Stromale fibroblaster i mikromiljøet av mage karsinom fremme metastase via oppregulering TAGLN uttrykk

Stromale fibroblaster i mikromiljøet av mage karsinom fremme metastase via oppregulering TAGLN uttrykk
Abstract
Bakgrunn
Fibroblaster spille en avgjørende rolle i tumordannelse, tumorprogresjon og metastasering. Men sine detaljerte molekylære egenskaper og klinisk betydning er fortsatt unnvikende. TAGLN er en actin-bindende protein som spiller en viktig rolle i tumorgenese.
Resultater
Vi undersøkte samspillet mellom kreftceller og svulsten mikromiljøet for å bestemme hvordan fibroblaster fra human gastrisk karsinom lette tumorgenese gjennom TAGLN. QRT-PCR og Western blot indikerte at TAGLN uttrykk ble oppregulert i magekreft-assosiert fibroblaster (kafeer) som fremmer magekreft celle migrasjon og invasjon. Ved hjelp av små interfererende RNA (siRNA), fant vi at kafeer forbedret metastase gjennom oppregulert TAGLN in vitro og in vivo. Uttrykket av matriksmetalloproteinase-2 (MMP-2) var signifikant lavere etter TAGLN knock-down av siRNA. TAGLN nivåer ble forhøyet i human magekreft stroma enn normal mage stroma og assosiert med differensiering og lymfeknutemetastasering av magekreft.
Konklusjon
kafeer kan fremme magekreft celle migrasjon og invasjon via oppregulering TAGLN og TAGLN indusert MMP-2 produksjon.
nøkkelord
TAGLN fibroblast mikromiljøet metastase magekarsinom Bakgrunn
Gastric karsinom er den nest vanligste årsakene til kreftrelaterte dødsfall i verden, spesielt i Asia [1, 2]. De fleste av magekreftpasienter døde av svulst tilbakefall forårsaket av fjernmetastaser. Metastase er en flertrinns prosess som kreftceller spre fra den primære svulst og invadere omgivende vev og distanseorganer, som omfatter kreftcelle motilitet, intravasation, transitt i blod eller lymfe, og bloduttredelse [3]. Denne prosessen er avhengig tett på omkringliggende mikromiljøet og tumorutvikling er avhengig av en kontinuerlig krysstale mellom kreftceller og ekstracellulære microenvironments [4].
Transgelin (TAGLN, også kjent som SM22) er en aktin tverrbindende protein som er involvert i kalsium samhandling og regulerer kontraktile egenskaper [5]. Det kan spille en rolle i celledifferensiering, cellemigrering celle invasjon og matrise remodellering ved å stabilisere cytoskjelettet gjennom aktinbinding [6, 7]. Overekspresjon av TAGLN protein har blitt observert i karsinomer i mage, lever, og spiserøret, mens reduserte nivåer av TAGLN mRNA er observert i bryst og tykktarm kreft cellelinjer og primære svulster [8].
Det er generelt akseptert at svulsten -stroma interaksjoner spiller en viktig rolle i tumorutvikling og progresjon. Stroma utgjøres hovedsakelig av ekstracellulær matriks (ECM) og cellulære elementer, slik som fibroblaster [9, 10]. De cellulære komponenter i stroma er godt anerkjent som har en støtterolle i karsinogenese [11, 12]. Disse stromale elementer handle i en synergistisk cross-talk med kreftceller fra de viktigste områdene for å opprettholde kreft vekst og metastase [13, 14]. Svulsten stroma som er referert til som en "reaktiv stroma" er assosiert med et økt antall av fibroblaster, forsterket kapillær tetthet og avsetning av en ny ECM rik i type 1-kollagen og fibrin [15]. Oppsamling av bevis viser at stromale celler, slik som fibroblaster har en mer dyptgripende innflytelse på utvikling og progresjon av kreft enn tidligere forstås [15-17].
