA triuškinantis į fibroblastus. B TAGLN išraiška Vakarų blot analize po siRNA triuškinantis į fibroblastus. C: ląstelių migracija tyrimas in vitro (fibroblastų su arba be TAGLN siRNA trukdžių). D: ląstelių invazija tyrimas in vitro (fibroblastų su arba be TAGLN siRNA trukdžių). Vertybės atstovauti vidurkis ± SD bent iš trijų atskirų eksperimentų, kurių kiekvienas atliko tris kartus. *, P
< 0,05, **, P
< 0,01, *** p
< 0.001, kurį vieną pusę dispersinė analizė (ANOVA).
Mes šalia ištirti, ar invazija ir migracija gebėjimas skrandžio vėžio ląstelių bus pagerinta TAGLN raiškos fibroblastų, mes atlikome ląstelių invaziją ir migracijos tyrimą in vitro , Į fibroblastai ir MKN-45 buvo ne contactedly bendrai kultūringas. Įdomu tai, kad invazija ir migracijos gebėjimas MKN-45 iš karto sumažėjo grupėje su kovos su sukčiavimu strategijoje ir šiek tiek sumažėjo grupėje su CPFs ir NFS. Rezultatai parodė, kad invazija ir migracija gebėjimas MKN-45 per gali sumažinti žemyn reguliuojant TAGLN (2c ir D paveikslas) išraišką.
Siekiant įvertinti kovos su sukčiavimu strategijoje-TAGLN indėlį į naviko metastazių in vivo, mes emplyed yra svetimo modelį. Mes sumaišyti TAGLN siRNA kovos su sukčiavimu strategijoje, ne nutildė kovos su sukčiavimu strategijoje, CPFs ir NFS su MKN-45 žmogaus skrandžio vėžio ląsteles santykiu 2: 1 arba MKN-45 vienas ir užsėti šias ląsteles per uodega injekcinis imuninės nuogas pelių į veną. Po 6 savaičių, MKN-45 sumaišyti su CAFS generuoja daugiau plaučių neišplitusios mazgus nei MKN-45 sumaišyti su TAGLN siRNA kovos su sukčiavimu strategijoje, CPFs ir NFS panašus į MKN-45 sumaišytas su ne tyla siRNA CAFS (1 lentelė). Šie duomenys rodo, kad kovos su sukčiavimu strategijoje rodo padidėjusį sugebėjimą skatinti naviko metastazių (3A ir B pav.) Visi stebėjimai parodė, kad į kovos su sukčiavimu strategijoje akivaizdoje, navikai tapo agresyvus, rodo, kad kovos su sukčiavimu strategijoje gali žaisti vaidmenų skatinant metastazių skrandžio vėžio. 3 pav TAGLN padidina naviko metastazių per žmogaus naviko ksenografiniuose modelio in vivo. A: nuogas pelės metastaziniai mazgeliai plaučiuose. A1: plaučių metastazių mazgeliai iš tomur guolis pele. Rodyklė: metastazavusiu mazgelis. A2: ne metastazavusiu mazgelis plaučiuose. A3: "H & El dažymo plaučių metastazavusiu mazgelis pagal šviesus lauko mikroskopu. Mastelis barai, 200 mkm. A4: "H & El dažymo plaučių be metastazavusiu mazgelis pagal šviesus lauko mikroskopu. Mastelis barai, 200 mkm. B: kiekybinis nuogas pelėmis plaučių metastazių mazgelių įvairių grupių per injekcijos uodegos veną. *, P
< 0,05, vieno-way dispersinė analizė (ANOVA).
