Strome fibroblasti v mikrookolja želodca karcinomov spodbujanje tumorskih metastaz preko navzgornje regulacije TAGLN expression

stromalni fibroblaste v mikrookolja želodca karcinomov spodbujanje tumorskih metastaz preko navzgornje regulacije TAGLN izraz
Abstract
Ozadje
fibroblastov igrajo ključno vlogo pri tumorigeneze, tumor napredovanje in metastaze. Vendar pa njihova podrobna molekularnih značilnosti in klinični pomen še vedno nedosegljiva. TAGLN je protein vezave aktina, ki igra pomembno vlogo pri tumorigeneze.
Rezultati
smo raziskovali interakcijo med rakavih celic in tumorskega mikrookolja bi ugotovili, kako fibroblasti iz karcinoma človeške želodčne olajšanje tumorigeneze skozi TAGLN. QRT-PCR in Western blot je pokazala, da je bila TAGLN izraz povečana pri želodca karcinomom povezan fibroblastov (KGZS), ki spodbujajo migracijo želodčni rak celic in invazijo. Z uporabo majhno interferenčno RNA (siRNA), smo ugotovili, da KGZS okrepljen tumorskih metastaz skozi molekul TAGLN in vitro in in vivo. Izraz MMP-2 (MMP-2) je bila bistveno nižja po TAGLN knock-down s siRNA. Ravni TAGLN bilo povišano človeške želodčne strome raka kot normalno želodca strome in povezan z diferenciacijo in bezgavkah metastaze raka želodca.
Zaključek
KGZS lahko spodbujajo migracijo želodca rakavih celic in vdor preko navzgornje regulacije TAGLN in TAGLN inducirane MMP-2 proizvodnja.
Ključne besede
TAGLN Fibroblastni mikrookolje tumorja metastaze želodca karcinom Ozadje
želodca karcinom je drugi najpogostejši vzroki smrti zaradi raka v svetu, zlasti v Aziji [1, 2]. Večina bolnikov z rakom želodca umrl zaradi tumorja ponovitve, ki jih daljni metastaz škodo. Metastaze je proces, večstopenjska, s katerim rakave celice širijo iz primarne neoplazme in zavzemanja okoliških tkiv in razdalje organe, ki vključuje rakavih celic gibljivost, intravazacijo, tranzit v krvi ali limfe in ekstravazacijo [3]. Ta proces je odvisen trdno na okoliške mikrookolja in razvoj tumorja je odvisna od nenehnega navzkrižno pogovor med rakavimi celicami in zunajceličnih mikrookolje [4].
Transgelin (TAGLN, znan tudi kot SM22), je proti aktinu navzkrižno povezovanje protein, ki se ukvarja v kalcija interakcij in ureja Krčenje lastnosti [5]. To lahko igrajo vlogo pri diferenciaciji celične migracije celic celične invazije in matrike preoblikovanja s stabilizacijo skeleta skozi aktina zavezujoč [6, 7]. Čezmernim TAGLN proteina so opazili pri karcinomih želodca, jeter in požiralnika, hkrati pa zmanjšala so opazili ravni TAGLN mRNA v dojke in rak debelega črevesa celičnih linij in primarni tumorji [8].
It je splošno sprejeto, da je tumor -stroma interakcije igrajo pomembno vlogo pri razvoju in napredovanje tumorjev. Strome je sestavljena v glavnem iz ekstracelularnega matriksa (ECM) in mobilnih elementov, kot so fibroblasti [9, 10]. Celične komponente strome so dobro priznana kot podporno vlogo pri karcinogenezi [11, 12]. Ti strome elementi delujejo sinergistično navzkrižno pogovor z rakavimi celicami iz primarnih lokacij za ohranitev rasti in metastaze [13, 14] raka. Strome tumor, ki se imenuje "reaktivno strome" je povezana s povečanim številom fibroblastov, povečani gostoti kapilarno in odlaganje novega ECM bogatega tipa-1-kolagena in fibrina [15]. Kopičijo dokazov je razvidno, da imajo stromalni celice, kot so fibroblasti bolj velik vpliv na razvoj in napredovanje raka, kot je bil prej cenili [15-17].