Fibroblaster er godt kjent for å spille roller i tumorigenese og progresjon. Fibroblaster uttrykke vimentin, fibronektin, α-glatt-muskel-aktin (α-SMA), fibroblast-overflateprotein, så vel som fibrinoblast markører. Carcinoma-assosiert fibroblaster (kafeer) er aktivert fibroblaster, biologisk forskjellige fra fibroblaster stede i godartede microenvironments i flere viktige aspekter [17, 18]. Kafeer er ikke passive tilskuere i tumorigenesis og metastaser, men bidra aktivt til disse prosessene [19]. Vår kunnskap om betydningen av hvile og aktiverte fibroblaster i kreft er fortsatt i utvikling. Her fokuserer vi på samspillet mellom kreftceller og deres microenvironments å studere hvordan fibroblaster isolert fra humane mage karsinom lette tumorigenesis.
Resultater
uttrykk for TAGLN er oppregulert i magekreft-assosiert fibroblaster
karsinom -associated fibroblaster (kafeer), motsvarende fibroblaster (CPFs) og normale fibroblaster (NFS) ble oppnådd fra primær vevkultur ved hjelp av vev fra kreftassosiert regioner, non-cancer-assosierte stroma og normal slimhinne, henholdsvis. Vi deretter bekreftet renheten av de forskjellige fibroblast populasjoner av immunfarging. Disse fibroblast populasjoner uttrykt høye levls av fibrinoblast markører som vimentin, α-SMA og fibronektin. På den annen side har disse celler ikke uttrykker epitelceller markører som cytokeratin (figur 1A). Disse data bekrefter renheten av fiborblasts. Disse observasjonene indikerer at kulturcellene var hovedsakelig fibroblaster ble fremstilt med minimal forurensning av andre celler. Figur 1 uttrykk for TAGLN er oppregulert i mage kreft-assosiert fibroblaster. A: karakterisering av mage fibroblaster (ICC). a1: vimentin, positive. a2: α-SMA, positive. a3: fibronectin, positive. a4: cytokeratin, negativ. Originale forstørrelser: × 200. Skala barer, 100 mikrometer. B: QRT-PCR analyse av TAGLN i CAF, CPF og NF. *, P
< 0,05, **, P
< 0,01, sammenlignet med NF. C: Western blot analyse av TAGLN i CAF, CPF og NF, ble TAGLN uttrykk nivå redusert suksessivt. D: fibroblaster vekstkurve ble bestemt av CCK-8-analysen, kafeer vokste quickier enn de andre. E: CAF hadde høyere evne til å forbedre MKN-45 migrasjon evne enn CPF og NF, ***, P
< 0.001 sammenlignet med MKN-45. F: CAF hadde høyere evne til å forbedre MKN-45 invasjon evne enn CPF og NF, *, P
< 0,05, **, P
< 0,01, sammenlignet med MKN-45.
MRNA og proteinnivåene av TAGLN var lavere i CPFs og NFS i forhold til kafeer (figur 1B og C). Vi viste først at kafeer vokste betydelig mer enn CPFs og NFS in vitro cellevekst (figur 1D). Deretter gjennomførte vi celle invasjon og migrasjon analyse for å teste om invasjonen og migrasjon evne mage kreftceller vil bli styrket av fibroblaster. Eksperimentet ble utformet for å undersøke effektene av stroma TAGLN, som ble utskilt av fibroblaster, på humane mage kreftceller. De interne nivåer av TAGLN i mage kreftceller kan forstyrre den eksperimentelle prosessen. Derfor vi choosed MKN-45 cellelinje, fordi TAGLN uttrykk nivå var den laveste på sju magekreftcellelinjer (SNU-en, AGS, NCI-N87, KATOIII, MKN-45, MKN-28 og SGC-7901; data ikke vist). Interessant, invasjonen og migrasjon evne MKN-45 økte i alle de tre gruppene (kafeer, CPFs og NFS), og økt mest i gruppen med CAF (figur 1E og F). Oppkjøpet av migrasjon og invasive atferd er en av trinnene i metastatisk prosess.