1 lentelė nude pelės plaučių metastazių mazgų įvairių grupių per injekcijos uodegos veną (Kiekviena grupė esančius 6 peles)
grupes

TAGLN siRNA BVM -MKN45
ne tyla siRNR BVM-MKN45
BVM-MKN45
CPF-MKN45
NF-MKN45
MKN45 vien
naviko guolis pelėms
2
5
5
3
2
2 pervežimas Taškų metastazavusiu mazgelių Taškų
2
10
9
5 3
2
TAGLN skatina naviko metastazių iki upregulating MMP-2
Daugelis tyrimų sutelktas į matrikso metaloproteinazių (MMP) vaidmuo į aplinkinių invazijos ir jungiamojo audinio metastazių naviko ląstelių nuo pirminio pažeidimo į tolimas vietų naviko progresavimo [20, 21]. Mūsų ankstesniame darbe, mes išnagrinėjo MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 ir MMP-9 lygius po TAGLN grandininį nustato siRNA per IFA, tik MMP-2 lygis buvo gerokai žemyn reguliuojama, kiti MMPs lygiai neparodė kaita. Taigi, mes focued dėl MMP-2 šiame tyrime. Kaip 4A pav parodė, palyginti su MKN-45 bendro coultured su CAF /NEG ir CAF /tyčiotis, MMP-2 lygių virš nuosėdų iš MKN-45 bendro kultūringas su CAF /siTAGLN buvo reikšmingai slopino. Mes šalia išnagrinėjo MMP-2 veikla, naudojant želatina zymography tyrimą. Mes nustatėme, MMP-2 veikla buvo smarkiai slopinamas nuopilo iš MKN-45 bendro kultūringas su CAF /siTAGLN nei su CAF /NEG ir CAF /maketas (4b pav.) Taigi, TAGLN gali sustiprinti naviko metastazių per su MMP-2 fermentų skyla rūsio membranas (pvz. Kolageno IV). 4 pav TAGLN padidina naviko metastazių iki aktyvinama MMP-2. A: MMP-2 raiška BVM decresed akivaizdžiai po TAGLN RNAi ELISA. *, P
< 0,05 iki vieną pusę dispersinė analizė (ANOVA). Klaida barai vaizduoti standartinė paklaida aplink vidurkį. B. Triuškinantis TAGLN sumažėjusi apie BVM gebėjimą slaptu MMP-2 d želatinos zymography
TAGLN išraiška žmogaus skrandžio vėžiu ir jo asociacija su diferenciacijos skrandžio vėžiu sergantiems pacientams
Įvertinti TAGLN išraišką skrandžio vėžio, TAGLN imunodažymu 98 buvo išnagrinėti pirminis navikas audiniai. TAGLN išraiška buvo aktyvinama žmogaus skrandžio vėžio stromos, palyginti su normalaus skrandžio audinyje (5a pav normalus skrandžio audinių; 5B pav skrandžio vėžio audinio). Iš TAGLN išraiškos su klinikos funkcijų koreliacijos buvo parodyta 2 lentelėje TAGLN lygis buvo aukštesnis nediferencijuotose navikų (blogai diferencijuotų adenokarcinomos, Sygnet ląstelių karcinomos ir mucinous karcinoma), negu kad diferencijuotų tie (na ir vidutinio adnocarcinomas) (p
= 0,003). Be to, TAGLN lygiai koreliavo su limfmazgių metastazių (P, pervežimas = 0,029). Nebuvo naviko TAGLN išraiškos jokių reikšmingų skirtumų pagal kitų klinikos funkcijų, tokių kaip lytis, amžius, naviko dydį, Lauren klasifikavimo, T etape, nuotolinio metastazių ir TNM etape (p
≥ 0,05). 5 paveikslas išraiška TAGLN žmogaus skrandžio vėžio audiniuose. A: TAGLN išraiška lygis normalus skrandžio audinio IHC. Mastelis barai, 100 mkm. B TAGLN ekspresija į žmogaus skrandžio vėžio stromos pagal IHC. Mastelis barai, 100 mkm. C: TAGLN iRNR yra aktyvinama žmogaus skrandžio vėžio analizuojami KRL-PGR. D: TAGLN baltymas yra aktyvinama žmogaus skrandžio vėžio analizuojami Vakarų dėmė. Vertybės atstovauti vidurkis ± SD bent iš trijų atskirų eksperimentų, kurių kiekvienas atliko tris kartus. *, P
< 0,001 iki paried-mėginių T
testas.