Fibroblastov je dobro znano, da igrajo vlogo pri tumorigeneze in napredovanje. Fibroblasti izražajo vimentina, fibronektin, α-gladkih mišic aktin (α-SMA), fibroblastov površinske beljakovine kot tudi fibroblastic označevalcev. -Karcinom povezana fibroblasti (KGZS) so aktivira fibroblaste, biološko različni od prisotnih v benignih mikrookolje fibroblastov v več pomembnih vidikov [17, 18]. KGZS niso pasivni opazovalci v tumorigeneze in metastaz, vendar dejavno prispevajo k teh procesov [19]. Naše znanje o vlogi v mirovanju in pod aktiviranih fibroblastov raka je še vedno razvija. Tukaj smo se osredotočajo na interakcijo med rakavih celic in njihovih mikrookolje za študij, kako se fibroblasti izolirali iz človeških želodčnega karcinoma olajša tumorigeneze.
Rezultati
izražanja TAGLN je povečana pri želodca karcinomom povezan fibroblastov
karcinom -associated fibroblasti (KGZS), nasprotna fibroblasti (CPFs) in normalne fibroblasti (NFS) so bili pridobljeni iz primarne kulture tkiva z uporabo tkiv pri raku, povezanih regij, ki niso raka, povezanega strome in normalno sluznico, v tem zaporedju. Nato smo preverili čistost različnih fibroblastom populacij z imunskim barvanjem. Te fibroblastne populacije izrazil visoke levls za fibroblastic markerjev, kot vimentina, alfa-ATVP in fibronektin. Po drugi strani pa te celice niso izražajo epitelijske označevalcev, kot citokeratina (slika 1A). Ti podatki so potrdili čistost fiborblasts. Te ugotovitve kažejo, da so kulture celice pretežno fibroblasti so bili pripravljeni z minimalno kontaminacijo z drugimi celicami. Slika 1 izražanju TAGLN je povečana pri želodčnih, povezanimi z rakom fibroblastov. A: karakterizacija želodca fibroblastov (ICC). a1: vimentin, pozitivna. a2: α-SMA pozitivno. a3: fibronektin, pozitivna. a4: citokeratinskim, negativen. Original povečave: × 200. Lestvica palice, 100 um. B: analiza QRT-PCR TAGLN v CAF, CPF in NS. * P
< 0,05, ** P
< 0,01, v primerjavi z NF. C: Western blot analiza TAGLN v CAF, CPF in NS je bila stopnja TAGLN izraz zapored zmanjšal. D: fibroblasti krivulje rasti smo določili s CCK-8 testu KGZS rasla quickier od drugih. E: CAF je imela višjo sposobnost, da poveča migracijske sposobnosti MKN-45 je kot CPF in NS, ***, P
< 0,001 v primerjavi s MKN-45. F: CAF je imela višjo sposobnost, da poveča invazijo sposobnost MKN-45 je kot CPF in NS, *, P
< 0,05, ** P
< 0,01, v primerjavi z MKN-45.
MRNA in vsebnosti beljakovin v TAGLN so bile nižje v CPFs in NFS je v primerjavi s KGZS (Slika 1B in C). Najprej smo pokazali, da KGZS rasla bistveno več kot CPFs in NFS v celične proliferacije in vitro (slika 1D). Dalje, smo izvedli celic invazijo in migracije metodo za ugotavljanje, ali bi bila invazija in migracije sposobnost želodca rakavih celic okrepiti z fibroblastov. Poskus je bil zasnovan tako, da preuči učinke strome TAGLN, ki je bil izloča s fibroblastov, o človekovih želodca rakavih celic. Notranji ravni TAGLN v želodčnih rakaste celice bi lahko vplivalo na eksperimentalne proces. Zato smo choosed MKN-45 celične linije, ker je bila njegova TAGLN izraz raven najnižje v sedmih želodčnih raka celičnih linijah (snu-1, AGS, NCI-N87, KATOIII, podjetja MKN-45, podjetja MKN-28 in SGC-7901; podatki ni prikazano). Zanimivo je, invazija in migracije sposobnost MKN-45 v vseh treh skupinah (KGZS, CPFs in NFS) povečala in je najbolj povečal v skupini s CAF (slika 1E in F). Pridobitev migracije in invazivne obnašanje je eden od korakov v vzorcu širjenja.