Kafeer fremme metastase gjennom upregulating TAGLN
å undersøke effekten av TAGLN i fibrobalsts, brukte vi RNAi å slå ned TAGLN uttrykk. Kafeer, CPFs og NFS ble transfektert med TAGLN spesifikk eller ikke-stillhet siRNA. RNA og protein ble oppnådd ved 24, 48 eller 72 timer etter transfeksjon, ble TAGLN mRNA og proteinnivåene undersøkt av QRT-PCR og Western blot. TAGLN mRNA og protein ble signifikant inhibert i celler behandlet med TAGLN spesifikke siRNA (figur 2A og B). Figur 2 kafeer forbedre tumor cellelinje MKN-45 migraton og invasjon gjennom oppregulert TAGLN. A: TAGLN uttrykk ved QRT-PCR-analyse etter siRNA knockdown i fibroblaster. B: TAGLN uttrykk ved Western blot analyse etter siRNA knockdown i fibroblaster. C: celle migrasjon assay in vitro (fibroblaster med eller uten TAGLN siRNA forstyrrelser). D: celle invasjon assay in vitro (fibroblaster med eller uten TAGLN siRNA forstyrrelser). Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra i det minste tre separate eksperimenter som hver ble utført i tre eksemplarer. *, P
< 0,05, **, P
< 0.01, ***, P
< 0,001, ved en-veis analyse av varians (ANOVA).
Vi neste undersøkt om invasjon og migrering evne av magecancerceller vil bli forbedret ved ekspresjon av TAGLN i fibroblaster, gjennomførte vi celle invasjon og migrering in vitro assay . De fibroblaster og MKN-45 var ikke-contactedly co-kultivert. Interessant, invasjonen og migrasjon evne MKN-45 sank umiddelbart i gruppen med kafeer og gikk noe ned i gruppen med CPFs og NFS. Resultatene viste at invasjonen og migrering evne MKN-45 kan reduseres ved å nedregulere ekspresjon av TAGLN (figur 2C og D).
For å vurdere bidraget fra kafeer-TAGLN til tumormetastaser in vivo, vi emplyed en xenograft modell. Vi blandet TAGLN siRNA kafeer, ikke-forstummet kafeer, CPFs og NFS med MKN-45 humane mage kreftceller i et 2: 1 forhold eller MKN-45 alene og vaksinert disse cellene gjennom halen intravenøs injeksjon i immunsvikt nakne mus. Etter 6 uker, MKN-45 blandet med kafeer generert mer lungemetastatiske knuter enn MKN-45 blandet med TAGLN siRNA kafeer, CPFs og NFS, som ligner på MKN-45 blandet med ikke-stillhet siRNA kafeer (tabell 1). Disse data antydet at kafeer viser en økt evne til å stimulere svulstmetastase (figur 3A og B). Alle observasjonene viste at i nærvær av kafeer, tumorer ble mer aggressiv, noe som tyder på at kafeer kan spille roller i å fremme metastase i magekreft. Figur 3 TAGLN forbedrer tumormetastase ved human tumor xenograft modell in vivo. A: naken mus metastatiske knuter i lungene. a1: lungemetastatiske knuter fra tomur bærende mus. Arrow: metastatisk nodule. A2: ingen metastatisk nodule i lungen. a3: H & E farging for lungemetastatisk nodule i sterkt felt mikroskop. Skala barer, 200 mikrometer. a4: H & E farging for lunge uten metastatisk nodule i sterkt felt mikroskop. Skala barer, 200 mikrometer. B: kvantifisering av naken mus lungemetastatiske knuter i ulike grupper gjennom halen intravenøs injeksjon. *, P
< 0,05, ved enveis variansanalyse (ANOVA).