2 lentelė klinikos asociacijos TAGLN raiškos skrandžio vėžio
bylų skaičius
TAGLN imunodažymu
p

Silpnas (+)
Stiprus (++)
Lytis
0.778
Vyras
60
27
33
Panelių
38
16
22
Amžius
0,739
≤60y
46
21
25
> 60y
52
22
30
naviko dydis
0,852
≤5 cm
58
25
33
> 5 cm
40
18
22
diferencijavimas
0,003
Na + Prižiūrėti
46
13
33
Poor
52
30
22
Lauren klasifikavimo
0,059
Žarnų
40
13
27
Difuzinė
58
30
28
T etapas
0.142
T1 + T2
56
21 35
T3 + T4
42
22
20
Limfmazgių metastazės
0,029
N0
27
11
16
N1
32
15
17
N2
26
7
19
N3
13
10
3
Tolima metastazės
0.709 pervežimas Be pervežimas 95
42
53
Su
3
1
2 pervežimas TNM etape
0,722
Aš
20
7
13
II
25
11
14
III
30
10
20
IV
23
15
8
Be to, mes naudojome KRL-PGR ir Vakarų dėmė įvertinti TAGLN išraišką skrandžio vėžio audiniuose (5c ir D pav.) Šie rezultatai rodo, kad TAGLN išraiška skrandžio vėžio audiniuose buvo daug didesnis skrandžio vėžiu, nei kad suporuotas normaliuose audiniuose.
Diskusijos
Daugėja įrodymų rodo, kad vėžys inicijavimas ir progresavimo sąveikos tarp tiek naviko ir stromos ląstelėse. Naviko ląstelės gali aktyviai įdarbinti trakto stromos ląstelių, tokių kaip kraujagyslių ląstelių, lygiųjų raumenų ląstelių ir fibroblastų, į naviką, taip sukuriant mikroaplinkose skatinti naviko augimą [16, 22, 23]. Fibroblastai dažnai sudaro iš stromos ląstelėse daugumą skrandžio karcinoma, tačiau funkciniai įmokos šių ląstelių Tumorigenesis ir naviko metastazių lieka menkai suprantamas.
TAGLN yra viena iš pirmųjų žymenų lygiųjų raumenų diferenciacija embriogenezės metu [24], ir ankstesni tyrimai, susiję su TAGLN daugiausia dėmesio skiriama lygiųjų raumenų ląstelėse [25]. Patologiniams kartu su audinių atsinaujinimą ir fibrogenesis, pavyzdžiui, žaizdų gijimą ir navikinių, yra būdinga tai, kad stromos ląstelėse išvaizdą su ultrastruktūros funkcijų tarpinių tarp tų tipinių fibroblastų ir tiems iš lygiųjų raumenų ląstelių. Šie fibroblastai eksponuoti fenotipo ir funkcines savybes lygiųjų raumenų ląstelėse ir tokiu būdu yra pavadintas miofibroblastai [26], pavyzdžiui, kovos su sukčiavimu strategijoje. Mūsų tyrimo duomenimis, TAGLN raiška taip pat buvo pastebėtas kovos su sukčiavimu strategijoje. Jis pranešė, kad TAGLN baltymų ekspresija skrandžio vėžio, kai baltymo ekspresija spektras skrandžio vėžio buvo analizuojami naudojant dvimatę gelio elektroforezės (2-DE) [27]. Be to, TAGLN baltymas yra vienas iš dviejų su naviku susijusio antigenų, kurių buvo nustatyti kraujo serume inkstų karcinomos pacientams KLADE naudojant 2-DE [28]. Šios ataskaitos yra suderinami su rezultatais, kad pastebėjome, naudojant realaus laiko PGR ir Vakarų dėmė. Įdomu tai, kad mes nustatėme, kad TAGLN buvo daugiausia aptikta fibroblastų, gautų iš naviko stromos, o ne auglio ląstelėse. Be to, kiti tyrėjai atrado, kad TAGLN nėra išreikštas piktybinių ląstelių, tačiau mezenchiminių ląstelių naviko stromos [27].