KGZS spodbujanje tumorskih metastaz po navzgornje regulacije TAGLN
Da bi preučili vpliv TAGLN v fibrobalsts smo uporabili RNAi podreti TAGLN izraz. KGZS, CPFs in NFS so transfekciji s TAGLN specifične ali ne-molka siRNA. RNA in beljakovin so bili pridobljeni na 24, 48 ali 72 ur po transfekciji smo TAGLN mRNA in vsebnosti beljakovin, ki jih preiskujejo QRT-PCR in Western blot. TAGLN mRNA in proteinov so precej zaviral v celicah, ki so se zdravili z TAGLN specifične siRNA (Slika 2A in B). Slika 2 KGZS povečanje tumorske celice linije MKN-45 migraton in vdor preko molekul TAGLN. A: TAGLN izraz analiza QRT-PCR po siRNA rasklapanje v fibroblastov. B: TAGLN izraz z Western analizo blot po siRNA rasklapanje v fibroblastov. C: celične migracije test in vitro (fibroblasti z ali brez vmešavanja TAGLN siRNA). D: celica invasion test in vitro (fibroblasti z ali brez vmešavanja TAGLN siRNA). Vrednosti predstavljajo povprečje ± SD iz vsaj treh različnih poskusov, vsak poteka v treh izvodih. * P
< 0,05, ** P
< 0,01, ***, P
< 0,001, ki ga enosmerno analizo variance (ANOVA).
Smo poleg raziskati, ali se bo invazija in migracije sposobnost želodca rakavih celic okrepljeno z izraženimi TAGLN v fibroblastov, smo izvedli celic invazijo in migracije test in vitro . V fibroblasti in MKN-45 so bili non-contactedly co-kultivirani. Zanimivo je, invazija in migracije sposobnost MKN-45 takoj zmanjšal v skupini s KGZS in v skupini s CPFs in NFS je nekoliko zmanjšala. Rezultati so pokazali, da je invazija in migracije sposobnost MKN-45 lahko zmanjša z dol-regulacijo izražanja TAGLN (slika 2C in D).
Da bi ocenili prispevek KGZS-TAGLN do tumorja metastaze in vivo, smo emplyed model ksenotransplantskih. Mi mešati TAGLN siRNA KGZS, non-utihnile, KGZS, CPFs in NFS z MKN-45 človeških želodčnih rakavih celic v razmerju 2: 1 ali MKN-45 sam in nacepili te celice skozi rep intravensko injiciranje v imunsko pomanjkljivostjo golih miših. Po 6 tednih, MKN-45 zmešamo z KGZS ustvarila več pljuči metastaznih gomoljev kot MKN-45 zmešamo z TAGLN siRNA KGZS, CPFs in NFS, podoben MKN-45 zmešamo z non-tišine siRNA KGZS (tabela 1). Ti podatki kažejo, da KGZS kažejo povečano možnost za spodbujanje tumorske metastaze (slika 3A in B). Vse pripombe, je pokazala, da v prisotnosti KGZS, tumorji je postal bolj agresiven, kar kaže, da bi lahko KGZS igrajo vlogo pri spodbujanju metastaze raka želodca. Slika 3 TAGLN povečuje tumorskih metastaz pomočjo modela človeškega tumorskega ksenotransplantata vivo. A: golih miši metastatskih vozlički v pljučih. a1: pljučne metastatskim gomoljev iz tomur ki nosi miško. Arrow: metastatskega vozlič. a2: no metastatskega vozlički v pljučih. a3: H & E barvanja za pljučne metastatskega vozlički pod svetla polja mikroskopom. Lestvica bari, 200 um. a4: H & E barvanja za pljuča brez metastatskega vozlički pod svetla polja mikroskopom. Lestvica bari, 200 um. B: količinska nude miši pljuč metastatskih gomoljev v različnih skupinah skozi rep intravensko injekcijo. * P
< 0,05, ki ga enosmerno analizo variance (ANOVA).