Tabell 1 hårløse mus lungemetastatiske knuter i ulike grupper gjennom halen intravenøs injeksjon (Hver gruppe inneholdt seks mus)
grupper
TAGLN siRNA CAF -MKN45
ikke-taushet siRNA CAF-MKN45
CAF-MKN45
CPF-MKN45
NF-MKN45
MKN45 alene
Antall tumorbærende mus
2
5
5
3
2
2
Antall metastatiske knuter
2
10
9
5
3
2
TAGLN fremmer metastase ved oppregulering MMP-2
Mange studier har fokusert på rollen av matrix metalloproteinaser (MMP) til invasjonen av omkringliggende bindevev og metastase av tumorceller fra den primære lesjonen til fjerne områder i tumorprogresjon [20, 21]. I vårt tidligere arbeid, undersøkte vi MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 og MMP-9 nivåer etter TAGLN knock-down av siRNA gjennom ELISA, bare MMP-2 nivå var signifikant nedregulert, andre MMP nivåer viste ingen endring. Derfor, vi focued på MMP-2 i denne studien. Som figur 4A viste, mot MKN-45 co-coultured med CAF /neg og CAF /mock, MMP-2 nivåer i supernatant fra MKN-45 co-kultivert med CAF /siTAGLN ble betydelig dempet. Vi undersøkte neste aktiviteten til MMP-2 ved anvendelse av gelatin zymografi analysen. Vi fant MMP-2 aktivitet ble dramatisk hemmet i supernatant fra MKN-45 co-kultivert med CAF /siTAGLN enn med CAF /neg og CAF /mock (figur 4B). Dermed kan TAGLN forbedre metastase gjennom MMP-2 enzymer dårligere basalmembranene (f.eks. Kollagen IV). Figur 4 TAGLN forbedrer metastase av oppregulert MMP-2. A: MMP-2 uttrykk i CAF decresed åpenbart etter TAGLN RNAi av ELISA. *, P
< 0,05 ved en-veis analyse av varians (ANOVA). Feilstolper viser standardfeil rundt gjennomsnittet. B:. Knockdown TAGLN svekket evne CAF til hemmelig MMP-2 av gelatin zymografi
TAGLN uttrykk i menneskelig magekreft og sin tilknytning til differensiering i mage kreftpasienter
å evaluere TAGLN uttrykk i magekreft, TAGLN farging i 98 primærmagekreft vev ble undersøkt. TAGLN uttrykk ble oppregulert i human magekreft stroma i forhold til normal mage vev (Figur 5A: normal mage vev, figur 5B: magekreft vev). Korrelasjonen av TAGLN uttrykk med clinicopathological funksjonene ble vist i Tabell 2. TAGLN nivåene var høyere i udifferensierte svulster (dårlig differensierte adenokarsinomer, signet ring karsinomer og mucinkjertler karsinom) enn at differensierte de (vel og moderate adnocarcinomas) (P
= 0,003). Dessuten ble TAGLN nivåer korrelert med lymfeknutemetastaser (P
= 0,029). Det var ingen signifikante forskjeller i tumor TAGLN uttrykk i henhold til de andre clinicopathological funksjoner som kjønn, alder, tumorstørrelse, Lauren klassifisering, T scenen, avstand metastaser og TNM stadium (P
≥ 0,05). Figur 5 Expression of TAGLN i menneskelige mage kreft vev. A: TAGLN uttrykk nivå i normal mage vev ved IHC. Skala barer, 100 mikrometer. B: TAGLN er overuttrykt i stroma av menneskelig magekreft ved IHC. Skala barer, 100 mikrometer. C: TAGLN mRNA oppregulert i human magekreft analysert ved QRT-PCR. D: TAGLN protein er oppregulert i human magekreft analysert ved Western blot. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra i det minste tre separate eksperimenter som hver ble utført i tre eksemplarer. *, P
< 0.001 av paried prøver T
test.
Tabell 2 Clinicopathological sammenslutninger av TAGLN uttrykk i magekreft
Antall tilfeller
TAGLN farging
P

Svak (+)
Strong (++)
Kjønn
0,778
Mann fra 60
27
33
Kvinne
38
16
22
Age
0,739
≤60y
46
21
25
> 60y
52
22
30
Tumor størrelse
0,852
≤5 cm
58
25
33
> 5 cm
40
18
22
Differensiering
0,003
Vel + Moderat
46
13
33
Dårlig
52
30
22
Lauren klassifisering
0,059
Tarm
40
13
27
Diffuse
58
30
28
T scenen
0,142
T1 + T2
56
21
35
T3 + T4
42
22
20
lymfeknutemetastaser
0,029
N0
27
11
16
N1
32
15
17
N2
26
7
19
N3
13
10
3
Distant metastase
0,709
Uten
95
42
53
Med
3
1 2
TNM stadium
0,722
jeg
20
7
13
II
25
11
14
III
30
10
20
IV
23
15
8
også brukte vi QRT-PCR og Western blot for å behandle uttrykket av TAGLN i mage kreft vev (figur 5C og D). Disse resultatene antydet at TAGLN uttrykk i mage kreft vev var mye høyere i magekreft enn at i sammenkoblede normalt vev.