Stromos fibroblastai reguliuoti endotelio ar epitelio ląstelių elgesį per tiesioginius ir netiesioginius ląstelių cel1 sąveiką. Aktyvinimas priimančiosios stroma1 mikroaplinkos Manoma, kad svarbus žingsnis naviko augimas ir progresavimo [13, 29]. Baltymai išskiriami trakto stromos ląstelės navikų gali teigiamai arba neigiamai paveikti naviko progresavimą. Ryškiausių veiksmai TAGLN gali skatinti naviko ląstelių judrumą ir invazija [7, 30, 31]. Mes nustatėme, kad TAGLN buvo gerokai padidėjo limfmazgių metastazių grupėje, nei limfmazgių neigiamas grupei. Norėdami c1arify į TAGLN vaidmenį stromos fibroblastų metu skrandžio vėžio Tumorigenesis ir metastazių, mes nutildė TAGLN išraišką žmogaus kovos su sukčiavimu strategijoje. Jis nurodė, kad tik MKN-45 bendro kultūringas su CAFS išreiškė aukšto lygio TAGLN eksponuojama daug didesnę invazija ir migracijos galimybes. Fibroblastai, kurie TAGLN buvo nugriauti nebuvo rodyti šią funkciją. Kartu paėmus, mes rekomenduojame, kad TAGLN gali būti atsakingi už skrandžio vėžio ląstelių metastazės per stromos ląstelių stiprinimui, pavyzdžiui, kovos su sukčiavimu strategijoje.
TAGLN išraiška labai padidėjo skrandžio kovos su sukčiavimu strategijoje. Kovos su sukčiavimu strategijoje dėl kurių padidėja TAGLN ekspresijos lygį gali padidinti vėžinių ląstelių invazija ir migracijos galimybes, kurių skatinti sustiprintą išraišką MMP-2. Iš MMP raiškos stimuliacija fibroblastų arba po tiesioginio kontakto su vėžinių ląstelių ar po kontakto su naviko ląstelių pagamintų tirpių veiksnių kildinami iš epitelio ląstelių navikų buvo parodyta keletas tyrimų [32-35]. Todėl aiškinant pagrindines mechanizmus gali sušvelninti auglio augimą ir metastazes skrandžio vėžiu sergantiems pacientams.
išvadas
Apibendrinant, mūsų tyrimas rodo, kad kovos su sukčiavimu strategijoje gali skatinti skrandžio vėžio ląstelių migraciją ir invazija per padidėjusios MMP-2 gamybą, kurią sukelia TAGLN ląstelę .
metodai
audinių mėginiai
kaip 40 porų vėžio audiniuose viso ir atitinkami normalų gleivine KRL-PGR ir Vakarų dėmė ir 98 pradinių skrandžio vėžio Imuniniam buvo surinkti iš chirurgiškai pašalinti skrandžio vėžio diagnozuojama departamento chirurgijos, Ruijin ligoninė, Šanchajaus Jiao Tong universiteto medicinos mokyklos. Normalus gleivinė yra mėginiai buvo paimti iš rezekcija, kur navikas, esančio bent per 6 cm atstumu nuo jo skirtumu. Šis tyrimas protokolas buvo patvirtintas nepriklausomų etikos komiteto Ruijin ligoninė, Šanchajaus Jiaotong universiteto medicinos mokyklos. Informuotas sutikimas buvo parašyta. Visi mėginiai buvo spragtelėjimu, užšaldomos skystame azoto per naktį ir laikomi -80 ° C prieš naudojimą. 4% formaldehido fiksuoto audinio skyriai tiek naviko ir gleivinės buvo tamsintas su H & E ir išnagrinėti ir patikrinti histopathologically du patologai. Kiekvienas egzempliorius buvo priskirtas diagnozę ir pelnė įvartį Lauren klasifikavimo, diferenciacija, pTNM etape. Naviko dydis, vieta ir kiti klinikiniai patologiniai charakteristikos buvo gauti iš klinikinių įrašų su paciento sutikimo
Mobilaus ryšio linijos
skrandžio vėžio ląstelių linijas SNU-1 (ATCC: BEL-5971)., AGS (ATCC: BEL-1739), NVI-N87 (ATCC: BEL-5822) ir KATOIII (ATCC: HTB-103) buvo gauta iš amerikiečių tipas kultūros kolekcijos (Manassas, VA, USA). Dar 3 skrandžio vėžio ląstelių linijas, MKN-45, MKN-28 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901, buvo išsaugojęs mūsų institute. Visi mobilieji linijos buvo prižiūrimi RPMI-1640 papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS).