Tabela 1 Nude miši pljuč metastatskim gomoljev v različnih skupinah skozi rep intravenski injekciji (vsaka skupina je vsebovala 6 miši)
skupine
TAGLN siRNA CAF -MKN45
non-molk siRNA CAF-MKN45
CAF-MKN45
CPF-MKN45
NF-MKN45
MKN45 sam
Število tumorjem ob miših
2
5
5
3
2
2
Število metastatskih gomoljev
2
10
9
5
3
2
TAGLN spodbuja tumorskih metastaz s navzgornje regulacije MMP-2
Številne študije so se osredotočili na vlogo matričnih metaloproteinaz (MMP) na invazijo okolici vezivnega tkiva in metastaza tumorskih celic iz primarne lezije na oddaljenih lokacijah v napredovanja tumorja [20, 21]. V prejšnjem delu smo pregledali MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 in MMP-9 stopnje po TAGLN knock-down ga siRNA z ELISA, le ravni MMP-2 je bila bistveno navzdol urejene, druge MMP ravni pokazala nobenih sprememb. Zato smo focued na MMP-2 v tej študiji. Kot Slika 4A je pokazala, v primerjavi z MKN-45 co-coultured s CAF /neg in CAF /mock, raven MMP-2 v supernatant iz MKN-45 co-gojili z CAF /siTAGLN so bistveno zatreti. Smo poleg pregleda aktivnost MMP-2 uporablja želatina cimografijo testom. Ugotovili smo, MMP-2 aktivnost je bila močno zaviral supernatant iz MKN-45 co-gojili z CAF /siTAGLN kot pri CAF /neg in CAF /mock (slika 4B). Tako lahko TAGLN izboljšati tumorskih metastaz z encimi MMP-2 poslabša klet membrane (npr. Kolagen IV). Slika 4 TAGLN povečuje tumorskih metastaz, ki ga molekul MMP-2. A: MMP-2 pri CAF decresed očitno po TAGLN RNAi ELISA. * P
< 0,05 z enosmernimi analizo variance (ANOVA). Napaka palice prikazujejo standardno napako okoli povprečja. B:. Rasklapanje TAGLN oslabila zmožnost CAF do tajnih MMP-2, ki ga želatine cimografijo
TAGLN izražanje pri raku človeške želodčne in njegova povezava z diferenciacijo pri bolnikih z rakom želodca
Za oceno izraz TAGLN pri raku želodca, TAGLN imunskim barvanjem v 98 so bili pregledani primarni želodčni rak tkiva. TAGLN izraz je bila povečana pri človeške želodčne strome raka v primerjavi z normalno želodčnega tkiva (slika 5A: normalno želodčnega tkiva; Slika 5B: želodčni rak tkivo). Korelacija TAGLN izražanja s clinicopathological funkcij je prikazan v tabeli 2. ravni TAGLN so bile višje v nediferencirani tumorji (slabo diferenciranih adenokarcinome, pečatni prstan celic karcinomov in mucinozni karcinomov) kot pri diferenciranih tiste (tudi in zmernimi adnocarcinomas) (p
= 0,003). Poleg tega je bila raven TAGLN korelaciji s bezgavkah metastaze (P
= 0,029). Ni bilo pomembnih razlik v tumor TAGLN izražanja v skladu z drugim clinicopathological značilnosti, kot so spol, starost, velikost tumorja, klasifikacija Lauren, fazi T, metastaze na daljavo in stopnji TNM (P
≥ 0,05). Slika 5 Podajanje TAGLN v človeških želodčnega tkiva raka. A: TAGLN nivo izražanja v normalnem želodčnega tkiva IHC. Lestvica palice, 100 um. B: TAGLN se prekomerno v strome raka človeške želodčne po IHC. Lestvica palice, 100 um. C: TAGLN mRNA je povečana pri človeškega raka želodca analizirata s QRT-PCR. D: TAGLN protein je povečana pri človeškega raka želodca analizirajo Western blot. Vrednosti predstavljajo povprečje ± SD iz vsaj treh različnih poskusov, vsak poteka v treh izvodih. * P
< 0.001 jih paried-vzorcev T
preizkus.
Tabela 2 Clinicopathological združenja TAGLN izražanja raka želodca
Število primerov
TAGLN imunskim barvanjem
P

Slab (+)
Strong (++)
Spol
0.778
Male
60
27
33
Moški
38
16
22
Starost
0,739
≤60y
46
21
25
> 60y
52
22
30 velikost
Tumor
0,852
≤5 cm
58
25
33
> 5 cm
40
18
22
Razlikovanje
0,003
No + Zmerna
46
13
33
Poor
52
30
22
razvrščanjem Lauren
0.059
Črevesne
40
13
27
razpršenih
58
30
28
T stage
0.142
T1 + T2
56
21
35
T3 + T4
42
22
20
limfnega vozla metastaze
0,029
n0
27
11
16
N1
32
15
17
N2
26
7
19
N3
13
10
3
Distant metastaze
0.709
Brez
95
42
53
Z
3
1
2
fazi TNM
0,722
sem
20
7
13
II
25
11
14
III
30
10
20
IV
23
15
8
Prav tako smo uporabili QRT-PCR in Western blot za oceno izražanje TAGLN v želodčnih tkiva raka (slika 5C in D). Ti rezultati kažejo, da je bila TAGLN izraz v želodčnih tkivih rakom precej višje pri raku želodca, kot je v parnih normalnih tkivih.