Diskusjon
Samler bevis viser at kreft initiering og progresjon involverer interaksjoner mellom både svulsten og stromale celler. Tumorceller kan aktivt rekruttere stromale celler, så som vaskulære celler, glatte muskelceller og fibroblaster, inn i tumoren, og dermed generere mikromiljøet til å fremme tumorvekst [16, 22, 23]. Fibroblaster utgjør ofte hoveddelen av stromale celler i et gastrisk karsinom, men de funksjonelle bidrag fra disse celler til tumordannelse og tumormetastase forblir dårlig forstått.
TAGLN er en av de tidligste markører for glatt muskulatur differensiering i løpet av embryogenesen [24], og tidligere studier knyttet til TAGLN hovedsakelig fokusert på glatte muskelceller [25]. Patologiske tilstander som ledsages av vev-omforming og fibrogenese, slik som sårheling og neoplastiske lesjoner er karakterisert ved utseendet av stromale celler med ultrastrukturelle egenskaper som ligger mellom de av typiske fibroblaster og de av glatte muskelceller. Disse fibroblaster vise fenotypiske og funksjonelle egenskaper av glatte muskelceller og dermed er oppkalt myofibroblasts [26], for eksempel kafeer. I vår studie ble TAGLN overekspresjon også observert i kafeer. Det er rapportert at TAGLN protein er overuttrykt i magekreft når proteinekspresjon spektrum av magekreft ble analysert ved bruk av to-dimensjonal gelelektroforese (2-DE) [27]. Videre er TAGLN proteinet en av de to tumorassosierte antigener som ble identifisert i serum hos nyre karsinom pasienter ved Klade anvendelse av 2-DE [28]. Disse rapportene er i samsvar med de funn som vi har observert ved hjelp av real-time PCR og Western Blot. Interessant nok har vi funnet at TAGLN var hovedsakelig påvist i fibroblaster avledet fra tumor stroma, snarere enn i tumorceller. Likeledes kan andre forskere oppdaget at TAGLN ikke blir uttrykt i ondartede celler, men i mesenchymale celler i tumoren stroma [27].
Stromale fibroblaster regulere endotelial eller epitelial celle oppførsel gjennom direkte og indirekte celle-cel1 interaksjoner. Aktivering av verts stroma1 mikromiljøet er antatt å være et kritisk trinn i tumorvekst og progresjon [13, 29]. Proteiner utskilt av stromal celle i tumorene kan positivt eller negativt påvirke tumorprogresjon. De mest fremtredende handlinger TAGLN kan favorisere svulst celle motilitet og invasjon [7, 30, 31]. Vi fant at TAGLN øker betydelig hos lymfeknutemetastase gruppen enn lymfeknute negative gruppe. For å c1arify rolle TAGLN i stromale fibroblaster i løpet av magekreft tumorigenesis og metastasering, forstummet vi TAGLN uttrykk i menneskelige kafeer. Det ble antydet at bare MKN-45 co-kultivert med kafeer uttrykker høyt nivå TAGLN utstilt mye høyere invasjon og migrasjon evne. Fibroblaster som TAGLN hadde blitt slått ned ikke vise denne funksjonen. Tatt sammen, foreslår vi at TAGLN kan være ansvarlig for styrking av magekreft celle metastase via stromale celler som kafeer.