Antikūnai
Pirminiai antikūnai naudojami dažymo įtraukti žmogaus specialų kovos su vimentin (Abcam, Kembridžas, Jungtinė Karalystė), anti-fibronektiną ( Abcam, Kembridžas, Jungtinė Karalystė), anti-α-lygiųjų raumenų aktino ( "Sigma chemijos, St Louis, Misūrio valstija, JAV), anti-PAN-citokeratino (Abcam, Kembridžas, Jungtinė Karalystė), anti-SM22 (Abcam, Kembridžas, Jungtinė Karalystė) ir pelės anti-GAPDH (Kangchen, Kinija).
išskyrimas žmogaus skrandžio fibroblastų
fibroblastai buvo izoliuotas nuo vėžį ir ne vėžio susijusių regionų skrandžio audinių išpjaustytų iš pacientų, sergančių skrandžio vėžiu per radikaliai skrandžio rezekcijos nuo chirurgijos skyrius, Ruijin ligoninė, Šanchajaus Jiao Tong universiteto Medcine. Vėžio susijęs regionai buvo atrinkti, kad būtų minimaliai nekroziniai regionai naviko masę. Nevėžinis-susijęs stromos, kuris buvo išskirtas iš audinių ne mažiau kaip 2 cm distaliniame prie išorinio atsarga vėžio masės. Normalus gleivinė yra mėginiai buvo paimti iš rezekcija, kur navikas, esančio bent per 6 cm atstumu nuo jo skirtumu. Audiniai buvo sumalta į organoidų maždaug 1 mm 3 ir pasėjamos į nepadengto plastikine medžiaga, į RPMI 1640 terpę, turinčią žmogaus pagrindinę fibroblastų augimo faktorių, 20% serumas iš veršiuko embriono (FCS) ir penicilino ir streptomicino, kaip antibiotikai. Šios sąlygos gaminami homogenišką fibroblastq ląstelių populiaciją po 7 dienų kultūrą. tada kiekvienas fibroblastų buvo išplėsta, 1: 3 santykiu tripsinu-EDTA į 10 cm Petri lėkštelių. Mes naudojome fibroblastus passaged iki 8 gyventojų dubliavimǐ (PDS) paskesnių eksperimentų, siekiant sumažinti klonų atranką ir kultūra stresą, kuris gali atsirasti intervale ilgą audinių kultūroje.
Imunohistocheminį dažymo (IHC)
Ląstelės arba audiniai buvo nustatytos 30 min su 4% formalinu ir skalaujami fosfatinio buferio druskų tirpalo (PBS). Po to, kai endogeninis peroksidazės aktyvumo mišinys skaldomas su 0,3% H 2O 2, ląstelės buvo blokuotos įprastą neimuninis serume 30 min prieš juos į inkubatorių su pirminiais antikūnais 37 ° C temperatūroje 2 val. Ląstelės arba audiniai tada buvo paženklinti avidino-biotino-krienų peroksidazės dažymo rinkinys (Dako, Carpinteria, Kalifornija, JAV). Iš pažymėtą peroksidazės buvimas skyriuose buvo regimos inkubacijos su 3,3 '- diaminobenzidinas, DAB + substratas Chromogenas ir skyriai buvo counterstained hematoksilinu. Neigiama kontrolė slysta buvo atlikta neveikimu pirminio antikūno.
TAGLN išraiška buvo vertinama pagal tamsintas ląstelių intensyvumas, ir nustatomas dviejose kategorijose (silpnas teigiamas ir stiprus teigiamas). Dažymo intensyvumas buvo klasifikuojami pagal keturias klases (intensyvumo balai): Nėra dažymo (0 klasės), šviesiai rudos dėmės (1 laipsnio) ruda dažymo (2 laipsnio) ir tamsiai rudos dažymo (3 laipsnio). 0 ir 1 laipsnio laipsnio buvo apibrėžtas kaip silpnas teigiamas, 2 ir 3 laipsnio laipsnio buvo apibrėžiamas kaip stiprus teigiamas.