Razprava
Kopičijo dokazi kažejo, da nastanek in napredovanje raka vključujejo interakcije med obema tumorja in stromalnih celicah. Tumorske celice lahko aktivno zaposli stromalne celice, kot so celice žil, gladkih mišičnih celicah in fibroblastov, v tumor, s čimer ustvarjajo mikrookolje pospeševanja rasti tumorjev [16, 22, 23]. Fibroblasti pogosto predstavljajo večino stromalnih celic v karcinom želodca ni funkcionalni prispevki teh celic v tumorigeneze in tumorsko metastaziranje še vedno slabo razumemo.
TAGLN je eden od prvih markerjev gladkega diferenciacije mišic med embriogenezo [24] in predhodne študije, povezane z TAGLN osredotočena predvsem na gladkih mišičnih celic [25]. Patoloških stanj, ki jih spremlja z vpojnim preoblikovanje in fibrogeneze, kot celjenje ran in neoplastične lezije, značilen videz stromalnih celic z ultrastrukturni značilnostmi vmesnimi med tistimi tipičnih fibroblastov in tistih iz gladkih mišičnih celic. Te fibroblasti kažejo fenotipske in funkcionalne lastnosti gladkih mišičnih celic in zato so poimenovane myofibroblasts [26], kot so kavarne. V naši raziskavi smo opazili tudi TAGLN čezmernim v KGZS. To je poročal, da je TAGLN protein prekomerno raka želodca, ko je protein izraz spekter raka želodca analizirali z dvodimenzionalno gelsko elektroforezo (2-DE) [27]. Poleg tega TAGLN protein eden od dveh antigenov tumor povezan, ki so bile ugotovljene v serumu pacientov karcinomom ledvic z Klade uporabo 2-de [28]. Ta poročila so v skladu z ugotovitvami, ki smo jih opazili z uporabo PCR v realnem času in Western blot. Zanimivo je, da smo ugotovili, da je TAGLN predvsem odkrita v fibroblastih pridobljenih iz tumorske strome, namesto v tumorskih celicah. Tudi drugi raziskovalci ugotovili, da je TAGLN ni izražena v malignih celic, vendar v mezenhimskih celic strome tumorja [27].
Stromalni fibroblasti urediti endotelijskih ali obnašanje epitelijskih celic prek neposrednih in posrednih interakcij celic cel1. Aktivacija gostitelj stroma1 mikrookolja je mislil, da je pomemben korak pri rasti tumorja in napredovanja [13, 29]. Beljakovine, ki jih stromalni celice izločajo v tumorjih lahko pozitivno ali negativno vpliva na napredovanje tumorja. Najpomembnejši ukrepi TAGLN lahko prednost tumorsko celico gibljivost in invazijo [7, 30, 31]. Ugotovili smo, da je bila TAGLN v bezgavkah metastaz skupine močno povečala od bezgavke negativne skupine. Za c1arify vlogo TAGLN v stromalnih fibroblastov med želodca tumorigeneze raka in metastaz, smo utihnile izraz TAGLN v človeški KGZS. Navedla je bilo, da le MKN-45 co-gojili z KGZS izražajo visoko raven TAGLN razstavljena veliko večjo invazijo in migracije sposobnosti. Fibroblasti, ki so bili TAGLN podrli ni prikaz te funkcije. Skupaj, predlagamo, da bi lahko TAGLN odgovoren za izboljšanje metastaz želodca rakave celice preko stromalnih celicah kot KGZS.
TAGLN izraz je v želodčnih KGZS znatno povečala. KGZS s povečano stopnjo izraženosti TAGLN lahko poveča invazije tumorskih celic in migracije sposobnosti, ki spodbujajo okrepljeno izraz MMP-2. Stimulacija MMP izražanja v fibroblastih bodisi ko je neposreden stik s tumorskimi celicami ali po stiku s tumorske celice pridobljene iz topnih faktorjev iz tumorjev, ki izvirajo iz epitelnih celic prikazano v številnih študijah [32-35]. Razjasnitev osnovnih mehanizmov zato lahko zmanjšali ponovitve tumorja in metastaz pri bolnikih z rakom želodca.