TAGLN uttrykk er økt betydelig i mage kafeer. Kafeer med økt TAGLN uttrykk nivåer kan øke tumorcelle invasjon og migrasjon evne som fremmer en forbedret uttrykk for MMP-2. Stimulering av MMP-ekspresjon i fibroblaster, enten etter å ha direkte kontakt med tumorceller eller etter kontakt med tumorcelle-avledet løselige faktorer av tumorer med opprinnelse fra epitelceller har blitt vist i flere studier [32-35]. Avklare de underliggende mekanismene kan derfor dempe tumorresidiv og metastase i mage kreftpasienter.
Konklusjoner
Oppsummert vår studie viser at kafeer kan fremme magekreft celle migrasjon og invasjon via økt MMP-2 produksjon forårsaket av TAGLN oppregulering .
Metoder
Vevsprøver
totalt 40 par av kreft vev og tilsvarende normal slimhinne for QRT-PCR og Western blot og 98 primær mage kreft for farging ble samlet inn fra kirurgisk fjernet magekreft diagnostisert ved Institutt Kirurgisk klinikk, Ruijin sykehuset, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Normal slimhinne Prøver ble tatt fra margen på reseksjon hvor svulstene lokalisert i det minste over 6 cm avstand fra den. Denne studien protokollen ble godkjent av etisk komité for Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine. Den informert samtykke ble skrevet. Alle prøver ble hurtigfrosset i flytende nitrogen over natten og holdt ved -80 ° C før bruk. 4% formaldehyd-fiksert vev deler av både svulsten og slimhinnen ble farget med H & E og undersøkt og verifisert histopathologically av to patologer. Hver prøve ble tilskrevet en diagnose og scoret for Lauren klassifisering, differensiering, pTNM scenen. Tumor størrelse, beliggenhet og andre kliniske patologiske karakteristika ble innhentet fra kliniske poster med pasientens tillatelse
Cellelinjer
magekreft cellelinjer SNU-1 (ATCC: CRL-5971)., AGS (ATCC: CRL-1739), NCI-N87 (ATCC: CRL-5822) og KATOIII (ATCC: HTB-103) ble erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). En annen 3 mage kreft cellelinjer, MKN-45, MKN-28 og SGC-7901, ble bevart ved vårt institutt. Alle cellelinjer ble holdt i RPMI-1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS)
. Antistoffer
Primære antistoffer som brukes for farging inkludert human spesifikke anti-vimentin (Abcam, Cambridge, UK), anti-fibronektin ( Abcam, Cambridge, UK), anti-α-glatt-muskel aktin (Sigma Chemical, St Louis, MO, USA), anti-pan-cytokeratin (Abcam, Cambridge, UK), anti-SM22 (Abcam, Cambridge, UK) og mus anti-GAPDH (Kangchen, Kina).
Isolering av menneskelige mage fibroblaster
fibroblaster ble isolert fra kreft-og ikke-kreft-assosiert regioner i mage vev dissekert fra pasienter med magekreft i løpet av radikal mage reseksjon fra Institutt for kirurgi, Ruijin sykehuset, Shanghai Jiao Tong University School of medcine. Kreft-assosiert regioner ble valgt til å være minimalt nekrotiske områder av tumormassen. Ikke-kreft-assosiert stroma, som ble isolert fra vev på minst 2 cm distalt til ytterkanten av kreft masse. Normal slimhinne Prøver ble tatt fra margen på reseksjon hvor svulstene lokalisert i det minste over 6 cm avstand fra den. Vevene ble hakket til organoids på omtrent 1 mm 3 og utsådd på ubelagt plastmateriale i RPMI 1640 medium inneholdende humant basisk fibroblast-vekstfaktor, 20% føtalt kalveserum (FCS) og penicillin og streptomycin som antibiotika. Disse betingelser ga en homogen fibroblastisk cellepopulasjon etter 7 dagers dyrking. Hver fibroblast ble deretter utvidet til en 1: 3- av trypsin-EDTA i 10 cm petriskåler. Vi brukte fibroblaster passert for opptil 8 populasjonsdoblinger (PDS) for etterfølgende eksperimenter, for å minimere klonal seleksjon og kultur stress som kan oppstå ved langvarig vevskultur.