Kiekybinis realaus laiko PGR (KRL-PGR)
viso RNR išskirta naudojant Trizol reagentą (Invitrogen, Karlovi Varai, CA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. kDNR buvo gautas 1 mikrogramų RNR naudojant atvirkštinę transkripciją sistemos komplektas (Promega Madison, WI, JAV) ir KRL-PGR buvo atliekama pagal SYBR Žalioji PGR šerdis reagentų rinkinys (Applied Biosystems, Warrington, Jungtinė Karalystė). Specifiniai TAGLN Gruntai buvo taip: 5 '- GAGCAAGCTGGTGAACAGCC-3 ' (viršutinis), 5 '- GACCATGGAGGGTGGGT TCT-3 ' (žemesnė). Glyceral-dehyde-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) buvo naudojamas kaip endogeninio nuoroda. Jos sekos buvo 5 '- GGACCTGACCTGCCGTCT AG-3 ' (viršutinis), 5 '- GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 ' (žemesnė). KRL-PGR už kiekybinio mRNR lygių TAGLN buvo padaryta ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV). Duomenys buvo analizuojami naudojant lyginamąją Ct metodą. Specifiškumas, atsirandančių PGR produktų buvo patvirtinta tirpsta kreives.
Vakarų dėmė
Ląstelės buvo paruošta ir lizuoti su žinduolių baltymais gavybos reagento (Pierce, Rokfordas, Ilinojus, JAV). Baltymų koncentracija buvo nustatoma su bicinchoninic rūgštis (BCA) baltymų bandymo komplektas (Pierce, Rockford, IL, JAV). Mėginiai, kuriuose yra 50 mikrogramų bendrųjų baltymų buvo pakrauti kiekvieną 12% akrilamidas gelio juostos į minigel aparatūros (Bio-Rad, Richmond, CA, JAV). Atskirti baltymus buvo perkeltas į polivinilideno difluoridas (PVDF) membraną (Bio-Rad, Richmond, CA, JAV). Po to, kai inkubuojami su pirminiais antikūnais (1: 1000) ir HRP konjuguota antrinio antikūno (1: 5000). Atitinkamai, imuninės kompleksai buvo aptikta sustiprinto cheminės liuminescencijos (ECL) sistema (Millipore, Bedford, MA, JAV)
Fermentų -susijęs imunosorbento analizė (ELISA),
baltymų lygius MMP-2 nuopile buvo matuojamas ELISA rinkinys (R & D Systems Inc, Mineapolis, MN, JAV) pagal gamintojo nurodymus
ląstelių augimą. tyrimas
skirtingų grupių ląstelių (1 × 10 3) buvo pasėjamos į 96-duobučių lėkštelėse tris kartus. buvo nustatomas kasdien gyvybingų ląstelių skaičius naudojant Mobilusis Skaičiavimo rinkinį (CCK-8), panaudojant labai gerai tirpsta vandenyje tetrazolio druskos wst-8 [2- (2-metoksi-4- nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disulfofenil) -2H-tetrazolio, mononatrio druska] (Dojindo, Japonija). Trumpai, 20 mikrol CCK-8 tirpale buvo įtraukta į plokščių, absorbcija esant 450 nm buvo matuojamas po 4 val inkubavimo.
Vertinimas naviko invazijos ir migracijos pervežimas Naviko invazijos ir migracijos tyrimo buvo atlikta su QCMTM24 šulinėlių invazijos komplektas (Millipore Bedford, MA, JAV) ir QCMTM24-gerai migracija komplektas (Millipore Bedford, MA, JAV) pagal protokolą gamintojo pateikta atitinkamai. Pridėti paruoštą MKN-45 ląstelių suspensijos (2 × 10 5 ląstelių /gerai) iki viršutinės kameros ir pridėti iš anksto sustabdytas fibroblastai (5 × 10 4 ląstelių /gerai RPMI 1640 terpė su 20% FBS), kad apatinę kamerą. Iš kai kurių mažesnių kamerų fibroblastų TAGLN buvo slopinamas naudojant siRNA 24 val vėliau. MKN-45 ir fibroblastai buvo bendrai kultūringas ne contactedly 48 val, tada lysised ląsteles ir nustato RFU vertybes su fluorescencija plokštelių skaitytuvas naudojant 480/520 nm filtro rinkinys.