Sklepe
Skratka, naša raziskava kaže, da lahko KGZS spodbujati migracije želodčni rak celic in vdor preko povečane proizvodnje MMP-2, ki ga TAGLN uravnavanjem povzročajo .
Metode
vzorce tkiva
skupno 40 parov rakavih tkiv in ustrezne normalno sluznico za QRT-PCR in Western blot in 98 osnovnih želodčnega raka za imunskim barvanjem so bili zbrani s kirurško odstranili raka želodca diagnosticiran na Oddelku kirurgije, Ruijin bolnišnica, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Normalne vzorce sluznice so bili odvzeti iz robu resekcijo, kjer se nahaja tumorji vsaj čez 6 cm narazen od njega. Ta študija protokol je odobril neodvisni etični odbor bolnišnice Ruijin, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine. Soglasje obvestil je bila napisana. Vse vzorce smo hitro zmrznili v tekočem dušiku preko noči in vzdržujemo pri -80 ° C pred uporabo. 4% odseki tkiva-formaldehid določen obeh tumorja in sluznice smo obarvali s H & E in preučiti in histopathologically preveri z dvema patologi. Vsak vzorec je bil pripisan diagnozo in dosegel za razvrstitev Lauren, diferenciacijo, stopnjo pTNM. velikost tumorja, lokacija in drugi klinični patološki značilnosti so pridobljeni iz kliničnih evidenc z dovoljenjem bolnika
Celične linije
želodcu rakave celične linije snu-1 (ATCC: CRL-5971)., AGS (ATCC: CRL-1739), NCI-N87 (ATCC: CRL-5822) in KATOIII (ATCC: HTB-103) smo dobili od American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Še 3 želodca rakave celične linije, MKN-45, MKN-28 in SGC-7901, se je ohranilo na našem inštitutu. Vse celične linije smo ohranjali in RPMI-1640 z dodatkom 10% fetalni goveji serum (FBS).
Protitelesa
Primarne protitelesa, ki se uporabljajo za obarvanje vključene človeškega specifično anti-vimentina (Abcam, Cambridge, Velika Britanija), anti-fibronektin ( Abcam, Cambridge, Velika Britanija), anti-α-gladkih mišic aktin (Sigma Chemical, St Louis, MO, ZDA), anti-pan-citokeratinskim (Abcam, Cambridge, Velika Britanija), anti-SM22 (Abcam, Cambridge, Velika Britanija) in miško anti-GAPDH (Kangchen, Kitajska).
Izolacija človeških želodca fibroblastov
so fibroblasti izolirali iz cancer- in nerakave povezano regijah želodca tkiv razkosanih pri bolnikih z rakom želodca v radikalni želodca resekcijo iz Oddelek za kirurgijo, Ruijin bolnišnica, Shanghai Jiao Tong University School of Medcine. Regije, povezani z rakom so bile izbrane, da bi minimalno nekrotične regije mase tumorja. Non-rak povezano STROMA, ki je bil izoliran iz cm distalno tkiva vsaj 2 do zunanjega robu mase raka. Normalne vzorce sluznice so bili odvzeti iz robu resekcijo, kjer se nahaja tumorji vsaj čez 6 cm narazen od njega. Tkiva smo mleto v organoids približno 1 mm 3 in zasejemo na neprevlečenih plastičnega materiala v RPMI 1640 mediju, ki vsebuje človeški bazični fibroblastni rastni faktor, 20% fetalni telečji serum (FCS) in penicilina in streptomicina kot antibiotiki. Ti pogoji proizvaja homogeno fibroblastic populacijo celic po 7 dneh kulture. Vsak fibroblastni nato ekspandiramo v razmerju 1: 3 s tripsina-EDTA v 10 cm petrijevke. Uporabili smo fibroblaste pasaže do 8 podvojitev prebivalstva (PD) za nadaljnje poskuse, da bi zmanjšali klonske selekcije in kultura stres, ki lahko pride v času podaljšanega kulture tkiva.