Immunohistokjemisk farging (IHC)
Celler eller vev ble løst i 30 minutter med 4% formalin og skylt med fosfatbufret saltvann (PBS). Etter endogen peroksidase-aktivitet ble stoppet med 0,3% H 2o 2, ble cellene blokkert med normal ikke-immune serum i 30 min før de ble inkubert med primært antistoff ved 37 ° C i 2 timer. Celler eller vev ble deretter merket med streptavidin-biotin-pepperrot-peroksidase farging kit (Dako, Carpinteria, CA, USA). Nærværet av merket peroksidase på seksjonene ble visualisert ved hjelp av inkubering med 3,3 '- diaminbenzidinperoksydase, DAB + substrat kromogen og delene ble motfarget med hematoksylin. Negative kontrollglass ble utført ved utelatelse av det primære antistoff.
TAGLN ekspresjon ble bestemt ved intensiteten av fargede celler, og bestemt i to kategorier (svakt positiv og sterkt positive). Den fargeintensitet ble klassifisert i henhold til fire karakterer (intensitetspoeng): ingen flekker (klasse 0), lys brune flekker (klasse 1), brune flekker (klasse 2), og mørk brun flekker (grad 3). Klasse 0 og klasse 1 ble definert som svak positiv, ble grad 2 og grad 3 defineres som sterk positiv.
Kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) etter produsentens anvisninger. cDNA ble oppnådd med en mikrogram RNA bruker Reverse Transcription System Kit (Promega, Madison, WI, USA) og QRT-PCR ble utført av SYBR Grønn PCR kjerne Reagens kit (Applied Biosystems, Warrington, UK). Primere som er spesifikke for TAGLN var som følger: 5 '- GAGCAAGCTGGTGAACAGCC-3 ' (øvre), 5 '- GACCATGGAGGGTGGGT TCT-3 ' (nedre). Glyceral-dehyde-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble anvendt som endogene referanse. Dens sekvenser var 5 '- GGACCTGACCTGCCGTCT AG-3 ' (øverst), 5 '- GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 ' (lavere). QRT-PCR for kvantifisering av mRNA-nivåene av TAGLN ble gjort på en ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Data ble analysert ved hjelp av sammenlignende Ct-metoden. Spesifisitet av resulterende PCR-produkter ble bekreftet ved smelting kurver.
Western blot
Cellene ble høstet og lysert med pattedyr-protein utvinning reagent (Pierce, Rockford, IL, USA). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt med en bicinchoninic syre (BCA) protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Prøver inneholdende 50 ug totalt protein ble applisert på hver kolonne av 12% akrylamid gel i en minigel apparatur (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). De separerte proteiner ble overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Etter å ha blitt inkubert med primært antistoff (1: 1000) og HRP-konjugert sekundært antistoff (1: 5000). Henholdsvis, ble immunkomplekser påvist ved den forbedrede kjemiluminescens (ECL) system (Millipore, Bedford, MA, USA)
Enzyme -koblet immunosorbent-assay (ELISA)
den proteinnivåer av MMP-2 i supernatantene ble målt ved hjelp av et ELISA-sett (R &D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) i henhold til produsentens instruksjoner
cellevekst. analysen
De forskjellige grupper av celler (1 x 10 3) ble utsådd i 96-brønners plater i triplikat. Antall levedyktige celler ble bestemt daglig ved bruk av celletelling Kit (CCK-8) ved å benytte en sterkt vannløselige tetrazoliumsalt WST-8 [2- (2-metoksy-4- nitrofenyl) -3- (4-nitrofenyl) 5- (2,4-disulfofenyl) -2H-tetrazolium, mononatriumsalt] (Dojindo, Japan). I korthet, ble 20 ul av CCK-8-løsning tilsatt til platene, ble absorbans ved 450 nm målt etter 4 timers inkubasjon.