TAGLN siRNA
buvo naudojamas Qiagen programinė įranga projektuoti RNAi sekas orientacijos žmogaus TAGLN (prisijungimas nėra NM_003186.), o siRNR seka su aukščiausios spėjamą efektyvumą (prasme: 5 '- AAAUCGAGAAGAAGUAUGAdtdt-3 ', antiprasmio: 5 '- UCAUAC UUCUUCUCGAUUUdtdt -3 ') buvo susintetintas Šanchajus GeneChem Co, Ltd siRNA su atsitiktinių seka (jausmas: 5 ' - UUCUCCGAACGUGUCACG Utt-3 ', Priešprasminis: 5 ' - ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 ') prieš jokiu genu (plakta siRNR grupė) buvo pernešta kaip vidaus kontrolės. Eksperimentams, ląstelės buvo transfekuota DOTAP liposominis transfekcijos reagento (Roche, Vokietija). Ląstelės buvo pasėtos ne 2 × 10 5 ląstelių /Na 6-duobučių lėkštelėse. Po 24 val, kai ląstelės buvo log augimo fazę, 250 iL Opti-Mem man buvo sumaišyti su 5 įxL 20 mkm siRNA dvipusis, o kitas 250 mikrol Opti-Mem buvau atskirai inkubuojami su 11.88 įxL DOTAP liposomos. Du mišiniai buvo švelniai maišyti, ir inkubuojami apie 30 min kambario temperatūroje. Transfekcijai, visa mišinys buvo pridedama prie kiekvieno gerai 1,5 ml šviežią terpę be antibiotikų. Galutinis perkeltų koncentracija siRNA buvo 20 nm. Ląstelės buvo surinkti tolesniam tyrimo 24, 48 ir 72 val po transfekcijos.
Želatina zymography
kultūrų supernatantų, buvo surinktos po 24 val ir sumaišyti su gelio pavyzdžių buferio (0,5 M Tris-HCl,, glicerolis, 10% natrio laurilsulfatas [SDS], β-merkaptoetanolio, ir 0,5% bromfenolio mėlynasis). Dešimt mikrogramų baltymų buvo paimti SDS-PAGE atskyrimo; SDS-PAGE geliai pateikta 0,1% želatina (Sigma chemijos, St Louis, MO, JAV). Po to, kai elektroforezės geliai buvo išplautos 50 mM Tris buferiu, kurio sudėtyje yra 2,5% Triton X-100. Geliai buvo inkubuojami už papildomą 24 val inkubatorių skysčio (50 mM Tris buferio [pH 7,6], 10 mM CaCl 2 ir 200 mm NaCl). Geliai buvo tamsintas su 0,5% Coomassie mėlyna, balta juostomis (72 kDa) mėlyname fone nurodoma zonos virškinimą, atitinkančios MMP-2 akivaizdoje.
Pelės modelis
Moteris Balb /c nu /nu
nude peles, amžių atitiko tarp 4-5 savaites (instituto Zoologijos Kinijos mokslų akademija), buvo laikomi tam tikru patogeno aplinkos gyvūnų laboratorijos padalinys, Šanchajaus Jiao Tong universiteto medicinos mokyklos, Kinija. Fibroblastai ir MKN-45 buvo sumaišyta santykiu 1: 4 per 0,1 ml PBS ir suleidžiamas į šoninio uodegos veną. Šešis pelių buvo įtrauktas į kiekvienoje grupėje Visuose eksperimentuose, ir kiekvienas eksperimentas buvo atliekamas du kartus. Gyvūnai buvo aukojami ir plaučių metastazių mazgeliai buvo užregistruoti 6 savaitėms po naviko ląstelių implantavimo. Naviko pavyzdžiai buvo surinkti, mišri formalinu, įterptųjų parafinu ir taikomos H & El dažymo. P
< Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Bendras įvykis kelis smegenų infarkto dėl krešumas susijęs su piktybiniais navikais ir smegenų dangalų karcinomatoze su pirmine pasireiškimo skrandžio vėžio
• Ar skrandžio tonometrija vadovaujasi terapija sumažinti bendrą mirtingumą sunkiai sergantiems pacientams?