Imunohistokemijsko (IHC)
so bile določene celice ali tkiva 30 minut s 4% formalina in splaknemo s fosfatnim pufrom (PBS). Potem ko je bil endogene peroksidaze aktivnost pogasimo z 0,3% H 2O 2, smo celice blokirali z normalnim neimunsko serum za 30 minut preden se inkubirali s primarnim protitelesom pri 37 ° C 2 uri. Celice ali tkiva so nato označeni z streptavidin-biotina-hrenovo peroksidazo barvanja komplet (Dako, Carpinteria, CA, ZDA). Prisotnost oznako peroksidaze na odsekih smo vizualizirali z inkubacijo z 3,3 '- diaminobenzidine, DAB + substrat kromogena in oddelki so jih nasprotno z hematoksilinom. Negativne kontrole diapozitivi so bile izvedene z izpuščanjem primarnega protitelesa.
TAGLN izraz je ocenil intenzivnosti obarvanih celic in se določi v dveh kategorijah (šibka pozitivna in močna pozitivna). Intenzivnost obarvanja smo razporedili v štiri razrede (rezultati določenega intenziteta): no obarvanje (razred 0), svetlo rjavo obarvanje (razred 1), rjavo obarvanje (razred 2), in temno rjavo obarvanje (ocena 3). Razred 0 in razred 1 je bil opredeljen kot šibko pozitivni, so bile stopnje 2 in stopnje 3 je opredeljena kot močna pozitivna.
Kvantitativni PCR v realnem času (QRT-PCR)
Total RNA je bila vzeta s pomočjo TRIzola reagenta (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) po navodilih proizvajalca. cDNA je bila pridobljena z 1 ug RNA s pomočjo Reverse Transcription sistema Kit (Promega, Madison, WI, ZDA) in QRT-PCR je opravila SYBR Green PCR core Reagent kit (Applied Biosystems, Warrington, UK). Primerji, specifični za TAGLN so bili naslednji: 5 '- GAGCAAGCTGGTGAACAGCC-3 "(zgornji), 5 ' - GACCATGGAGGGTGGGT TCT-3 " (nižji). Glyceral-dehyde-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) smo uporabili kot endogeni referenco. Njegove sekvence so 5 '- GGACCTGACCTGCCGTCT AG-3 "(zgornji), 5 ' - GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 " (nižji). QRT-PCR za kvantifikacijo na ravni mRNA TAGLN je bilo opravljeno na ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA). Podatki so bili analizirani z uporabo primerjalne metode CT. Posebnosti izhajajo produktov PCR smo potrdili s topljenjem krivulje.
Western Blot
Celice je bilo potrgano in lizirali z ekstrakcijo protein reagentom sesalcev (Pierce, Rockford, IL, USA). Koncentracije proteinske so bile določene z bicinchoninic kislino (BCA) protein analiznega kompleta (Pierce, Rockford, IL, ZDA). Vzorci, ki vsebujejo 50 ig celotnega proteina so bili naloženi na vsaki stezi 12% akrilamida gela v aparatu minigel (Bio-Rad, Richmond, CA, ZDA). Ločene proteine ​​smo prenesli v poliviniliden difluorid (PVDF) membrane (Bio-Rad, Richmond, CA, ZDA). Potem ko so inkubirali s primarno protitelo (1: 1000) in HRP-konjugiranega sekundarnih protiteles (1: 5000). Sistema oziroma so imunski kompleksi zazna z okrepljenim kemiluminescentnega tipa (ECL) (Millipore, Bedford, MA, ZDA)
encimov -vezana imunski test (ELISA)
nivojev beljakovin MMP-2 v supernatantih smo izmerili z ELISA kit (R &D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) po navodilih proizvajalca
rast celic. test
različnimi skupinami celice (1 x 10 3) smo zasejali v 96-vdolbinami v treh izvodih. Število živih celic je bila določena na dan z uporabo mobilnega Counting Kit (CCK-8) z uporabo zelo vodotopno tetrazolij sol WST-8 [2- (2-metoksi-4- nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) 5- (2,4-disulfofenil) -2H-tetrazolij mononatrijeva sol] (Dojindo, Japonska). Na kratko, smo dodali 20 xl CCK-8 raztopine v ploščah, je absorbanco pri 450 nm, izmerjena po 4 ure inkubacije.