Vurdering av tumorinvasjon og migrering
tumorinvasjon og migrering assay ble utført med QCMTM24-brønn invasjon kit (Millipore, Bedford, MA, USA) og QCMTM24-brønnen migrasjon kit (Millipore, Bedford, MA, USA) i henhold til protokollen gitt av produsenten, henholdsvis. Legg til en forberedt MKN-45 cellesuspensjon (2 x 10 5-celler /brønn) til det øvre kammeret og legge forhånds suspendert fibroblaster (5 x 10 4 celler /brønn i RPMI 1640 medium inneholdende 20% FBS) i det nedre kammer. Den TAGLN av noen fibroblaster i nedre kammer ble hemmet ved hjelp av siRNA 24 timer senere. MKN-45 og fibroblaster var co-kultivert ikke-contactedly i 48 timer, deretter lysised cellene og bestemt RFU verdier med en fluorescens plateleser bruker 480/520 nm filter sett.
TAGLN siRNA
Qiagen programmet ble brukt å designe RNAi sekvenser rettet mot menneskelig TAGLN (Tiltredelse ingen NM_003186.), og siRNA sekvensen med den høyeste antatte effekt (følelse: 5 '- AAAUCGAGAAGAAGUAUGAdtdt-3 ', anti: 5 '- UCAUAC UUCUUCUCGAUUUdtdt -3 ') ble syntetisert ved Shanghai GeneChem Co, Ltd siRNA med randomisert rekkefølge (følelse: 5 ' - UUCUCCGAACGUGUCACG Utt-3 ', anti: 5 ' - ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3 ') mot ingen genet (egge siRNA gruppe) ble tilført som intern kontroll. For forsøkene ble celler transfektert med DOTAP liposomal transfeksjon reagens (Roche, Tyskland). Celler ble sådd ut ved 2 x 10 5-celler /brønn på 6-brønners plater. Etter 24 timer når cellene var i den fasen av loggen vekst, 250 ul Opti-MEM jeg ble blandet med 5 mL av 20 mM siRNA duplex, mens en annen 250 mL Opti-MEM jeg ble separat inkubert med 11.88 ul DOTAP liposomer. De to blandingene ble forsiktig blandet og inkubert i omtrent 30 min ved romtemperatur. For transfeksjon, ble hele blandingen tilsatt til hver brønn i 1,5 ml friskt medium uten antibiotika. Den endelige transfektert konsentrasjon av siRNA var 20 nM. Celler ble oppsamlet for videre analyse ved 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon Gelatin zymografi.
Kultursupernatantene ble høstet ved 24 timer og blandes med en gel-prøvebuffer (0,5 M Tris-HCl, glycerol, 10% natriumdodecylsulfat [SDS], β-merkaptoetanol og 0,5% bromfenolblått). Ti mikrogram protein ble tatt av SDS-PAGE separasjon; SDS-PAGE-geler inneholdt 0,1% gelatin (Sigma Chemical, St Louis, MO, USA). Etter elektroforese, ble gelene vasket i 50 mM Tris-buffer inneholdende 2,5% Triton X-100. Gelene ble inkubert i ytterligere 24 timer inkubasjon i fluidet (50 mM Tris-buffer [pH 7.6], 10 mM CaCl 2, og 200 mM NaCl). Gelene ble beiset med 0,5% Coomassie blue, hvite bånd (72 kDa) på en blå bakgrunn indikert soner av fordøyelsen som tilsvarer nærværet av MMP-2.
Musemodell
BALB /c nu /nu
nakne mus, alder-matchet mellom 4-5 uker (Institute of Zoology Chinese Academy of Sciences), ble plassert på et bestemt patogen-fritt miljø i Animal Laboratory Unit, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Kina. Fibroblaster og MKN-45 ble blandet i forholdet 1: 4 i 0,1 ml PBS og injisert inn i den laterale halevenen. Seks mus ble inkludert i hver gruppe i alle forsøk, og hvert forsøk ble utført to ganger. Dyrene ble avlivet og lungemetastatiske knuter ble registrert 6 uker etter tumorcelle implantasjon. Tumorprøver ble samlet, blandet i formalin, innstøpt i parafin, og utsatt for H & E farging. P
< Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Samtidig forekomst av flere hjerneinfarkter grunn hypercoagulability assosiert med malignitet og meningeal karsinomatose som den første manifestasjon av magekreft
• Har mage Tonometri styrt behandling redusere total dødelighet hos kritisk syke pasienter?