Ocena tumorske invazije in migracije
Tumor invazijo in migracije testom smo opravili z QCMTM24-tudi komplet invazijo (Millipore, Bedford, MA, ZDA) in QCMTM24-dobro migracije kit (Millipore, Bedford, MA, ZDA) v skladu s protokolom, ki ga določi proizvajalec, v tem zaporedju. Dodaj pripravljeno MKN-45 celične suspenzije (2 x 10 5 celic /vdolbinico) na zgornjo komoro in dodamo predhodno prekinjena fibroblasti (5 x 10 4 celic /tudi v RPMI 1640 medija, ki vsebuje 20% FBS) do spodnja komora. TAGLN nekaterih fibroblastov v nižjih komorah je zaviral uporabo siRNA 24 ur kasneje. MKN-45 in fibroblasti so co-kultiviramo non-contactedly za 48 ur, nato pa lysised celice in določi vrednosti RFU s čitalnikom fluorescence ploščo s pomočjo 480/520 nm filtra niza.
TAGLN siRNA
je bila uporabljena programska oprema Qiagen oblikovati RNAi sekvence, usmerjenih ljudi TAGLN (pristop ni NM_003186.), in siRNA zaporedje z najvišjo domnevni učinkovitosti (sense: 5 '- AAAUCGAGAAGAAGUAUGAdtdt-3 ", protismiselni: 5 ' - UCAUAC UUCUUCUCGAUUUdtdt -3 ) smo sintetizirali Shanghai GeneChem Co, Ltd siRNA s naključnem zaporedju (občutek: 5 '- UUCUCCGAACGUGUCACG UTT-3 "antisens: 5 ' - ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 ) proti brez gena (umešana siRNA skupina) smo transfektirali kot notranje kontrole. Za poskuse smo celice transfektirali s DOTAP liposomski transfekcije reagenta (Roche, Nemčija). Celice smo zasejali v 2 x 10 5 celic /jamico v 6 vdolbinami. Po 24 urah, ko so celice v fazi rasti log, 250 ul Opti-MEM sem pomešamo s 5 ul 20 uM siRNA duplex, medtem ko je bila druga 250 ul Opti-MEM I ločeno inkubiranih z 11.88 ul iz DOTAP liposom. Dve zmesi smo previdno pomešamo in inkubiramo približno 30 minut pri sobni temperaturi. Za transfekciji smo celotno zmes dodamo v vsako jamico v 1,5 ml svežega medija brez antibiotikov. Končna transficirane koncentracija siRNA je 20 nM. Celice smo zbrali za nadaljnjo testu pri 24, 48 in 72 ur po transfekciji.
Želatina cimografijo
bile Supernatante kultur pridelani na 24 ur in zmešamo s pufrom z gelom vzorca (0,5 M Tris-HCl, glicerol, 10% natrijev dodecil sulfat [SDS], β-merkaptoetanola in 0,5% bromofenol modro). Deset mikrogramov proteina so bili z ločevanjem SDS-PAGE; na SDS-PAGE gel vsebuje 0,1%, želatina (Sigma Chemical, St Louis, MO, ZDA). Po elektroforezi so bili geli sprali s 50 mM Tris pufra, ki vsebuje 2,5% Tritona X-100. Geli inkubiramo dodatnih 24 ur v inkubacijsko tekočino (50 mM Tris pufrom [pH 7,6], 10 mM CaCl 2, in 200 mM NaCl). Geli smo obarvali z 0,5% Coomassie modrim, bele trakove (72 kDa) na modri podlagi navedena območja prebave ustrezajo prisotnosti MMP-2.
Mouse Vzorec
Ženski BALB /c nu /nu
golih miši, starost ujemanje med 4-5 tednov (inštitut za zoologijo kitajske akademije znanosti), so bili nastanjeni v specifičnih povzročiteljev bolezni brez okolja v enoti za živali Laboratory, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Kitajska. Fibroblasti in MKN-45 pomešamo v razmerju 1: 4 v 0,1 ml PBS in injiciramo v stransko repno veno. Šest miši so bili vključeni v vsako skupino v vseh poskusih, in vsak poskus smo izvedli dvakrat. Živali smo žrtvovali in pljuč metastatskih vozlički zabeležili 6 tednov po tumorskih celic implantaciji. Tumorske vzorce zberemo, zmešamo s formalinom, vgrajeni v parafin in izpostavimo H &E obarvanje. P
< Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Sopojavnost več cerebralnih infarktov zaradi hiperkoagulacije povezano z malignosti in meningealno karcinomatozo kot prvotni manifestacije raka želodca
• Ali želodca, merjenje očesnega tlaka vsaki vodeno terapijo zmanjšati skupno smrtnost pri kritično bolnih?